Instrucciones para el envío de muestras de origen clínico para aislamiento de Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) en casos de diarrea o Síndrome Urémico Hemolítico (SUH)
COPROCULTIVO: Remitir el hisopo en medio de transporte (Stuart, Cary Blair o similar) MATERIA FECAL: Enviar aproximadamente 5 g en frasco estéril AISLAMIENTOS: Enviar repiques en agar blando o en tripticasa de soya SUERO: Enviar 500 µl de suero en tubo seco DATOS DEL PACIENTE: Enviar el Anexo I o II (notificación) según corresponda OBSERVACIONES: Las muestras deben ser enviadas según las Normas de Bioseguridad que corresponden al transporte de muestras clínicas.
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION SIM Manual o Automatizada
Materia fecal PCR (-) Test inmunocromatográfico Cultivo en SMAC (directo y después de enriquecimiento) Seroagrupamiento presuntivo
Tamizaje por PCR Múltiple stx1/stx2/rfbO157 Caracterización fenotípica y genotípica Tipificación RESULTADO
Hisopado rectal Siembra directa
Caldo CTS
Caldo CTS con cefixima 0,05 mg/l y telurito de potasio 2,5mg/l
..... .... Incubación a 37º por 6 hs
Agar SMAC
.. ...
Agar SMAC
....
Color Turquesa
CHROMAGAR Aislamiento y diferenciación directa de E.coli O157 por colonias coloreadas Interpretación •E.coli O157 – malva •Otras bacterias – Azul, transparentes o inhibidas
DETECCIÓN LPSO157 Test de Inmunocromatografía
Merck
-Dupont - Rapid Chek
- Reveal
DETECCION DE Stx Test de inmunocromatografía
RIDA QUICK Verotoxin O157 Combi (Bioart) Requerimientos Cultivo en caldo mTSB + Mitomicina C 18 h 37°C
Duopath Verotoxin (Merck) Requerimientos Cultivo en placa SMAC 18 h 37°C + polimixina B
Seroagrupamiento O157 • Fundamento: los anticuerpos anti-O157 aglutinan en presencia del antígeno O157 del LPS bacteriano. • Realizar test de aglutinación en SF para descartar autoaglutinación • Reacciones cruzadas con: Salmonella Urbana O:30; Yersinia enterocolitica O:9; Yersinia pseudotuberculosis O:IB; Citrobacter freundii; Escherichia hermanii; Haffnia spp. y Brucella abortus
PCR Multiplex stx stx11 / stx stx22 / rfbO157 rfbO157
346 bp 259 bp 130 bp
Leotta GA, Chinen I, Epszteyn S, Miliwebsky E, Melamed IC, Motter M, et al. Validación de una técnica de PCR multiple para la detección de Escherichia coli productor de toxina Shiga. Rev Argent Microbiol 2005; 37: 1-10.
Metodología para la detección y aislamiento de E. coli O157 Separación inmunomagnética
Metodología para la aislamiento de E. coli O157
Separación inmunomagnética
Escherichia coli productor de toxina Shiga Pruebas Bioquímicas
1
2
3
4
5
1.TSI: Pico ácido/fondo ácido con producción de gas, SH2 negativo 2.Utilización del Citrato: negativo 3.SIM: SH2 negativo, Indol: positivo, movilidad: positiva 4.LIA: decarboxilación de la lisina positiva, SH2: negativa 5.Fermentación de celobiosa: negativa
Esquema de diferenciación entre Escherichia coli y Escherichia hermanii Prueba
E. coli
E. hermanii
Fermentación de celobiosa - (2%)*
+ (97%)
Crecimiento en KCN
- (3%)
+ (94%)
Pigmento amarillo
- (0%)
+ (98%)
Lisina decarboxilasa
+ (90%)
- (6%)
Siembra del 1º pasaje
Siembra del segundo pasaje
Cepa Móvil Cepa no Móvil
Biotipificación de Escherichia coli O157:H7 Prueba
Biotipo
% (+) de otros Escherichia coli
A
B
C
D
ß-glucuronidasa
-
-
-
-
96
Sorbitol
-
-
-
-
95
Rafinosa
+
+
+
+
20
Dulcitol
-
+
+
-
50
Ramnosa
-
-
+
+
91
Actividad de β-glucuronidasa y Biotipificación de E. coli O157
STEC O157:H7 Biotipo C 1
2
3
4
5
1.Actividad β-glucuronidasa: negativa 2.Fermentación del sorbitol: negativa 3.Fermentación de rafinosa: positiva 4.Fermentación de dulcitol: positiva 5.Fermentación de ramnosa: positiva
Seroagrupamiento STEC nono-O157 Incubar colonias Stx positivas en un medio rico de cultivo Preparar y hervir suspensión bacteriana Realizar seroagrupamiento en placa con antisueros polivalentes y monovalentes como el anti: O26, O91, O103, O111, O113, O121, O145, O174 etc.
Técnicas diagnósticas utilizando cultivo celular • Detección de toxina Shiga libre en Materia Fecal (StxMF)
Estas técnicas son utilizadas en Laboratorios de Referencia
LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA CLINICA RESULTADO
POSITIVO
•Informar al médico •Realizar control de excreción y control de contactos familiares e Institucionales indicados por epidemiología •Enviar muestras del aislamiento, materia fecal y suero al LNR
NEGATIVO
•Informar al médico •Realizar control de contactos familiares indicados por epidemiología •Enviar muestras de materia fecal y suero al LNR
LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA CARACTERIZACION DE STEC
Tipificación: • Factores de virulencia: toxinas Stx, proteína intimina y enterohemolisina (PCR) • Biotipo • Serotipo • Antibiotipo Subtipificación: • PFGE • Genotipificación de variantes de Stx • Genotipificación de la proteína intimina • Fagotipificación cepas O157
LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA PARA SUH Y DIARREAS POR STEC
Patógenos estudiados
STEC O157 y no-O157
Tipificación y Subtipificación de cepas humanas, de animales y alimentos incorporada a la Vigilancia Epidemiológica Investigación de Brotes
