UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN FACULTAD DE BIOQUIMICA QUIMICA Y FARMACIA INSTITUTO DE ESTUDIOS VEGETALES “Dr. Antonio R. Sampietro” CATEDRA DE FITOQUÍMICA Ayacucho 461 – T. E. 0054 381 4107220 4000 San Miguel de Tucumán – República Argentina

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS DE LA ASIGNATURA FITOQUIMICA

2013

ASIGNATURA FITOQUIMICA Responsable de Cátedra Dra María Inés Isla

Plantel docente Alberto Maria Rosa Isla María Inés Jaime Gloria Martinez Arriazu Marta Nieva Moreno María Inés Ordoñez Roxana Sayago Jorge Sampietro Diego Sgariglia Melina Soberón Rodolfo Torres Sebastian Zampini Catiana

CÉLULA VEGETAL INTRODUCCIÓN Las células vegetales presentan una pared celular celulósica, rígida que evita cambios de forma y posición que las diferencian de las células animales; contienen plastidios, estructuras que sintetizan y almacenan alimentos siendo los más comunes los cloroplastos y casi todas las células vegetales poseen vacuolas, que tienen la función de transportar y almacenar nutrientes, agua y productos de desecho. La célula vegetal típica presenta, por fuera de la membrana plasmática, la pared celular, compuesta fundamentalmente por celulosa (polímero compuesto por moléculas de glucosa). Las moléculas de celulosa se unen en fibrillas, que constituyen el bastidor estructural de la pared. Muchas células vegetales forman una pared celular primaria mientras crece la célula, y otra secundaria formada en el interior de la primaria al final del crecimiento. Ambas paredes, primaria y secundaria son atravesadas por las vías de transporte de sustancia llamadas plasmodesmos. La pared celular encierra el contenido vivo de la célula, llamado protoplasto. Con el paso del tiempo esta pared puede sufrir una serie de cambios producto del metabolismo y el envejecimiento, manifestándose con deposiciones de diversas sustancias tales como lignina, grasas (suberina, cutina, ceras), taninos, etc., que pueden ser reconocidas mediante pruebas químicas. La pared celular delimita a la célula vegetal, determina su forma y confina al protoplasto. Este está formado por citoplasma, que a su vez contiene orgánulos, vacuolas y núcleo. Otra característica típica de la célula vegetal es la presencia de plastidios, los cuales pueden ser pigmentados (cloroplastos y cromoplastos) o no pigmentados (leucoplastos). La clorofila es el pigmento fundamental de los cloroplastos, mientras que los carotenos dan la coloración rojiza o anarajada de los cromoplastos; dentro de los plastidios no pigmentados se encuentran los elaioplastos, que almacenan grasas (lípidos) y los amiloplastos, que almacenan almidón; éstos últimos pueden tener formas diversas e incluso pueden tener valor taxonómico. También las paredes celulares estas compuestas por ligninas, que aumentan la rigidez, y las ceras que reducen la pérdida de agua. Las vacuolas, son muy importantes en la célula vegetal; su contenido acuoso se denomina jugo celular, y es variable de una célula a otra. El jugo vacuolar puede contener ácidos orgánicos tales como oxálico, málico, cítrico, algunas veces en forma de sales de diversos tipos. El oxalato de calcio puede precipitar en forma de estrellas (drusas) o en forma de agujas (rafidios) que constituyen sustancias ergásticas. Las vacuolas pueden contener también taninos, mucílagos, proteínas, aceites, pigmentos (antocianinas), etc., estos materiales pueden ser sustancias de reserva o residuos metabólicos.

En el caso de las plantas, la remoción de la pared celular es el primer paso, y crucial, requerido antes de la introducción del ADN directamente a través de la membrana plasmática. Los biólogos moleculares producen protoplastos cuando preparan para la transformación a diversos tipos vegetales. A continuación de la producción de protoplastos, la membrana celular puede hacerse permeable al ADN usando electroporación (mediante un campo eléctrico) o polietilenglicol. Los protoplastos fueron asimismo empleados (con un éxito mucho más limitado) para hacer fusión de

protoplastos, en la cual los protoplastos de distintas especies vegetales son tratadas de tal manera que ambas se fusionan, resultando en células híbridas de especies cruzadas. OBJETIVOS:  Obtener protoplastos a partir de diferentes órganos de diversas especies vegetales mediante degradación enzimática de los distintos componentes de la pared celular.  Evaluar el rendimiento de protoplastos viables.  Distinguir diferentes tipos de paredes celulares mediante técnicas histoquímicas.  Observar plastidos y sustancias ergásticas de muestras vegetales.

PROCEDIMIENTO A. Preparar 100 ml de una solución 0,5 M de sorbitol (solución isotónica). Llevar a pH de 6-7 con gotas de NaOH 0,1 N. B. Pesar 0,1 g de pectinasa (Macerozyme R-10 de Rizopus sp, Yakult, 400-800 U/g1) y 0,2 g de celulasa (Celulasa “Onozuka” RS, de Trichoderma viride, 2 U/mg)2. Colocar ambas enzimas en el mismo recipiente. C. Agregar 10 ml de la solución de sorbitol 0,5 M, pH 6-7 a la mezcla enzimática inmediatamente antes de usar ya que las enzimas son inestables y pierden actividad con la temperatura y el tiempo. Concentraciones finales de enzima: pectinasa 1% y celulasa 2%. D. Proseguir la técnica de acuerdo al Protocolo para la obtención de protoplastos que se detalla a continuación: 1) Lavarse las manos. Tomar el material vegetal (una o dos hojas, o bien láminas de raíces o tubérculos) de las especies de partida y enjuagarlas abundantemente con agua corriente y luego secarlas. Raspar ligeramente la cara abaxial de las hojas con aguja, bisturí u hoja de afeitar. Cortar las hojas o láminas en cuadrados de aproximadamente 1 cm de lado y ubicarlos en la tapa de una caja de Petri en cantidad suficiente para cubrirla. 2) Agregar 10 ml de la solución enzimática recientemente preparada en la caja de Petri y con la ayuda de pinzas, poner a flotar los fragmentos de la muestra en la superficie de la solución enzimática. En el caso de las hojas, ubicar la epidermis abaxial (inferior) en contacto con la solución digestiva. Los pedacitos del tejido vegetal pueden superponerse un poco. 3) Sellar la caja de Petri con parafilm o cinta y llevarla a estufa (37 ºC) mantener con agitación suave durante 30 minutos. 4) Preparar una muestra control con el material vegetal y 10 ml de sorbitol 0,5 M sin las enzimas. Unidades definidas como: una unidad libera 1.0 mol de ácido galacturónico a partir de ácido poligalacturónico por min a pH4.0 a 25ºC. 2 Unidades definidas como: una unidad libera 1.0 mol de glucosa a partidr de carboximetilcelulosa sódica por min a 40ºC, pH 4.5. 1

5) Realizar observaciones microscópicas de las muestras con y sin digestión enzimática: tomar un pequeño volumen de la suspensión de la caja de Petri y colocarla entre porta y cubreobjetos y buscar protoplastos en todos los campos microscópicos. 6) Para limpiar los protoplastos de restos celulares y de otras impurezas, una vez obtenidos filtrar el preparado por gasa y centrifugar a baja velocidad (500 – 1000 rpm). Descartar el sobrenadante y resuspender los protoplastos en 2 ml de sorbitol 0,5 M (sin enzimas). Repetir el lavado 2 veces y resuspender finalmente en 1 ml de la solución isotónica. E. Evaluar el rendimiento de protoplastos viables. A un pequeño volumen de la suspensión agregar gotas de solución acuosa de Rojo Neutro 0,1 %. El rojo neutro es útil para coloraciones vitales ya que es captado por las células (específicamente por los lisosomas y endosomas) y solo las células viables son capaces de retener el colorante. Luego de algunos minutos realizar un recuento de células viables y no-viables en cámara cuentaglóbulos y calcular el porcentaje. F. Realizar cortes a mano alzada del material en estudio y realizar una coloración diferencial para observar paredes celulares celulósicas y lignificadas con la coloración doble Safranina-Verde Rápido de la siguiente manera: 1) Tratar los cortes con hipoclorito de sodio al 50 % durante algunos minutos hasta clarificar y luego lavar 5-6 veces con agua destilada. 2) Pasar los cortes a alcohol 70 %. 3) Colorear con Safranina a saturación en alcohol 80 % durante 10 minutos. 4) Realizar un pasaje rápido por alcohol 96°. 5) Colorear con Verde Rápido a saturación en alcohol 100° (2 cambios). 6) Observar al microscopio las células que presentan distintos tipos de pared celular, drusas, rafidios, gránulos de almidón, cloroplastos, etc.

LECTINAS

El término lectina se aplica a proteínas o glicoproteínas de origen no inmune que reconocen de manera

específica carbohidratos, aglutinan células o

precipitan glicoconjugados. Las lectinas poseen por lo menos dos sitios de reconocimiento a carbohidratos, de ahí su capacidad para aglutinar células, aunque en la actualidad el término lectina se ha aplicado a proteínas con un solo sitio de reconocimiento a carbohidratos como es el caso de las selectinas. Las lectinas no poseen actividad enzimática y no son producto de una respuesta inmune. Las podemos definir entonces como proteínas o glicoproteínas que tienen la capacidad de unirse a carbohidratos, y poseen al menos un sitio no catalítico, que se une reversiblemente a un monosacárido u oligosacárido específico. Lo importante de destacar de esta definición son las dos características de la unión lectina- azúcar: la reversibilidad y la especificidad. Estas proteínas se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza y han sido identificadas en diversos organismos como virus, bacterias, hongos, plantas, así como en vertebrados superiores. Aunque varias de estas proteínas poseen especificidad por estructuras de azúcares semejantes, presentan actividades biológicas diversas como son: la aglutinación de glóbulos rojos (GR) de diferentes especies, la estimulación mitogénica de linfocitos y la inhibición de la fagocitosis. Debido a la capacidad de estas proteínas de interactuar con células de la respuesta inmune, algunas lectinas poseen efectos inmunosupresores, otras son tóxicas, inhiben el crecimiento de células tumorales y participan en la adhesión celular. Todas las funciones reportadas para las lectinas tienen en común el reconocimiento de un receptor oligosacarídico (1,2). Las lectinas vegetales pueden tener diferentes funciones: participan en la interacción entre las bacterias fijadoras de Nitrógeno con la raíz de las plantas de Phabaceas (Leguminosas), poseen actividad mitogénica, pueden tener efectos

protectores

en

contra

de

la

acción

patogénica

de

ciertos

microorganismos como es el caso de los nemátodos herbívoros. En diversas especies animales se han reportado evidencias de que las lectinas participan en fenómenos tales como el reconocimiento y la eliminación de

glicoproteínas del sistema circulatorio, así como de células envejecidas, células tumorales y microorganismos, mediante un proceso de opsonización y la participación de células con actividad fagocítica. Las lectinas también participan en procesos de reconocimiento que permiten la diferenciación celular, la organogénesis, la migración de linfocitos y como factores determinantes en la metástasis (3,4,5,6). Estructuralmente existen características comunes entre las lectinas de una familia determinada, lo que ha permitido el estudio de la interacción de la lectina- carbohidrato. Las lectinas vegetales suelen clasificarse de varias maneras, por ejemplo la especificidad hacia el monosacárido que inhibe su actividad hemoaglutinante y hacia las estructuras oligosacarídicas que reconocen, clasificándolas en : a) Lectinas que reconocen N-glicanos, que son oligosacáridos unidos a un residuo de asparagina en las proteínas mediante una N-acetil- glucosamina y b) Lectinas que reconocen a los O-glicanos que son oligosacáridos unidos a un residuo de serina o treonina en las proteínas mediante una N-acetilgalactosamina. También se clasificaba a las lectinas vegetales en base a la estructura en tres tipos de lectinas: a) Merolectinas: también llamadas hemilectinas o lectinas monovalentes. Son pequeñas proteínas que presentan un único sitio de unión a carbohidrato.

b) Hololectinas: o lectinas polivalentes. Presentan dos o más sitios de unión a carbohidatos que pueden ser idénticos u homólogos por lo que se unen a azúcares estructuralmente similares o idénticos.

c) Quimerolectinas: Son básicamente proteínas de fusión que tienen además de un sitio de unión al carbohidrato otro sitio que presenta actividad catalítica que actúa independiente al sitio de unión al carbohidrato.

Actualmente debido a la gran cantidad de datos cristalográficos de lectinas vegetales, se ha propuesto una nueva clasificación de las mismas en base a su estructura molecular (7), la cual tiende a reemplazar a la clasificación

basada en la especificidad y en la cual podemos distinguir seis familias de lectinas:

1. Lectinas aisladas de Fabaceas (Leguminosas). Es la familia de lectinas vegetales más estudiada. Generalmente se encuentran constituidas por dos a cuatro subunidades idénticas de 25 a 30 kDa; cada una de las subunidades tiene un sitio de unión para iones metálicos Ca++, Mn++ y Mg++. Una subunidad posee aproximadamente 250 aminoácidos y presenta una gran homología con las otras subunidades. Está constituida por doce hojas β antiparalelas conectadas entre si mediante bucles, lo que genera una estructura aplanada en forma de domo, cuatro bucles localizados en la parte superior del monómero forman el sitio de reconocimiento a carbohidrato (7). 2. Lectinas con dominios tipo heveína o específicas de quitina. Los miembros de esta familia generalmente presentan dos subunidades idénticas,

ricas

en

cisteína

contrariamente

a

las

lectinas

de

Leguminosas. Una subunidad está constituida por cuatro dominios tipo heveína, conteniendo cuatro puentes disulfuro, lo cual origina que no existan estructuras secundarias regulares a excepción de una pequeña α-hélice de cinco residuos; cada dominio presenta un sitio de reconocimiento a carbohidrato, que no necesita la presencia de iones metálicos. 3. Lectinas específicas de manosa aisladas de Monocotiledóneas. A este grupo de lectinas pertenecen las de orquídeas, ajo y amarilis, con secuencias de aminoácidos altamente conservadas. Estas lectinas son tetraméricas, cada monómero tiene un peso molecular dr 12 kDa, así como una secuencia de 36 aminoácidos repetidas tres veces. El sitio de reconocimiento a carbohidrato está constituido por cuatro hojas β antiparalelas unidas entre sí por giros. El conjunto se asocia de manera que forma una corona aplanada, dejando aparecer un gran túnel central (7). 4. Lectinas en forma de prisma β o del tipo jacalina. En este grupo se encuentran

lectinas

vegetales

que

presentan

estructuras

tridimensionales muy similares a la de Artocarpus integrifolia (jacalina).

Lectinas tetraméricas glicosiladas, donde cada subunidad contiene una cadena pesada α y una cadena ligera β antiparalelas arregladas a manera de un prisma triangular (7). 5. Lectinas relacionadas con proteínas inactivadoras de la síntesis proteica. Estas proteínas forman parte de los venenos mas tóxicos. Su estructura molecular es compleja. Están constituidas por dos cadenas, la A y la B, las cuales son diferentes y se encuentran unidas por dos puentes disulfuro. La cadena A es la responsable de la toxicidad (actividad de Nglicosidasa sobre el ribosoma que inactiva la traducción), mientras que la cadena B, posee la actividad de lectina. La cadena B está constituida por dos dominios que presentan cuatro subunidades, las cuales contienen α -hélices y hojas β (7). 6. Lectinas tipo amaranto. Dentro de este grupo encontramos lectinas de distintas especies de amarantos entre las que se destacan Amaranthus caudatus y Amaranthus leucocarpus. Cada proteína se encuentra formada por dos monómeros en los que existen dos dominios N y C ,unidos por una pequeña hélice 3 10 , cada dominio muestra una conformación de trébol β semejante a la conformación observada en la cadena B de la lectina de Ricinus communis (7). AGLUTINACIÓN E INHIBICIÓN DE LA AGLUTINACIÓN

Cuando las lectinas polivalentes se ponen en contacto con un gran número de células, como por ejemplo glóbulos rojos, linfocitos o fibroblastos, provocan su aglutinación o agrupación. Esto se debe a que cada molécula de la lectina puede unirse a los azúcares presentes en la superficie de células distintas provocando así su acercamiento. En el caso que las células sean glóbulos rojos ésto se traduce microscópicamente en la formación de glóbulos rojos aglutinados. Si a la lectina se le adiciona una cantidad suficiente del azúcar libre y éste es reconocido específicamente, al agregar los glóbulos rojos no se observará aglutinación, reacción que se conoce como inhibición de la hemoaglutinación.

ROL FISIOLÓGICO DE LAS LECTINAS

Hay dos hipótesis que intentan explicar el rol que juegan las lectinas en las plantas:  Como mediadores en el reconocimiento de moléculas involucradas en la relación simbiótica entre legumbres y bacterias fijadoras de N2 . La relación entre bacterias del género Rhizobium y las Leguminosas es altamente específico y las lectinas juegan un papel crucial en esta relación simbiótica. Son responsables de una interacción específica bacteria-especie vegetal. Así por ejemplo se ha encontrado

que la

lectina de la soja se une solo con especies de Rhizobium que nodulan con soja y no con otras bacterias que realizan simbiosis con otras legumbres.  Como mecanismo de defensa contra insectos y microorganismos patógenos interactuando con glicoconjugados presentes en estos organismos. Por ej. Las lectinas que se unen a quitina, reconocen un carbohidrato que es un constituyente de la pared celular de los hongos y del exoesqueleto de los invertebrados. Un ejemplo concreto de lectinas que actúan en el mecanismo de defensa de las plantas son las Rips de tipo II. Estas Rips son capaces de inhibir la síntesis proteica actuando en forma irreversible, por lo que detienen la actividad de los ribosomas principalmente en células eucarióticas. La cadena B se une al receptor de la superficie celular ( un glicoconjugado) provocando así la entrada de la cadena A. Dentro de la célula la cadena A inactiva catalíticamente los ribosomas eucarióticos mediante la ruptura de la unión N–glicosidasa de un residuo de adenosina del rRNA , es decir que actúan anulando la capacidad de los ribosomas de interactuar con los factores de elongación, lo que detiene en forma irreversible la elongación del péptido naciente. La acción molecular de las Rips involucra la subunidad mayor del rRNA. Los ribosomas bacterianos son insensibles a las Rips de tipo II, además la presencia de la pared celular en las bacterias impide la interacción de las lectinas con los glicoconjugados de su membrana y también impide la entrada de estas proteínas al citoplasma. De modo que el papel de las lectinas en la defensa de la planta contra agentes bacterianos sería a través de un

mecanismo indirecto basado en interacciones con los carbohidratos de la pared celular. En cuanto al papel de las lectinas en la defensa contra insectos se han propuesto tres mecanismos posibles: 1. la unión de las lectinas específicas para quitina a la quitina del exoesqueleto de los insectos 2. La unión de las lectinas (de los vegetales que constituyen la dieta del invertebrado) a los glicoconjugados expuestos de las células epiteliales del tracto digestivo del mismo con el consiguiente deterioro local o sistémico. 3. La unión de las lectinas a las enzimas glicosiladas. OTRAS APLICACIONES DE LAS LECTINAS

Debido a la única propiedad de ser específico para la unión de azúcares y glicoconjugados las lectinas tienen una amplia aplicación en investigación y en laboratorios médicos. Ya sea en solución o en forma inmovilizada, provee un gran uso en la detección o identificación de diversos glicoconjugados. La identificación de grupo sanguíneo, receptores de membrana y la detección de células malignas son algunos de los ejemplos de las aplicaciones de las lectinas. Las lectinas inmovilizadas en particular, permiten el aislamiento de grandes cantidades de glicoconjugados específicos de extractos biológicamente complejos. Una de las aplicaciones más importantes en investigaciones médicas es que las lectinas pueden ser usadas para prevenir el rechazo de injerto de médula de hueso. También las lectinas de soja pueden usarse para remover las células T responsables del rechazo a implantes. Este proceso ha sido probado satisfactoriamente en deficiencias inmunológicas en niños. Recientemente se ha demostrado la capacidad de la lectina de poroto para inhibir el crecimiento de tumores.

PARTE PRÁCTICA 1- OBJETIVO  Extraer y purificar parcialmente la lectina que se encuentra en las semillas de Lens culinaris (lenteja)  Detectar su presencia mediante reacciones de hemoaglutinación.  Determinar la especificidad de azúcares de la lectina utilizando la reacción de inhibición de hemoaglutinación. 2- PREPARACIÓN DEL EXTRACTO LECTINICO

Se utiliza el método de Tichá y col. Que se describe a continuación. - Las semillas de lenteja (25 grs) se dejan en remojo con agua toda la noche en heladera. - A continuación se elimina el exceso de líquido y se homogeneizan las semillas en 50 ml de buffer fosfato de sodio 10 mM, pH 7 con NaCl 0,1 M (PBS) en licuadora durante 3 minutos. - Se filtra por gasa doble. - El filtrado obtenido se centrífuga a 10.000 rpm durante 10 minutos en centrífuga refrigerada. - El sobrenadante se somete a una precipitación con sulfato de amonio sólido (previamente pulverizado en mortero) hasta un 50 % de saturación (35,30 gr de (NH4)SO4 sólido/100 ml de solución) . Con este procedimiento se logra precipitar las proteínas del extracto. Esto se debe a que el sulfato de amonio extrae el agua de solvatación de las proteínas, las mismas se vuelven inestables y precipitan. La operación se realiza en frío agregando la sal de a poco, con agitación suave. - Se centrífuga a 10.000 rpm durante 10 minutos. - El precipitado se resuspende en un pequeño volumen de NaCl 0,9% (solución que es isotónica con respecto a los GR). - Se coloca en un tubo de diálisis previamente hidratado y se dializa 2 horas contra NaCl 0,9 % a 4 ºC. -

El extracto dializado se centrífuga nuevamente a 10.000 rpm durante 10 minutos.

-Purificación de la lectina de Lens culinaris por cromatografía de afinidad.

- El sobrenadante límpido se siembra en una columna de Sephadex G– 150 preequilibrada con NaCl 0,9% (de 2 x 17 cm). Se produce una adsorción específica de la lectina a la matriz de dextrano que constituye el Sephadex. A continuación se lava la columna con NaCl 0,9 % para eliminar las proteínas no adsorbidas y luego se eluye la lectina de la columna con una solución de glucosa 0,1M en PBS. Se realiza un pool con las fracciones eluídas que presentan mayor actividad hemoaglutinante. Por razones de tiempo se trabajará en el práctico con la fracción obtenida luego de la diálisis, la cual contiene la lectina parcialmente purificada. 3-TITULACIÓN DEL EXTRACTO Se determinará la capacidad hemoaglutinante de la lectina utilizando glóbulos rojos humanos de cualquier grupo sanguíneo. Lavado de los glóbulos rojos: A 0,5 ml de sangre recogida con anticoagulante se le agrega 4,5 ml de solución de NaCl 0,9 %; se homogeneiza con cuidado, invirtiendo lentamente el tubo y se centrífuga a 2000 rpm . Se elimina el sobrenadante con pipeta Pasteur tratando de no resuspender los glóbulos rojos. Esta operación de lavado se repite hasta obtener un sobrenadante límpido (por lo general 3 lavados). Finalmente se resuspenden las glóbulos con 4,5 ml de NaCl al 0,9 % con lo cual se obtiene una solución al 4 %. Los cálculos se realizan teniendo en cuenta análisis hematológicos (hematocrito) realizados previamente a la sangre a utilizar que indican que:

100 ml de sangre --------------------40 ml de GR 0,5 ml de sangre -------------------X = 0,2 ml de GR

4 ml de GR-------------------- 100 ml de sangre 0,2 ml de GR-----------------X= 5 ml

En una serie de 8 tubos colocar 0,1 ml de NaCl 0,9 % en cada uno. Agregar al primero 0,1 ml de extracto lectínico. Agitar. Pasar 0,1 ml al segundo tubo,

agitar, tomar 0,1 ml agregar al tercero y así seguir hasta el último del cual se toma 0,1 ml y se descarta. Se agrega 0,1 ml de PBS y 0,05 ml de la solución de GR al 4 %.

0,1 ml de NaCl 0,9 % a cada uno de los tubos 0,1ml de extracto al 1º tubo

Exttacto diluido 1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

En otro tubo se coloca 0,1 ml de GR% 0,1 ml de extracto

Control de extracto sin diluir

Se deja a temperatura ambiente durante 30 minutos y se observa si hay aglutinación. El Título está dado por la inversa de la máxima dilución del extracto que presenta hemoaglutinación. Se define como Unidad Hemoaglutinante (UHA) a la mínima cantidad de lectina capaz de producir aglutinación observable a simple vista.

4-ESPECIFICIDAD DE AZUCARES

Con diluciones del extracto que contengan 2 UHA observar el efecto de glucosa, galactosa, fructosa y manosa (0,2 M) sobre la hemoaglutinación. Se colocan 0,1 ml del extracto, 0,1 ml de la solución de azúcar 0,2M y 0,05 ml de suspensión de GR al 4%.

Se debe realizar un control del extracto sin azúcar. Dejar 30 minutos a temperatura ambiente y observar si hay hemoaglutinación. Deducir la especificidad de azúcar de la lectina en estudio. 

Preparar un informe escrito que contenga los resultados e interpretación del trabajo realizado.

Referencias

1.Mikami B, Degano M, Hebre E J,y Sacchetini J C (1994). A crystal structureof soybean β-amilase reacted with β-maltose and maltal: Active site components and their apparent roles in catalysis. Biochemistry 33:7779-7787.

2.Cygler , Rose D R,y Bundle D R (1991). Recognition of a cell- surface oligosaccharide of pathogenic Salmonella by an antibody Fab Fragment. Science 253: 442- 445.

3.Merrit E A, Sarfaty S, Vander Akker F, L´Hoir C, Martial J A, Y Hol W G J.(1994). Crystal structure of cholera toxin β pentamer bound to receptor GM1 pentasaccharide. Protein Science 3: 166-175.

4. Sharon N (1984). Surface carbohydrates and surface lectin are recognition determinants in phagocytosis. Immunol Today 5: 1-5.

5. Barondes S H,(1981). Lectins: Their multiple endogenous celular functions. Ann. Rev Biochem 50: 207-231.

6. Gallily R, Vray B, Stain Y y N Sharon(1984). Wheat germ agglutinin potentiate uptake of bacteria by murine peritoneal macrophages. Inmunology 52: 679-686.

7. Mákela O,(1957). Studies on hemmagglutinins of leguminoseae seeds. Ann. Med. Exp. Fenn supl 11:1-156

POLISACÁRIDOS DE ORIGEN VEGETAL Y DE APLICACIÓN FARMACÉUTICA

INTRODUCCIÓN Los hidratos de carbono o glúcidos, junto con los lípidos y las proteínas, constituyen los compuestos biológicos más importantes de las células, donde cumplen funciones esenciales. Intervienen en la ganancia de energía y forman el material de partida para la síntesis de sustancias orgánicas vegetales y animales.

CLASIFICACIÓN

Estos compuestos pueden clasificarse en: a) Monosacáridos: también llamados monosas, son las unidades más simples entre los glúcidos. Poseen entre 3 y 9 átomos de carbono y no son hidrolizados por acción de ácidos. Generalmente se encuentran como ésteres fosfóricos y suelen estar combinados entre sí o con otras sustancias. Al estado libre sólo se encuentran en pequeña proporción. b) Oligosacáridos: son azúcares formados por 2 o más monosas (hasta 10) unidas covalentemente. Están muy difundidos en la naturaleza y por hidrólisis ácida o enzimática originan los monosacáridos que los constituyen. c) Polisacáridos: son polímeros de 10 o más unidades de monosas, cuyos grados de polimerización pueden llegar a varios miles, alcanzando así elevados pesos moleculares. En la naturaleza la mayoría de los hidratos de carbono se encuentra en forma de polímeros, los cuales generalmente cumplen funciones estructurales o de reserva energética. Las monosas que forman el polisacárido se unen por enlaces glicosídicos  o  en forma lineal o ramificada, y pueden ser iguales (en los homopolisacáridos) o distintas (en los heteropolisacáridos). En cuanto a la nomenclatura de los polisacáridos, aunque algunos son designados por nombres convencionales (almidón, celulosa, glucógeno),

generalmente se los designa con el nombre del monosacárido que los forma más el sufijo “an” o “ano” (xilano, galactano, fructano, etc.).

IMPORTANCIA Y USOS

Desde hace algunos años, los carbohidratos son considerados importantes componentes de mezclas dietéticas, que generalmente consisten en productos de origen vegetal resistentes a la digestión, como gomas, mucílagos, pectinas y celulosa. Se considera que estos compuestos derivan de la condensación de pentosas (pentosanos: (C 5H8O4)n) o de hexosas (hexosanos: (C6H10O6)n), o de una combinación de ambos. Gomas y mucílagos se diferencian en su comportamiento frente al agua, mientras las primeras se disuelven completamente, los últimos no lo hacen y forman masas viscosas en dicho solvente. En los mucílagos predominan xilosa, arabinosa y ácidos urónicos, como por ejemplo los de corteza de olmo y los de semillas de lino, que contienen gran cantidad de ácido galacturónico. Algunos ejemplos de especies que contienen mucílagos se muestran en la siguiente tabla:

Nombre Vulgar

Parte/s usada/s

Contenido de

Preparaciones

mucílagos (%) Llantén mayor

Sumidades aéreas

6,5

Infusión

Ispagul

Semillas

10-30

Decocción

Zaragatona

Semillas

12-15

Decocción

Lino

Semillas

10

Decocción

Malva

Flores y hojas

15-20

Infusión

Malvavisco

Raíz

5-30

Decocción

Varias especies del género Plantago, conocidas vulgarmente como “llantén”, contienen mucílagos en la epidermis de la testa seminal. Las semillas maduras y secas de P. psyllum y P. arenaria se conocen en el comercio como

plantago español y plantago francés, respectivamente, mientras que las de P. ovata, como ispagul o plantago indio. Por sus propiedades físico-químicas, los mucílagos representan un grupo de polisacáridos de gran aplicación en al industria farmacéutica. Se usan como espesantes o viscosantes en la preparación de ciertas formas farmacéuticas, como comprimidos y cápsulas. Además, se emplean en el tratamiento de la constipación, patología caracterizada por una alteración funcional del tracto gastrointestinal, con localización preferencial en el intestino grueso. Los mucílagos actúan como laxantes mecánicos no irritantes, ya que al absorber agua, aumentan su volumen en relación a su masa y estimulan así el peristaltismo y con ello, el reflejo defecatorio. Por lo general se indican en personas con estreñimiento crónico sin otra patología. Se administran en forma de cápsulas, polvos o tisanas y generalmente se emplean las semillas enteras, no trituradas, para evitar la absorción de lineína y de heterósidos cianogenéticos (sustancias tóxicas).

Entre las Malváceas son frecuentes las especies con un importante contenido de estos compuestos. Por ejemplo, Althea officinalis, es usada por sus propiedades demulcentes, emolientes, diuréticas, anti-inflamatorias y expectorantes. Sus raíces (infusión) son usadas para afecciones del tracto digestivo, como estomatitis, gastritis, úlcera péptica, colitis, etc., mientras que sus hojas se usan para los sistemas urinario (cistitis, uretritis y cálculos urinarios) y pulmonar (bronquitis, catarros). También tienen aplicación externa como ungüentos para abscesos y úlceras. Los principios activos de A. officinalis son: en la raíz, mucílago, 18-35 % consistente en diversos polisacáridos, uno compuesto por L-rammnosa, D-galactosa, ácidos Dgalacturónico y D-glucurónico, en relación 3:2:3:3; otro, un L-arabinofuranano con elevado grado de ramificación; también existe una unidad estructural formada por un trisacárido y otra con una elevada proporción de ácidos urónicos. Además posee un 35 % de pectinas, 1-2 % de asparagina y taninos; mientras que las hojas poseen mucílago y un D-glucano de bajo peso molecular. También se encuentran flavonoides y polifenoles.

PARTE PRÁCTICA 1. OBJETIVOS:  Obtener polisacáridos a partir de una muestra de herboristería (Malva).  Hidrolizar el compuesto obtenido.  Identificar

los

azúcares

resultantes

de

la

hidrólisis

mediante

cromatografía en papel.

2. OBTENCIÓN DEL POLISACÁRIDO. La extracción se hará en medio acuoso y en caliente a partir de material fresco, seco o de muestra de herboristería. Técnica: pesar 5 gramos de la muestra y agregar 50 ml de agua destilada. Calentar y mantener en ebullición durante 5 minutos. Filtrar por gasa doble, medir el volumen y agregar dos partes de etanol 96º al filtrado. Dejar reposar durante 10 a 15 minutos en frío (baño de hielo o heladera) y centrifugar en centrífuga clínica durante 15 minutos; eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado de polisacáridos en un pequeño volumen de agua destilada ( 810 ml) y centrifugar durante 15 minutos para luego recuperar el sobrenadante donde se encuentran disueltos los polisacáridos. 3. HIDRÓLISIS DE ENLACES GLICOSÍDICOS. Los iones hidrógeno (H3O)+ en concentraciones adecuadas pueden hidrolizar los enlaces glicosídicos de los polisacáridos y liberar hidratos de carbono de menor peso molecular: oligosacáridos o monosacáridos. Técnica: tomar 2 ml del extracto y agregar 2 ml de H 2SO4 2 N, colocar en tubo con tapa y mantener en BM a 100 ºC durante 20 minutos. Centrifugar durante 10 minutos, tomar 2 ml del sobrenadante y neutralizar con CaCO 3 sólido (para calcular la cantidad necesaria, considerar que el PM del CaCO 3 es 100,1 g). Centrifugar en centrífuga clínica durante 10 minutos y reservar el sobrenadante para dosar e identificar los azúcares liberados.

4.IDENTIFICACIÓN

DE

AZÚCARES

MEDIANTE

CROMATOGRÁFICO. Se emplea una cromatografía descendente en papel.

ANÁLISIS

Soluciones estándar: galactosa, ramnosa, glucosa, ácido galacturónico y ácido glucurónico, todos en u Solvente de corrida: Butanol- piridina-agua (6:4:3). Reactivos de revelado (técnica de Trevelyan y col.): 1- Solución acuosa de AgNO3 al 40 % (solución madre). De esta solución tomar 1 ml

y llevar a 40 ml con acetona (reactivo de

trabajo). 2- Solución acuosa de NaOH 10 N. De esta solución tomar 50 ml y llevar a 1000 ml con etanol de 96º (NaOH 0,5 N en alcohol). 3- Solución de tiosulfato de sodio, 25 g/litro. Técnica de siembra y corrida: En un trozo

de papel Whatman Nº 4 de

aproximadamente 12 cm de ancho marcar la línea de siembra a 9-10 cm del borde. En el extremo opuesto cortar el papel en forma de picos para facilitar el escurrimiento del solvente. Sembrar alícuotas (siembras puntuales) de las muestras y de las soluciones testigo, teniendo en cuenta que la sensibilidad del

madera saturada con el sistema de solventes elegido y dejar correr durante1220 horas. Técnica de revelado: impregnar el papel por la solución de AgNO3-acetona, tratando de que el cromatograma se impregne con la solución de plata de forma pareja, y secar. Realizar un pasaje por la solución alcohólica de NaOH 0,5 N. Si algunas manchas no aparecieran calentar el papel impregnado en la solución alcalina con vapor de agua. Cuando las manchas son lo suficientemente visibles, fijarlas mediante un pasaje por la solución de tiosulfato de sodio y lavar con abundante agua destilada. La sensibilidad del método es de 2- 20 A fin de conocer el rendimiento de la extracción (gramos de polisacárido/gramo de tejido) y determinar la cantidad de extracto que se debe sembrar en los cromatogramas (microlitros) será necesario conocer el contenido de azúcares totales y de azúcares reductores de las muestras. El dosaje de azúcares neutros totales se realiza por el Método del

Fenol-Acido

Sulfúrico y para los azúcares reductores se empleará el Método de SomogyiNelson

5. MÉTODO DEL FENOL- H2SO4 (AZÚCARES NEUTROS TOTALES) Fundamento: los ácidos fuertes en caliente deshidratan las monosas, formando furfural en el caso de las pentosas e hidroximetilfurfural, con las hexosas. Estos derivados reaccionan con el fenol dando compuestos de color amarillo-naranja que absorben a 490 nm. Reactivos: a) Fenol destilado, al 80 % (P/V) b) Acido sulfúrico concentrado. c) Glucosa 1 mM, como solución estándar. Técnica: Cargar tubos con cantidades crecientes de la solución de glucosa, entre 0,05 y 0,30 µmoles para realizar la curva estándar y diluciones de las muestras problema centrifugadas. Completar con agua destilada hasta 0,8 ml y agregar en el fondo de los tubos 0,04 ml de fenol 80 %, tratando de no resuspender la gotita de fenol formada. Luego, cuidadosamente agregar 2ml de H2SO4

concentrado

usando

una

pipeta

de

escurrimiento

rápido

e

inmediatamente mezclar en vortex. Llevar a BM hirviente por 20 minutos. Enfriar y leer a 490 nm. Procesar simultáneamente un Blanco de Reactivos. Graficar Densidad óptica (DO) en función de µmoles de glucosa y determinar la concentración de azúcares neutros totales de las muestras problema. Sensibilidad del Método: hasta 0,3 µmoles de glucosa. Advertencia: Tanto el reactivo de fenol al 80 % como el ácido sulfúrico concentrado

son

reactivos

muy

cáusticos

que

producen

serias

quemaduras. Por lo tanto evitar el contacto con piel, mucosas y ropa. Ante accidentes lavar con abundante agua corriente.

6. MÉTODO SOMOGYI-NELSON (AZÚCARES REDUCTORES) Fundamento: los azúcares con un grupo aldehído o cetona libre son capaces de reducir los iones Cu++ del Reactivo. alcalino de Somogyi, en iones Cu +, que al reaccionar con el ácido arseno-molíbdico del Reactivo de Nelson producen compuestos coloreados que se leen fotocolorimétricamente a 520 nm. Reactivos: a) Reactivo cúprico de Somogyi. Se prepara mezclando 1 volumen de la solución A con 9 volúmenes de la solución B: Solución A: CuSO4.5 H2O al 10 %. Solución B: Disolver 28 g. de Na2HPO4 anhidro en 700 ml de agua destilada. Agregar 40 g

de Tartrato de Sodio y Potasio. 4 H2O. Cuando la disolución es completa agregar 100 ml de NaOH 1N y 120 g de Na2SO4 anhidro. Llevar a 900 ml con agua destilada y dejar en reposo durante 48 horas, filtrar y guardar en frasco color caramelo. b) Reactivo de Nelson. Disolver 25 gramos de Molibdato de Amonio. 4 H 2O en 450 ml de agua destilada, añadir 21 ml de H 2SO4 concentrado. Luego de mezclar con cuidado (reacción exotérmica) y agregar 3 g de Arseniato disódico. 7 H2O. Dejar en reposo durante 48 horas a temperatura ambiente, filtrar y guardar en frasco color caramelo. c) Glucosa 1 mM, como solución estándar. Técnica: Cargar tubos con cantidades crecientes de la solución de glucosa, entre 0,05 y 0,30 muestras problema centrifugadas. Completar con agua destilada hasta 0,5 ml, agregar 0,5 ml del Reactivo de Somogyi y calentar en BM hirviente durante 15 minutos. Enfriar, agregar 0,5 ml del Reactivo de Nelson y 1 ml de agua destilada. Mezclar y leer a 520 nm. Procesar simultáneamente un Blanco de

concentración de azúcares reductores de las muestras problema. Sensibilidad del Método: 0,05-

METABOLITOS SECUNDARIOS DE PLANTAS MEDICINALES

INTRODUCCION Tanto en animales como en vegetales, la energía para los procesos vitales proviene de una cadena de reacciones de oxidaciones y reducciones (METABOLISMO) en las que las sustancias producidas (METABOLITOS) son útiles para el crecimiento o reproducción del organismo que lo sintetiza. En las plantas se puede distinguir dos tipos de metabolismo: a- Metabolismo primario b- Metabolismo secundario

El metabolismo primario comprende los procesos que conducen a la biosíntesis y degradación de metabolitos primarios: hidratos de carbono, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Una característica de este metabolismo es su similitud en todos los organismos aún entre aquellos que genéticamente se encuentran muy distantes. En conclusión, estos metabolitos son: a) esenciales o indispensables para el crecimiento y desarrollo del individuo, b) uniformes, c) universales d) conservativos. Podemos definir al metabolismo secundario como el nivel funcional del metabolismo de la planta que no es indispensable para el desarrollo y crecimiento de las especies pero si lo es para su supervivencia. A partir del metabolismo secundario se biosintetizan los llamados metabolitos secundarios los que fueron considerados durante muchos años productos de desecho resultantes de la degradación metabólica o formado por subproductos del metabolismo vegetal. El rasgo característico de los metabolitos secundarios es su gran diversidad estructural y la alta variabilidad intraespecífica. Unas 150.000 estructuras químicas han sido aisladas e identificadas en el reino vegetal y cada una tiene un único grupo de compuestos secundarios. En general, los metabolitos secundarios cumplen funciones ecológicas en las plantas: a-

los compuestos volátiles de las flores (terpenos) y los pigmentos de los pétalos (flavonoides) cumplen la función de atraer polinizadores y aumentar la velocidad de fertilización.

b-

Como señales, por ejemplo en la asociación planta-microorganismo.

c-

Protección de la planta frente a agentes físicos: UV, desecación, evaporación, frío, entre otras.

d-

Como compuestos de defensa: en este sentido los metabolitos secundarios pueden sintetizarse en respuesta al ataque microbiano (como es el caso de la fitoalexinas) o bien actuar como protoxinas y ser activados por metabolización durante el ataque (ej. glicósidos cianogenéticos) o como fitoanticipinas mediante el cual se acumulan en un tejido blanco en elevadas concentraciones (ej. alcaloides).

BIOSÍNTESIS: La biosíntesis ocurre usualmente en un órgano o tejido específico, y está temporalmente restringido a un determinado período de vida de la planta. Su síntesis acompañada por traslocación (a corta o larga distancia)

y

su

almacenamiento

están

separados

espacialmente.

La

característica más notable de los metabolitos secundarios es su lenta velocidad de recambio (lo que lo diferencia de los metabolitos primarios). Esto parece razonable para aquellos metabolitos que cumplen su función de defensa. Solamente las plantas y los microoganismos son capaces de sintetizar biológicamente el núcleo aromático. Los compuestos fenólicos forman un gran grupo de sustancias cuyo elemento estructural fundamental que los caracteriza es al menos un anillo aromático sustituido por un grupo OH libre u ocupado por otra función: éster, éter, glicósidos. Los mismos pueden biosintetizarse por dos caminos: 1- Vía del ácido shikímico (Figura 1) 2- Vía del acetato-malonato (Figura 2)

O bien por una combinación de ambas: 3- Biogénesis mixta

Esta secuencia metabólica convierte a los metabolitos primarios eritrosa 4-fosfato y fosfoenolpiruvato (PEP) en los aminoácidos aromáticos: fenilalanina, tirosina y triptofano y los ácidos p-aminobenzoico y p-hidroxibennzoico. Los

compuestos fenilpropanoides derivan principalmente de la fenilalanina o de la tirosina.

Figura 1: Esquema de la ruta del ácido shikímico

Figura 2: Esquema de la ruta del acetato-malonato

A partir de estos precursores se forman una gran variedad de metabolitos secundarios los cuales cumplen importantes funciones en la planta. Debido a su gran variabilidad estructural, han sido aprovechados por el hombre como, por ejemplo, agentes terapéuticos en distintas afecciones, en la industria alimenticia, nutracéutica, entre otras. En las últimas décadas tuvo un gran desarrollo el estudio de los productos naturales, incluyendo plantas con potencial aplicación medicinal. Sin embargo, la introducción de fitomedicamentos a la medicina tradicional o convencional requiere investigación científica acerca de las reales potencialidades terapéuticas de las mismas. Para ello, se procura aislar el o los compuestos responsables de dichas actividades para su posterior incorporación en preparados farmacéuticos. Así por ejemplo se han informado actividades biológicas de un gran número de metabolitos secundarios derivados de plantas:

actividades

antioxidantes,

antiinflamatorias,

anticarcinogénicas,

antimicrobianas, etc. En este trabajo práctico vamos a centrar nuestro estudio en cuatro tipos de compuestos: cumarinas y flavonoides; glicósidos cianogenéticos y alcaloides.

Cumarinas

Son lactonas derivadas generalmente de los ácidos o-hidroxi-cinámicos y pueden clasificarse en cumarinas simples (como la umbeliferona) o condensadas (como las furanocumarinas como el psoraleno y la xantoxina o piranocumarinas) [Figura 3]. El principal interés farmacéutico de las cumarinas radica en su capacidad de actuar como tónicos venosos y agentes vasculares protectores. Es conocido el uso de Melilotus officinalis en la medicina folklórica para tratar el uso de los desórdenes circulatorios debido a la presencia del dicumarol. Históricamente, los psoralenos se han usado, junto con la luz U.V., en el tratamiento de varias enfermedades de la piel como el vitiligo, la psoriasis y las micosis de piel.

Figura 3: Estructura básica de una cumarina

Flavonoides

Son compuestos cuya biogénesis es mixta ya que en ella intervienen dos vías diferentes: se produce la condensación del cumaroil coA (VÍA DEL ACIDO SHIQUIMICO) con tres moléculas del malonilCoA (VIA DE ACETATO MALONATO) produciendo una chalcona a partir del cual se forman por distintos caminos el resto de los flavonoides. Químicamente

están formados por dos anillos aromáticos (A y B) unidos por 3 átomos de C o por un ciclo de 5 o 6 átomos de C y O (anillo C) Figura 4. Anillo B

Anillo A

Figura 4: Estructura de los flavonoides

Sus funciones biológicas en la planta son muy diversas: protegen a los vegetales contra la radiación UV, participan en la interacción plantabacterias simbióticas, plantas-microorganismos como fitoalexinas, participan en la reproducción sexual. Las antocianinas son los flavonoides mas conocidos pues son de los pigmentos hidrosolubles que dan el color característico a muchas flores (atrae agentes polinizadores e interviene en la formación del tubo polínico). En cuanto al uso que le da el hombre, las antocianinas, al igual que otros flavonoides, disminuyen la fragilidad capilar y aumentan su resistencia, probablemente debido a que actúan evitando la degradación del colágeno por inhibición enzimática de la elastasa y de la colagenasa. Por ello, están indicados en diversos trastornos capilares y venosos. Aditivamente poseen actividad antiinflamatoria, antiagregante plaquetaria y, al igual que otros compuestos fenólicos, actividad antioxidante. Además los antocianósidos se emplean en oftalmología en el tratamiento de trastornos circulatorios a nivel de la retina. En cuanto a los isoflavonoides en la actualidad están adquiriendo una gran importancia pues algunos de ellos han mostrado un interesante efecto estrógenico débil pero relativamente selectivo sobre los receptores β –estrogénicos. Por esto es indicado en el tratamiento de la sintomatología asociada al climaterio además de actuar como inhibidores de tirosina-kinasa y por tanto capaces de reducir la proliferación celular. Es el caso de la genisteína (5,7,4'-

trihidroxi-isoflavona) y daidzeína (7,4'-dihidroxi-isoflavona) presentes en la soja.

Glicósidos cianogenéticos

Los precursores primarios de estos compuestos son: fenilalanina y tirosina que derivan de la vía del acido shikímico y luego se glicosilan (con mono o disacáridos) y se acumulan en vacuolas. Actúan como protoxinas de defensa: son activadas por acción de una β-glucosidasa cuando el tejido es dañado, liberando HCN.

Figura 5: Estructura de la oleandrina, glicósido cianogenético extraído de las Rosáceas.

OBJETIVOS DEL PRACTICO.

1-

Conocer y aplicar técnicas de laboratorio tendientes a extraer, cuantificar, separar e identificar compuestos derivados del metabolismo secundario.

2-

Conocer los principios activos presentes en diferentes plantas usadas en medicina popular, así como la aplicación de los mismos en la elaboración de especialidades medicinales.

3-

Elaborar hipótesis, planteos experimentales y resolución de problemas.

PARTE PRÁCTICA

El problema general en el estudio de los productos naturales de plantas es que su naturaleza y cantidad dependen de varios factores, tales como estrés, edad de las plantas, condiciones de recolección, secado y almacenamiento de la misma. En el práctico se utilizarán dos especies de plantas usada en medicina popular en nuestra región: Zuccagnia punctata ( n.v. pus pus) y Larrea cuneifolia (n.v. jarilla macho). 1. Extracción de compuestos fenólicos El material vegetal es sometido a un proceso de secado, el cual puede realizarse colocando las muestras en un desecador en oscuridad, o bien en una estufa de aire forzado (50-52 ºC) o por liofilización. Posteriormente el material vegetal es pulverizado a pequeñas partículas por trituración en molinillo o bien usando nitrógeno líquido y un mortero. La extracción de los compuestos fenólicos se realiza mediante solventes apropiados y puede incrementarse usando un sonicador o agitación en un baño de agua. Este paso puede repetirse varias veces para facilitar la extracción de los compuestos fenólicos. Técnica: 5 g de muestra vegetal se dejan en contacto con 30 ml de etanol 96º durante 2 h, con agitación en baño de agua a 40 ºC. Se filtra por papel de filtro y se trabaja con el líquido filtrado.

2. Cuantificación de compuestos fenólicos totales Los extractos se ensayan individualmente para determinar compuestos fenólicos totales usando la técnica de Singleton et al. (1999). Esta método se fundamenta en que los compuestos fenólicos reducen al reactivo de Folin-Ciocalteau (reactivo de tungsteno y molibdato) para formar un complejo azulado que absorbe a 765 nm. Técnica: Reactivos: a-solución patrón de ácido gálico (0,3 mg/ml) en alcohol 96º (*). b- solución de Na2CO3 al 15,9 % en agua. c- reactivo de Folin-Ciocalteau (Merck).

Metodología: se sigue el siguiente protocolo de trabajo: Nº de Muestra muestra (µl)

Agua Reactivo dest. de Folin (ml) (ml)

Na2CO3 15,9 % (ml)

1

--------

2

0,2

0,8

2*

10

1,99

0,2

3*

30

1,97

0,2

4*

60

1,94

0,2

0,8 2 minutos 0,8 a temp. amb. 0,8

5*

90

1,91

0,2

0,8

Extrac.1 50 (dil)

1,95

0,2

0,8

Extrac. 50 (dil) 2

1,95

0,2

0,8

Calentar 5 min a 50 ºC. Enfriar Leer a 765 nm

Se grafica la curva estándar* (muestra 2 a 5): Densidad óptica (DO) en función de los µg de ácido gálico y se calcula en contenido de compuestos fenólicos en las muestras (extracto 1 y 2) en µg/ml.

3. Identificación de los compuestos fenólicos y otros metabolitos secundarios

Cumarinas. Técnica: cromatografía en capa fina (CCF). Metodología: en una placa de sílica gel G-60 F254 (4 x 7 cm) se siembra 10 µl de cada uno de los extractos y 10 µl de una solución estándar de cumarina. Como solución estándar se usará: a- solución alcohólica de cumarina de 3 mg/ml b- una solución de cumarina extraída de una especialidad medicinal (Esberiven Depot®). La gragea se pulveriza en mortero y se añade 5 ml de etanol para extraer el principio activo. Se recupera este

preparado, se centrifuga a 6000 rpm y el sobrenadante obtenido se utiliza como solución estándar. Solventes de corrida: cloroformo: acetato de etilo (60:40). Detección: la identificación se efectúa al UV de onda larga (366 nm, UV Lamp

Model UV 5L-58 Mineralight Lamp) observándose una intensa

fluorescencia azul o verde azulada correspondiente a las cumarinas. Esta fluorescencia se intensifica al exponer la placa a vapores de amoníaco o al rociarla con una solución hidroalcohólica de KOH al 5%. 3.2 Flavonoides. Técnicas:

cromatografía

en

capa

fina (CCF)

y reacciones de

identificación. Metodología 1: en una placa de sílica gel G-60 F254 (4 x 7 cm) se siembra 10 µl del extracto y 10 µl de una solución estándar de rutina. Como solución estándar se usará: c- solución alcohólica de rutina de 0,15 mg/ml d- una solución de flavonoides extraída de una especialidad medicinal (Daflón®). La gragea se pulveriza en mortero y se añade 5 ml de etanol para extraer el principio activo (hesperidina). Se recupera este preparado, se centrifuga a 6000 rpm y el sobrenadante obtenido se usa como solución estándar. Solventes de corrida: acetato de etilo:ácido fórmico:ácido acético:agua (100:11:11:27) Detección: Los componentes separados son visualizados bajo luz ultravioleta (254 y 360 nm). Los flavonoides poseen espectros con intensas absorciones en el espectro ultravioleta, se pueden distinguir dos bandas principales: banda II (240 – 285 nm.) y la banda I (300 – 550 nm.) Figura 7. Posteriormente, las placas son asperjadas con reactivos químicos de relevado tales como el reactivo de productos naturales (NPG, solución metanólica de 2-aminoethyl diphenylborate al 1%) 254 nm: el estándar rutina fluórese como una mancha azul oscuro. 365 nm: se observa una intensa fluorescencia amarilla, azul o verde dependiendo de la estructura química del compuesto. Esta fluorescencia

puede ser intensificada

por el agregado de reactivos químicos de

revelado como el NP (natural product reagent).

Figura 7: Máximos de absorción en la región del UV de los flavonoides Como reactivo de revelado también se usa el FeCl3 o AlCl3 al 1% en agua. El AlCl3 forma quelatos con los grupos hidroxilos adyacentes a los grupos carbonilos tanto en C5 como C3. El AlCl3 también forma quelatos con grupos hidroxilos en posición orto, aunque es inestable en medio ácido. Metodología 2: Las reacciones de coloración pueden usarse también para evidenciar la presencia de flavonoides, una de las más específicas es la Reacción de Shinoda, de la que resultan coloraciones características según el tipo de núcleo de los flavonoides. La técnica consiste en colocar un volumen determinado del extracto en un tubo de ensayo. Luego se agregan granallas de Magnesio y gotas de ácido clorhídrico concentrado. Observar la coloración. Coloración de los flavonoides frente a la reaccion de Shinoda. Tipo de flavonoide Chalconas Auronas Isoflavononas Isoflavonas Flavanonas Flavanonoles Flavonas y flavonoles

Color de reacción de Shinoda No hay coloración No hay coloración No hay coloración Amarillo rojizo Azul magenta, violeta, rojo. Rojo a magenta Amarillo a rojo.

Metodología 3: Existen otras técnicas para la identificación de los flavonoides que no serán utilizadas en este trabajo práctico tales como: espectrofotometría

ultravioleta,

espectrofotometría

infrarroja,

espectrofotometría de masa, difracción de rayos X y resonancia magnética nuclear.

3.3. Glicósidos cianogenéticos. Técnica: El ensayo para detectar en las drogas los heterósidos cianogenéticos se denomina ensayo de Grignard. Se basa en la capacidad de los heterósidos cianogenéticos presentes en plantas para desprender HCN al tomar contacto con agua. Este se combina luego con picrato de sodio para dar isopurpurato sódico de color rojo ladrillo (Figura 8).

Figura 8: Estructura del glicósido cianogenético: amigdalina

Metodología: Se coloca el material vegetal (hojas de Manihot flabelifolia, pepitas de damasco o ciruela) cortado en pequeños trozos en contacto con un volumen de agua destilada en un erlenmeyer de 250 ml. Se tapa el erlenmeyer con un tapón de goma del cual se cuelga un trozo de papel de filtro tratado previamente con una solución saturada de picrato de sodio. Se macera en un baño termostatizado a 30ºC para producir la hidrólisis enzimática. El HCN se desprende y reacciona con el picrato de sodio. El desprendimiento es rápido y tiene lugar en el transcurso de unos 15 minutos. Para dar como negativo el ensayo se esperan 3 horas. El desprendimiento también se puede producir añadiendo un ácido débil. Se puede valorar posteriormente el HCN liberado mediante el método de

Liebig-Deniges.

Amigdalina

glucosa + ácido cianhídrico + benzaldehído

Figura 9: Esquema del proceso de hidrólisis de la amigdalina.

Bibliografía 1- Singleton, V.; Orthofer, R.; Lamuela-Raventos, R. (1999). Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin Ciocalteu reagent. Methods in Enzymology , 299, 152-178. 2- Dey J, Harborne JB. Methods in Plant Biochemistry. Volume 1 Plant Phenolics. Academic Press 1989. 3- Wagner H., Bladt S., Zgainsky E.M. Plant Drug Analysis. In A Thin Layer Chromatography Atlas. Springer. Berlin 1984, pp. 320. 4- Markham, K.R., 1982. Ultraviolet-visible absorption spectroscopy. Techniques of Flavonoid Identification. Academic Press, New York, pp. 36–51. 5- Krebs K.G., Heusser D. and Wimmer H. Spray Reagents In Layer Chromatography a Laboratory Handbook. Stahl, E. Eds. Springer-Verlag, Berlin, 1969, pp 854-905.

ACTIVIDAD DEPURADORA DE RADICALES LIBRES DE EXTRACTOSDE PLANTAS MEDICINALES

La

síntesis

química

ha

sido

una

fuente

importante

de

sustancias

farmacológicamente activas para la industria farmacéutica. Sin embargo, en los últimos años también se ha incrementado el uso de productos naturales de origen vegetal. Esto se debe a que el metabolismo secundario, cuyo proceso evolutivo empezó hace miles de años, ha sido capaz de generar una sorprendente diversidad de compuestos químicos. Actualmente se están desarrollando programas destinados a la búsqueda de principios activos con actividad antibacteriana, antiinflamatoria, antivirales y antitumorales en plantas utilizadas tradicionalmente como medicinales o que presentan características ecológicas determinadas. Desde hace algunos años, la destrucción del medio ambiente (deterioro de la capa de ozono, smog, humo de cigarrillos, rayos UV beta, etc.) generan en el hombre una serie de trastornos agudos y crónicos que provocan un estado de fatiga, agotamiento y estrés. Una causa de ello es el aumento desmedido de los llamados "radicales libres". Radicales libres: un radical libre es una molécula o átomo que posee en su capa externa un electrón desapareado. Esta condición particular hace que sean altamente reactivos para con las moléculas vecinas y su vida como tal es muy corta. Trata de corregir su estado de inestabilidad tomando un electrón del elemento más cercano. Los radicales son las denominadas formas activadas del oxígeno (O 2) que se forman a partir de éste, por la ganancia de un electrón. Aunque en sentido estricto no todas las formas son radicales libres, todas son inestables o tóxicas (cuadro 1).

Cuadro 1 Fórmula O2 O2 – HOOH OH O2 ·

Denominación Oxígeno Molecular Ion Superóxido Peróxido de Hidrógeno Radical Oxhidrilo Oxígeno singulete

Estabilidad Estable Inestable El menos inestable

Radical Libre NO SI NO

Muy inestable El más inestable

SI SI

Producción en el organismo: los radicales libres se forman por activación del oxígeno a través de dos caminos: a) ganancia de energía (raramente). b) ganancia de un electrón. En condiciones normales se generan en bajas concentraciones (cuadro 2) en los sistemas biológicos tales como: • Respiración mitocondrial: en el proceso de respiración celular. • Síntesis de prostaglandinas que participan en eventos fisiológicos y patológicos (inflamación). • Fagocitosis leucocitaria: los glóbulos blancos utilizan los radicales libres como mecanismo de defensa. Al englobar gérmenes forman fagosomas con radicales libres en su interior, destruyendo así al agresor. •

Radiaciones: las radiaciones ionizantes de la luz UV y visible producen

radicales libres por ganancia de energía. Fotoquímicamente los eventos empiezan por la toma de energía electrónica de un fotón, la cual es suficiente para romper un enlace covalente. El O 2 molecular es el principal compuesto excitado y produce O2·(oxígeno singulete). Este ataca preferentemente a aminoácidos y ácidos grasos poliinsaturados (a mayor número de dobles enlaces mayor suceptibilidad al ataque)

Cuadro 2

Las rutas no-fotoquímicas involucran la interacción del O2 molecular con radicales libres para producir nuevas especies radicales que contienen O 2. Este tipo de reacciones pueden ocurrir directamente o bien ser promovidas por enzimas tales como la lipoxigenasa. En una primera etapa se produce la formación de un radical R* a partir de un precursor no-radical: RH →

R•

Esta fase se conoce como fase de iniciación de la autoxidación. Este proceso * es generalmente lento y se denomina también "periodo lag". Luego sigue una fase de propagación donde hay formación de radicales peroxi ROO•por reacción del radical formado con el oxígeno molecular: R• + •O-O• → ROO•

Estos radicales reaccionan con compuestos orgánicos que contengan H 2 (RH). ROO• + R′H→ROOH + R'•

Finalmente cuando todo el oxígeno o especies hidrogenadas han reaccionado, la cascada de reacciones llega a su fase de terminación para dar productos inactivos (no-radicales). ROO• + R• → ROOR 2ROO•→ ROOR + O2 Mecanismos de defensa: se denominan antioxidantes o captadores de radicales libres a sustancias capaces de captar y neutralizar de manera perdurable a los radicales libres y a las diferentes formas activadas del oxígeno. Más que una sola sustancia son generalmente cadenas de reacciones o de sistemas antioxidantes destinados a regenerar sus diferentes compuestos. Existe un sistema antioxidante fisiológico (mecanismo de defensa adaptativo), constituido por múltiples sistemas enzimáticos acoplados. Estos sistemas antioxidantes

constituyen

los

antioxidantes

endógenos

y

son

fundamentalmente dos: (a) Superóxidodismutasa (SOD): son metalo-proteínas intracelulares que transforman al radical superóxido en peróxido de hidrógeno y oxígeno. 2 O2• + 2 H+→H2O2 + O2 El peróxido de hidrógeno es luego removido por

(b) Catalasa (CAT) 2 H2O2→

2 H2O + O2

(c)o Peroxidasas (principalmente la glutatión peroxidasa GSH-Px) donde el glutatión pasa a su forma oxidada. H2O2 + 2 GSH → GS-SG + 2 H2O La acción de la SOD está acoplada a las de las CAT/GPx para evitar la acumulación

de

peróxido.

Estos

sistemas

de

defensa

se

activan

constantemente pues deben neutralizar los radicales libres lo antes posible para impedir la producción del daño. Existen situaciones en que la producción de radicales libres está anormalmente aumentada, generándose un proceso llamado

"estrés oxidativo".

Este concepto

expresa una

situación de

desequilibrio entre las velocidades de producción y metabolización de radicales libres y durante la cual se desbordan las defensas naturales, atacando blancos tales como: I. Membranas: las membranas de una célula (membrana externa y membrana de las organelas) están formadas por una bicapa lipídica con diversos tipos de proteínas incrustadas en su estructura. Los lípidos de la membrana contienen ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) que determinan la solidez del conjunto y es precisamente a ese nivel que las células son vulnerables al ataque de los radicales libres. Estos al reaccionar con los AGPI, no sólo los oxidan sino que generan una reacción en cadena (efecto cascada) de autooxidación de unos a otros que termina finalmente por desestructurar la arquitectura de la membrana y decreta la muerte celular (fig. 1). II.

Proteínas:

las

proteínas

en

sus

diversas

funciones

(receptores,

transportadores, proteínas estructurales, enzimas) pueden ser afectadas, especialmente aquellas que poseen un grupo sulfhidrilo (SH). También son afectadas aquellas proteínas de larga duración como el colágeno o la elastina de la piel. III. Ácidos nucleicos: el ataque es directamente a nivel cromosómico, con desnaturalización del ADN. Esto genera graves consecuencias sobre la transmisión genética y por lo tanto sobre la síntesis proteica. Todas estas acciones determinan lesiones y se ha adjudicado la acción deletérea de los radicales libres en numerosos procesos patológicos (envejecimiento, isquemia celular, procesos inflamatorios agudos y crónicos, intoxicaciones, ciertos cánceres, etc.). La producción de radicales libres se incrementa también considerablemente en procesos infecciosos e inflamatorios, como también en enfermedades degenerativas del sistema nervioso (mal de Alzheimer, enfermedad de Parkinson), alteraciones del cristalino (cataratas, presbicia), arteriosclerosis, adicciones, etc. Todas estas situaciones involucran un estado de estrés oxidativo que a la vez puede ser causa y/o consecuencia de cada patología en

particular. Es así que el tratamiento combinado con antioxidantes produce beneficios terapéuticos frente a diversas patologías y constituye una efectiva modalidad de quimioprevención.

Fig. 1

Si los sistemas endógenos de protección contra los radicales libres son excedidos en su capacidad, la neutralización de ellos dependerá entonces de otros compuestos (antioxidantes exógenos) aportados por la dieta. Los más conocidos son el ácido ascórbico (Vitamina C), α-tocoferol (Vitamina E), βcarotenos, ubiquinona o coenzima Q, la mayoría de origen vegetal.

Uno de los antioxidantes sintéticos más usados es el Hidroxitoluenobutilado (BHT) debido a su estabilidad y bajo costo. Sin embargo se han impuesto restricciones en el uso del mismo debido a que compuestos tóxicos y/o carcinogénicos se formarían durante su degradación. De allí el interés en el aislamiento y uso de antioxidantes naturales. El descubrimiento de que muchos compuestos fenólicos inhiben la oxidación de lípidos, contribuyó a su aislamiento en plantas y su posterior aplicación terapéutica. La estructura fenólica parecería ser primordial para dicha actividad; así

flavonoides

(quercetina),

tocoferoles,

catequinas,

taninos,

ácido

clorogénico pueden actuar como antioxidantes o tener un efecto sinérgico entre sí. La vitamina E es sintetizada exclusivamente por el reino vegetal. Se encuentra bajo la forma de acetato, su forma más activa biológicamente es el a-tocoferol. Su alta solubilidad en lípidos explica su eficiente acción antioxidante in vivo de estos compuestos. Estudios recientes demostraron que las vitaminas E y C y los β-carotenos actúan en conjunto. La primera hipótesis de su mecanismo de acción sería: la vitamina E reacciona con los radicales libres oxidándose. Los carotenoides luego activan a la vitamina E oxidada, mientras que la vitamina C hidro-solubiliza a los radicales libres, los que se eliminan luego por la orina. Sin embargo, se vio que algunos compuestos que presentan acción antioxidante, en determinadas condiciones favorecen la formación de un radical libre, o sea presentan una acción pro-oxidante. Por ejemplo, el ácido clorogénico y la catequina tienen una probada acción antioxidante en lipoproteínas de baja densidad (LDL), cuya oxidación es factor importante en la iniciación y progresión de la arterosclerosis. Cuando estos compuestos se agregan en la fase de iniciación, inhiben la oxidación de las LDL, pero cuando se agregan a la fase de propagación, actúan como aceleradores de la oxidación de las LDL (pro-oxidantes). El mismo fenómeno se observó con el ácido ascórbico, el cual actúa como antioxidante o pro-oxidante de acuerdo a su concentración, a la presencia de iones metálicos o la fase de oxidación en la cual es agregado. De acuerdo a esto, el daño celular dependerá del balance entre el sistema de defensa antioxidante y el mecanismo pro-oxidante (fig. 2)

Fig. 2 PARTE PRACTICA

1) Reducción del DPPH: Se usará un método colorimétrico rápido y simple para determinar la actividad antioxidante

de

extractos

etanólicos

de

plantas

que

son

utilizadas

tradicionalmente en medicina popular en nuestro país. El reactivo DPPH (1,1-difenil 2-picrilhidrazil) es un radical libre estable, presenta un máximo de absorción a 514 nm dando en solución un color púrpura.

Cuando este reactivo reacciona con un compuesto antioxidante forma DPPH reducido por donación de un átomo de hidrógeno. En este estado cambia su absortividad molar, el color vira de púrpura a amarillo en forma proporcional al número de electrones capturados. Para el ensayo se utilizará extracto vegetal y sustancias con conocida actividad depuradora de radicales libres: Hidroxitoluenobutilado (BHT) y quercetina. Reactivos: * DPPH (300 µM) en etanol de 96° (3 mg en 25 ml de etanol) * Extracto vegetal: 2,5 gr de muestra vegetal (Larrea divaricata) se deja en contacto con 25 ml de etanol de 96° durante 2 horas, con agitación en baño de agua a 40° C. Se filtra por papel de filtro.

* BHT: * Quercetina: mg/ml

Procedimiento:

Blanco: 2 ml de etanol Control: 1,5 ml de etanol + 0,5 mi de DPPH Ensayos: 0,5 mi de DPPH + diferentes volúmenes de las sustancias a ensayar. Completar a 2 ml con etanol.

Dejar a temperatura ambiente durante 20 minutos y leer a 514 nm llevando a cero con alcohol. La reducción del DPPH se evalúa por comparación con un control y los resultados se expresan en relación a dicho control. 2) Test de blanqueo del β-caroteno:

Reactivos 

β-caroteno 0,2 mg/ml de cloroformo



Acidolinoleico



Tween20



Extractos alcohólicos de plantas medicinales

Mezcla de incubación: A 1 ml de 6 caroteno se le agrega 0,02 mi de ácido linoleico, 0,2 mi de Tween 20 y 0,2 mi de extracto etanólico o etanol (control). Mezclar y evaporar a sequedad. Agregar 25 ml de agua oxigenada de 20 volúmenes. Calentar a 50° C durante 30-60 minutos. A intervalos de 10 minutos se lee densidad óptica a 470 nm usando agua destilada como blanco. Se calcula actividad antioxidante como % de inhibición relativa.

LABORATORIO

Muestra ensayada:

Extracto (μl) Control 25 50 75 100

μg de compuestos fenólicos

DO 514

% Actividadresidua l

% Actividad antioxidante

100

0

150

a) Graficar DO 514 en función de μg de compuestos fenólicos c) Determinar y graficar Actividad Residual y Porcentaje de Actividad Antioxidante en función de μg de compuestos fenólicos.

REFERENCIAS

EFECTO ANTIMICROBIANO DE EXTRACTOS DE PLANTAS MEDICINALES

1. Introducción

Las plantas deben sobrevivir al ataque de un gran número de microorganismos, particularmente bacterias y hongos, y además, como están fijas al sustrato terrestre del que deben extraer diversos nutrientes (H 2O, sales, compuestos nitrogenados, etc.), forzosamente están en la mutua competencia por su alimento. Las plantas superiores, tal como hoy las conocemos, son la resultante de una coevolución con todas las formas vivas: bacterias, hongos animales herbívoros y con las plantas inferiores. Esta coevolución se remonta a la diferenciación biológica entre animales y vegetales, y llevó a la creación de diversos mecanismos de interacción entre todas las formas vivas. Solo tendían a sobrevivir aquellas formas vegetales que presentaban características morfológicas o químicas favorables (espinas, mejores cutículas aislantes, mal gusto o toxicidad). Para defenderse del efecto nocivo de otros vegetales, las plantas superiores son capaces de producir sustancias químicas denominadas alelopáticas. Por otra parte, como respuesta al ataque de microorganismos, también producen y acumulan sustancias conocidas como fitoalexinas. La existencia de una respuesta por el huésped frente a la invasión por un microorganismo implica el reconocimiento de la presencia del parásito por la planta huésped, es decir, que la planta debe poseer un sistema de alarma que ponga en marcha sus mecanismos defensivos. Esta alarma puede ser química y/o eléctrica. Las alarmas químicas han recibido el nombre genérico de elicitores, los que se definen como sustancias que provocan la síntesis y acumulación de fitoalexinas en el organismo del huésped. Sin embargo, la biosíntesis de fitoalexinas no es solo provocada por factores biológicos, sino

que también puede ser estimulada por factores tales como heridas, intoxicaciones, irradiaciones, etc. Este mecanismo de las plantas, de elaborar productos químicos para defenderse de sus predadores fue aprovechado por el hombre quien comenzó a ensayar el efecto de extractos vegetales sobre diversos microorganismos en la búsqueda de compuestos con actividad antimicrobiana. La búsqueda de sustancias con actividad antimicrobiana selectiva, y que además carezcan de efectos tóxicos sobre los animales y vegetales, es un tópico importante en las investigaciones realizadas sobre productos naturales. La respuesta de los microorganismos a los productos naturales es muy heterogénea, debido a la fuerte dependencia de los métodos aplicados y de las especies microbianas a evaluar. Un ensayo antimicrobiano estandarizado debe cumplir con diversas condiciones (Dey & Harborne, 1991): 1- La sustancia a evaluar debe ponerse en contacto con la membrana celular o pared celular del microorganismo seleccionado para la prueba. 2- Deben existir parámetros de fácil medición que provean evidencia cuantitativa del crecimiento del microorganismo utilizado. 3- La elección de los microorganismos depende principalmente del propósito de la investigación. Para propósitos generales se deben seleccionar los microorganismos más representativos de los principales grupos de patógenos, teniendo en cuenta también sus patrones de resistencia. 4- Las sustancias a evaluar se deben disolver y diluir en solventes puros o mezclas de ellos. Estos solventes deben ser inocuos para el crecimiento microbiano, 5- Las mezclas cuyos componentes posean solubilidad diferencial en agua, deben ser ensayados en un sistema de solventes que asegure un contacto apropiado entre el organismo a evaluar y el producto bioactivo. Esto se suele aplicar en muestras con aceites esenciales, cuya solubilidad en agua suele ser baja.

Los ensayos para determinar actividad antimicrobiana de productos naturales pueden ser técnicas de difusión y de dilución.

2. Consideraciones generales

2.1. Conservación de los microorganismos: los microorganismos son preservados por crecimiento continuo o por enfriamiento. El crecimiento continuo se realiza en medio nutritivo agarizado, y los microorganismos así crecidos se conservan a bajas temperaturas para disminuir los intervalos entre subcultivos. Por enfriamiento, las bacterias son conservadas a -20°C (o -70°C) usualmente en medio BHI (brain-heart infusion, infusión de cerebro y corazón) semisólido (por agregado de agar al 1,5 % m/v), adicionado con glicerol al 1,5 % v/v como crioprotector. También existen bacterias que se conservan a temperatura ambiente en agua como es el caso de la cepa gran negativa Pseudomonas aeruginosa.

2.2. Activación del crecimiento: las bacterias conservadas en medio BHI semisólido se incuban a 37°C durante 2 hs y luego son sembradas por estriación (Fig. 1) en un medio nutritivo, como agar Mueller Hinton (MH) para obtener colonias individuales. Se incuban las placas (invertidas para evitar la contaminación por agua de condensación) a 37 °C durante 20-24 hs, y tras este período se observa el crecimiento bacteriano. Los inóculos a emplear en los ensayos se preparan a partir de éstas bacterias, pues se considera que están en fase logarítmica de crecimiento, etapa en la que el cultivo es más homogéneo.

Figura 1: Esquema de la siembra por estriación de bacterias

3. Métodos de difusión

3.1. Ensayo de difusión en pocillos: en esta técnica se prepara un medio nutritivo

agarizado en caja de

Petri, se deja solidificar y se

practican perforaciones (pocillos) con la ayuda de un sacabocados estéril. Se prepara una suspensión bacteriana (de concentración definida), y se siembra en la superficie del medio solidificado.

Se coloca en los pocillos

diferentes diluciones de la sustancia a evaluar o diferentes sustancias a igual

concentración, y se deja que los compuestos

medio, esta

difusión

difundan en el

dependerá de la solubilidad de las sustancias

constituyentes y sus tamaños. Luego de la incubación, los organismos sensibles a la muestra ensayada no crecen alrededor de los discos, observándose áreas llamadas “halos de inhibición”. Esta técnica provee una medida relativa de la actividad antimicrobiana, ya que sus resultados son cualitativos o semicuantitativos, además estos resultados se ven afectados por varios factores, como la capacidad de difusión de la muestra en el medio o el espesor de la capa de medio de cultivo. Sin embargo, tiene la ventaja de ser un ensayo fácil de realizar, de bajo costo y que no consume mucha cantidad de muestra. Se puede utilizar como ensayo preliminar para evaluar la actividad antimicrobiana de una (o varias) sustancias o extractos (Fig. 2).

Figura 2: Esquema de una prueba de difusión en agar (izquierda). Esquema de la forma de medir los halos de inhibición (derecha).

3.2. Ensayo de difusión con discos: esta técnica es similar a la anterior, pero en lugar de practicar perforaciones en el medio de cultivo, se aplican discos de papel de filtro impregnados con la sustancia a evaluar, y se deja que ésta difunda. Los resultados se observan midiendo los halos de inhibición. 3.3. Ensayo Bioautográfico: permite la identificación in situ de la actividad antimicrobiana del o de los compuestos separados por Cromatografía en Capa Fina (CCF). Primero los componentes de una muestra son separados mediante CCF y luego de evaporar la fase móvil, la placa cromatográfica es puesta en contacto con el medio de cultivo semiblando inoculado con una cepa bacteriana. Los compuestos antimicrobianos son identificados como “zonas de inhibición”

del crecimiento bacteriano, las cuales pueden ser puestas en

evidencia atomizando la placa con un indicador coloreado (Homans & Fuchs, 1970). Se pueden emplear sustancias redox como indicadoras del crecimiento, tales como las sales de tetrazolio (amarilla), que por acción de las deshidrogenasas de las bacterias vivas, se transforma en formazán (azul). Las zonas de inhibición del crecimiento se observan como zonas de color amarillo

pálido en contraste con un fondo color azul (Fig. 3). Los valores de Rf de las áreas de inhibición (amarillas) son comparados con los valores de Rf de las correspondientes bandas en placas de CCF reveladas con otros reactivos. La sal de tetrazolio más utilizada para este ensayo es el MTT [bromuro de 3-(4, 5dimetiltiazol-2-il)-2, 5- difeniltetrazolio]. Este método es muy usado para la purificación de sustancias guiada por actividad biológica (Zampini et al., 2009).

Figura 3: A) Cromatografía en capa fina de extractos vegetales revelada con Vainillin/H2SO4 (revelado para terpenoides). Fase móvil: acetato de etilo/ácido fórmico/ácido acético/agua (100:11:11:27). Se indican los valores de Rf. B) Bioautografía, las zonas claras representan compuestos con actividad antimicrobiana sobre la cepa Staphylococcus aureus (ATCC 25923)

Métodos de dilución

4.1. Dilución en agar (macrodilución): en este ensayo se preparan varias cajas de Petri con el compuesto o extracto a evaluar diluido en un medio nutritivo (como agar MH) en diferentes concentraciones. De este modo queda el extracto a evaluar incorporado a la matríz del medio de cultivo. Sobre el medio solidificado se inocula de forma puntual diferentes cepas bacterianas (Fig. 4). Luego se incuban las placas a 37°C 20-24 hs, pasado este tiempo se

evalúa el crecimiento microbiano (CLSI, 2006). Las ventajas de este ensayo radican en la posibilidad de obtener datos cuantitativos de la actividad antimicrobiana, como la concentración inhibitoria mínima (CIM) para varias especies

bacterianas de

forma

simultánea.

La

CIM

es

la

mínima

concentración de extracto (o sustancia) a la cual no se observa crecimiento bacteriano. Algunas desventajas de este método son la alta cantidad de extracto que se requiere, por lo que no se suele aplicar en las etapas de purificación de los compuestos, y la gran cantidad de material requerido para el ensayo. Este ensayo se suele emplear para evaluar la actividad antimicrobiana de un mismo extracto sobre diferentes cepas bacteriana.

Figura 4: Método de macrodilución en medio sólido de un extracto de Ligaria cuneifolia. En el control se observan las zonas de crecimiento de 26 cepas ensayadas. Al aumentar la concentración del extracto a ensayar se incrementa la sensibilidad microbiana (10 cepas son sensibles a una concentración de 2 mg/mL, mientras que 20 cepas son sensibles a una concentración es de 12mg/ml)

4.2. Dilución en caldo (microdilución): En esta técnica se preparan diluciones seriales de un compuesto (o extracto vegetal) en los pocillos de policubetas de poliestireno de 96 perforaciones (Fig. 5). Las suspensiones bacterianas se preparan en caldo nutritivo, como por ejemplo caldo MH, y se agregan a los pocillos que contienen las sustancias a evaluar. Se encuban las

policubetas cerradas a 37°C durante 20-24 hs. Tras la incubación se evalúa el crecimiento bacteriano y se determina los valores de CIM (CLSI. 2006). Se puede emplear un indicador de crecimiento, como el MTT (usado en los ensayos bioautográficos descripto previamente) o Alamar Blue R, cuyo fundamento es que en ausencia de actividad metabólica microbiana, toma color azul, y cambia a color rojo por efecto de la actividad metabólica microbiana. Este método presenta varias ventajas, entre ellas, la velocidad de realización, bajo

coste,

bajas

cantidades

de

muestra

requeridas,

exactitud

y

reproducibilidad en los resultados obtenidos. Además, el ensayo de microdilución brinda la posibilidad de obtener la concentración bactericida mínima (CBM), mediante un posterior cultivo en medio nutritivo agarizado, de alícuotas tomadas de los pocillos de las policubetas donde no se observa crecimiento. La CBM es la concentración necesaria para producir la muerte del 99,9% de un inóculo original en un determinado período de tiempo.

Figura 5: Esquema de siembra en policubeta de 96 pocillos. CE: control de esterilidad del medio de cultivo. CC: control de crecimiento. Desde la columna 4 a la 12 se preparan concentraciones crecientes del extracto

5. Parte Práctica

Objetivo

Evaluar la actividad antimicrobiana de extractos vegetales preparados a partir de partes aéreas de Larrea divaricata y Zuccagnia punctata sobre cepas bacterianas patógenas Gram negativas (Escherichia coli ATCC 25922) y Gram positivas (Staphylococcus aureus ATCC 25923) mediante la técnica de difusión en agar con pocillos (ver apartado 3.1.). Las cepas se adquieren comercialmente de la ATCC (American Type Culture Collection).

Materiales y Métodos

-Preparación del extracto vegetal: preparar un extracto alcohólico mediante el método de maceración, y uno acuoso por decocción a partir de las plantas seleccionadas para ensayar su efecto sobre bacterias patógenas humanas. Previo a ser utilizada, la decocción debe centrifugarse a 6000 rpm durante 5 minutos, para separar residuos poco solubles, y esterilizarse por filtración (con una jeringa de 10 mL se hace pasar la decocción a través de un soporte que contiene una membrana estéril de 0,22 µm, que retiene las células bacterianas que podrían hallarse en el extracto como contaminantes; el líquido filtrado se recolecta en tubos estériles). El extracto alcohólico o tintura no requiere esterilización puesto que el solvente en este caso impide el crecimiento microbiano. -Medio de cultivo: se empleará el medio de cultivo Mueller Hinton agar (Britania), éste es un medio recomendado universalmente para la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos y para el aislamiento y cultivo de microorganismos exigentes en requerimientos nutricionales. Es un medio muy completo, que no contiene componentes termolábiles por lo que puede ser esterilizado mediante autoclavado. Posee una gran estabilidad en el pH y composición.

Composición del medio MH agar en g/L Infusión de carne---------------------------------------300,0 g Peptona ácida de caseína------------------------------17,5 g Almidón-------------------------------------------------1,5 g Agar------------------------------------------------------15,0 g pH del medio: 7,3±0,1

Preparación: suspender 3,7 g del polvo en 100 ml de H2O destilada; dejar embeber 10 a 15 minutos. Calentar con agitación frecuente y hervir durante un minuto. Repartir en tubos de ensayo (10 mL/tubo). Esterilizar en autoclave a 1 atmósfera de presión durante 20 minutos. Luego distribuir en cajas de Petri estériles (20 mlL por caja). -Otros materiales: esterilizar en autoclave sacabocados de 7 mm de diámetro, tubos con solución fisiológica, tubos vacíos, frascos con hisopos, frascos con tips para micropipetas, filtros de 0,22 µm (colocados en una caja de Petri). Esterilizar en estufa a 180°C 4 cajas de Petri de vidrio. Preparar solución de etanol 70% v/v (para limpiar y desinfectar el área de trabajo) y solución de hipoclorito de sodio al 10 % (para decontaminar todo el material con restos patogénicos). -Preparación del inóculo: se prepara una suspensión bacteriana a partir de un cultivo de microorganismos en fase logarítmica. Se toman 4 o 5 colonias y se suspenden en 2 mL de solución fisiológica estéril. Luego se ajusta el inóculo, usando un espectrofotómetro, hasta una densidad óptica de 0,08 a 0,1 determinada a una longitud de onda de 625 nm. Esta turbidez equivale al 0,5 de la escala de Mac Farland (escala turbidimétrica que relaciona la turbidez de una suspensión con la concentración microbiana). Una turbidez equivalente al 0.5 de Mc Farland representa aproximadamente 108 UFC/mL (unidades formadoras de colonias/mL) para bacterias de rápido crecimiento (Andrews, 2005). La estandarización de inóculo es esencial, ya que el tamaño de la zona de inhibición es muy dependiente de la densidad del inóculo utilizado. Las suspensiones ajustadas deben utilizarse en un lapso de tiempo de no más de 15 minutos después de ajustar la turbidez de la suspensión del inóculo

-Prueba de inhibición: -Fundir el medio de cultivo estéril contenido en los tubos, agregarlos en las cajas de Petri estériles y dejar solidificar durante 15 minutos. -Una vez solidificado el medio de cultivo, realizar 4 perforaciones equidistantes con el sacabocados estéril. - Sumergir un hisopo estéril en la suspensión bacteriana ajustada. El hisopo debe ser rotado varias veces y presionado firmemente contra la pared interna del tubo sobre el nivel de líquido. Esto remueve el exceso de inóculo. -Inocular la superficie de una placa de agar Mueller -Hinton por rayado con el hisopo sobre toda la superficie. Este procedimiento es repetido rayando dos o más veces, rotando la placa aproximadamente 60º cada vez para asegurar una distribución uniforme del inóculo. Una vez finalizada la inoculación, el hisopo se descarta en solución de hipoclorito de sodio al 10%. -Colocar en cada perforación 30 µL de distintas diluciones del extracto (20, 40 y 80 µg de compuestos fenólicos), y en un pocillo colocar igual volumen de agua destilada estéril o alcohol como control negativo, si el extracto ensayado es acuoso o alcohólico, respectivamente. –Incubar las placas en estufa a 37 °C durante 20-24 hs RESULTADOS

-Observar y medir los halos de inhibición en tres direcciones (como se indica en Fig.3) y calcular el promedio. -Registrar los datos en la siguiente tabla. -Graficar diámetro del halo de inhibición (mm) en función de la cantidad de extracto vegetal sembrado (µg de compuestos fenólicos). -Analizar los resultados obtenidos.

MICROORGANISMO: µg de compuestos fenólicos 0 (control negativo)

Promedio del diámetro del halo (mm) 0

EXTRACTO VEGETAL: % de crecimiento

% de inhibición

100

0

Bibliografía - Andrews, JM (2005). BSAC standardized disc susceptibility testing method (versión 4). Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56, 60-76. -Zampini, IC, Isla, MI., Schmeda-Hirschmann, G. (2009) Antimicrobial and antioxidant compound from the infusion and polar extract of Baccharis incarum (wedd.) Perkins. Journal of the Chilean Chemical Society 54 (4): 289-293 -Dey, PM, Harborne, JB (1991). En: Methods in Plant Biochemistry. Volume 6: Assays for Bioactivity. (Hostettmann, K Ed). Academic Press Limited, London. -Homans, AI, Fuchs A (1970). Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a methods for detecting fungitoxic substances. Journal of Chromatography, 51, 327-329. -Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). (2006). Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; Approved StandardSeventh Edition document M7-A7.

BIOENSAYO DE GENOTOXICIDAD DE EXTRACTOS VEGETALES

INTRODUCCIÓN

Los bioensayos de toxicidad son una herramienta intensamente utilizada en países desarrollados con el objeto de evaluar en forma efectiva y eficiente los efectos tóxicos agudos y crónicos de la contaminación en los organismos vivos. Se conocen más de 200 bioensayos de corta duración que permiten detectar los efectos genotóxicos y potencial

mutagenicidad de

contaminantes

ambientales u otros agentes. En las últimas décadas los efectos mutagénicos han sido evaluados utilizando plantas superiores y sistemas microbiológicos. Dentro de los bioensayos mas utilizados para el estudio de mutaciòn génica y aberraciones

cromosómicas

podemos

citar:

Test

de

aberraciones

cromosómicas en raíces de Allium cepa/Vicia faba, Test de mutación de pelos estaminales de Tradescantia paludosa, mutación de micronúcleos de Tradescantia y el Test de mutación embrional de Arabidopsis thaliana. Entre los microorganismos más empleados para evaluar estos procesos se encuentran, cepas de Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli y Salmonella typhimurium que producen cambios en la mitosis, en la conversión genética, en el crossing over etc. El contenido de DNA de los procariotas no está protegido como el de los eucariotas, de allí que los ensayos con plantas superiores que son sistemas eucarióticos tienen estrecha relación con sistemas eucarióticos animales y humanos. Las plantas tienen una activación metabólica, semejante a animales y una capacidad de reparar su DNA ante alteraciones genéticas por mecanismos similares a los humanos. En las raíces de plantas se producen varios tipos de aberraciones tales como células binucleadas, metafases arrestadas, aglutinación de cromosomas, células poliploides, cromosomas fragmentados, etc. Las principales ventajas de estos bioensayos con plantas son simplicidad en el manejo de las técnicas, realizables en cortos períodos de tiempo, rápidos resultados, bajo costo y alta sensibilidad. No se requieren condiciones estériles para realizar estos test, como en los estudios microbiológicos, la mayoría se

realiza en condiciones in vivo los cuales dan una respuesta real de la vida. Se puede hacer un relevamiento a gran escala de muchos agentes en el menor tiempo posible. Además las plantas pueden manifestar los efectos genotóxicos causados por sobredosis y daños fisiológicos visibles. Estos parámetros secundarios pueden ser usados para determinar la dosis apropiada para mutágenos y antimutágenos usados en experimentación.

ACIDOS NUCLEICOS: DIVISION CELULAR Los ácidos nucleicos, son las “macromoléculas informativas de la célula viva” conocidos como DNA y RNA, los cuales son polinucléotidos cuyas moléculas equivalen a secuencias lineales de nucleótidos. En todos los organismos celulares, tanto procariotas como eucariotas, el DNA sirve para almacenar y multiplicar (replicar) la información hereditaria; el RNA, en cambio sirve para realizarla. El proceso vital de multiplicación y reproducción lo cumple el DNA (función autocatalítica: produce síntesis de más moléculas de DNA sólo él puede replicarse a excepción del RNA de virus y viroides)) al mismo tiempo organiza las secuencias de los RNA y, a través de ellos las secuencias de aminoácidos de las moléculas proteicas. Mediante esta función heterocatalítica el DNA puede manifestar la información genética, y los factores hereditarios (genes o genotipo) se hacen visibles en forma de fenes o fenotipo (caracteres externos del organismo). Los ácidos nucleicos están contenidos en el núcleo celular en forma de cromatina, sustancia fundamental que constituye la base física de la herencia. El núcleo por lo general es esférico y lenticular, se encuentra incluido dentro de la masa citoplasmática y está limitado por una doble membrana llamada carioteca, además puede contener 2 o más cuerpos esféricos, refringentes denominados nucleolos, ricos en RNA, donde se forman las sustancias precursoras de los ribosomas que luego son expulsadas del núcleo. El nucleolo suele desaparecer durante las primeras etapas de la división celular para reaparecer en las etapas finales de la misma. El núcleo controla todo el citoplasma ya que posee las instrucciones para la formación de proteínas, es decir los materiales de los que dependen todas las estructuras y funciones celulares. Cuando se produce la división o multiplicación celular estas

instrucciones deben replicarse y cada una de las células hijas recibe un duplicado que se logra por la cariocinesis o división mitótica del núcleo. La división celular es el fenómeno mediante el cual los organismos aumentan el número de las células somáticas, o bien dan origen a las células sexuales o gametas. En la mayoría de los organismos todo el proceso de división y reproducción celular se conoce con el nombre de ciclo celular (Figura 1). Este ciclo celular se compone fundamentalmente de tres procesos. El primero de ellos conocido como interfase está relacionado con la replicación del DNA y las proteínas que conforman los cromosomas. El segundo proceso la mitosis (Figuras A-I) o división nuclear, en la que de un núcleo se originan dos núcleos hijos con la misma herencia, es decir que las dos dotaciones cromosómicas con ayuda del huso mitótico se distribuyen exactamente igual entre los dos núcleos hijos resultantes. El tercero, la citocinesis o división citoplasmática comprende la división de las células de tal modo que cada mitad reciba un núcleo y la mitad del citoplasma. La mitosis va unida frecuentemente a la citocinesis pero no siempre. ESQUEMA CICLO CELULAR Figura 1

Interfase: primera fase del ciclo celular necesaria en la preparación para la mitosis, es la verdadera fase de trabajo de la cromatina. Es el período en el cual la cromatina celular se duplica y el material genético se replica fielmente. Dura más que toda la mitosis. Gracias a investigaciones con isótopos se ha sabido que la replicación del DNA cromosómico se produce en un período intermedio de la interfase. A este período se le llama fase S (de síntesis de ADN), además durante toda la interfase se forman RNA y proteínas, tanto histonas como no histonas, previo a la fase S se encuentra la fase G 1 (período de crecimiento celular previo a la replicación de ADN) y una fase G 2 (período de crecimiento posterior a la replicación de ADN y preparación para la mitosis por tanto la interfase es un período de síntesis y crecimiento. Existe una fase G 0 donde el ciclo celular se detiene en la fase mitótica la célula no se divide y se produce la diferenciación que dará lugar a una célula hística o madura. Mitosis: segunda fase del ciclo celular en la cual se produce la división nuclear, los dos núcleos hijos contienen el mismo número y tipo de cromosomas. Para simplificar la descripción del proceso de la mitosis se la ha dividido en cuatro fases: Profase, Metafase, Anafase y Telofase. (Figura 1). En las células de los meristemas el ciclo celular es permanente, se encuentran en activa división mitótica y persisten en el cuerpo de las plantas desarrolladas. Por lo general poseen paredes delgadas, protoplasma denso, vacuolas pequeñas y núcleo grande. La mitosis se detiene cuando pasa a la etapa de diferenciación o de células hísticas. Teniendo en cuenta las características histológicas del meristema, en el práctico, se determinará la actividad genotóxica de extractos vegetales sobre las raíces de Allium cepa.

A. Interfase Hacia el final de la interfase, la cromatina (que ya se a duplicado) se condensa formando cromosomas.

B-C-D. Profase Comienza la mitosis. Los cromosomas son claramente distinguibles bajo el microscopio óptico. Son de Naturaleza doble. Se comienzan a formar los microtúbulos del huso mitótico. La membrana nuclear se colapsa totalmente. El nucleolo desaparece.

E. Metafase temprana

F. Metafase Tardía

El centrómero de cada cromosoma se adhiere a los microtúbulos del huso en formación. Cada cromosoma es conducido hacia el ecuador celular por los microtúbulos.

Se han completado en este momento las fibras del aparato del huso. Los microtúbulos mas cortos se adhieren en el centrómero para conectar cada cromátida con un polo. Otros microtúbulos corren de un polo al otro.

H. Telofase Temprana Se comienzan a condensar vesículas en la nueva placa celular. Comienzan a formarse también las nuevas membranas celulares cuando los cromosomas llegan a los polos.

G. Anafase Cada centrómero se divide, lo cual permite la separación de las cromátidas hermanas. Los microtúbulos del aparato del huso guían a las dos cromátidas de cada cromosoma hacia los polos.

I. Telofase tardía La nueva membrana nuclear ya está completa y la cromatina de los cromosomas se despliega. También se termina la nueva pared celular entre las dos células recién formadas.

Test de aberraciones cromosómicas de Allium cepa Es un bioensayo de toxicidad aguda (72 hs) semiestático. El bulbo de Allium cepa posee el tallo reducido a un órgano cónico, pequeño, llamado disco caulinar, cubierto por catáfilas nutricias reservantes y por catáfilas externas de protección a partir del cual se originan raíces adventicias. Cuando los bulbos son rehidratados se activa la brotación y se estimula el crecimiento de la planta iniciándose el crecimiento de las raíces. Sin embargo ante la presencia de sustancias tóxicas, la división celular de los meristemas radiculares puede afectarse retardando el proceso de mitosis o alterando algún proceso de elongación de las células radiculares, produciéndose además aberraciones cromosómicas. Esta clase de alteraciones inhibe el crecimiento normal de la raíz por lo que la fitotoxicidad de un compuesto puede ser determinada a través de la medición de este parámetro. La concentración del extracto necesaria para producir la inhibición al 50% del crecimiento en longitud de las raíces, se conoce como CILr50 (concentración inhibitoria de longitud radicular 50). A partir de esta dosis se analiza la genotoxicidad de los extractos a distintas concentraciones para precisar cual es la dosis menos tóxica.

PARTE PRACTICA

1- OBJETIVOS  Aplicar el Test de aberraciones cromosómicas para comprobar la fitotoxicidad de extractos vegetales.  Determinar la actividad genotóxica de extractos vegetales sobre los ápices radiculares de bulbos de cebolla.

2- REACTIVOS Y MATERIAL BIOLÓGICO

.Bulbos de cebolla (Allium cepa), preferentemente pequeños y de igual tamaño. .Recipientes de 4 cm de diámetro por 5 cm de altura. .Matraces aforados de 500 - 1000 ml para hacer las diluciones. .Pipetas volumétricas. .Probetas

.Regla u otro elemento de medición. .Agua mineral o Medio nutritivo de Hoagland .Extractos vegetales preparados según técnica de prácticos anteriores. .Lupa .Microscopio .Porta y cubreobjetos .Orceína al 5% o Carmín acético al 2% en ácido acético al 45% .Reactivo de Schiff 3- TEST DE ALLIUM CEPA L.

Para la realización de este bioensayo los bulbos deben limpiarse eliminando las catáfilas externas secas y removiendo, con un cuchillo o instrumento punzante, los restos de tejido y raíces del área radicular, evitando en lo posible dañar los primordios radiculares. Se colocan en agua durante 48 horas, hasta que se produce el crecimiento de los ápices radiculares y luego se ponen en contacto con extractos vegetales, en concentraciones crecientes (100 - 10000 ppm). Se realizan los correspondientes controles de agua destilada y alcohol de la graduación correspondiente a los extractos vegetales, y controles positivos (dicromato de potasio) y se dejan en contacto durante 48 a 96 horas. Los ensayos se realizan por triplicado, tomándose muestras cuando se han completado de 2-4 ciclos de división celular. Transcurrido el tiempo de contacto con el extracto, se mide la longitud de las raíces y se determina la fitotoxicidad del mismo por inhibición del crecimiento en longitud. La concentración del extracto donde se produce la inhibición al 50% del crecimiento en longitud de las raíces, se conoce como CILr50 (concentración inhibitoria de longitud radicular 50). Se observa el aspecto macroscópico de las mismas a la lupa para evaluar la presencia de anomalías (necrosis, tumores, ganchos ,etc.) Una vez determinada la CILr

50

se analiza la genotoxicidad de los extractos

llevando los bulbos a agua para reanudar el ciclo celular normal de las cebollas y así observar a qué concentración se producen aberraciones cromosómicas o anomalías microscópicas.

ANALISIS CITOGENETICO

Para efectuar este análisis se cortan de 5 - 15 ápices radiculares, los cuales se fijan en etanol absoluto - ácido acético (3:1, v:v ) durante 18 a 24 horas. Luego se conservan en etanol 70 % a

4º C. Los ápices radiculares se

hidrolizan en HCl 1N a 60 ºC durante 5 - 10 minutos o a temperatura ambiente durante 20 - 60 minutos. Posteriormente se pone en contacto con una gota de Reactivo de Schiff durante 15 minutos en oscuridad. Se realizan preparados microscópicos, aplicando la técnica de aplastado (squash), en orceína acética, o carmín acético. Se analizan 5 campos por muestra, observando microscópicamente 7500 células. Se calcula el índice mitótico determinado por el cociente entre el número de células en división y el número total de células observadas ( % IM ), índice de fases mitóticas y frecuencia de anomalías microscópicas (células binucleadas, citoplasma granuloso, micronúcleos, cmitosis, puentes, cromosomas fragmentados, etc.) cuyos valores se expresarán en las tabla correspondiente.

RESULTADOS

.Efectuar la medición de las raíces y obtener el promedio de las tres repeticiones, descartando los valores extremos. El efecto fitotóxico se expresa como porcentaje de inhibición respecto del control. .Calcular los índices para las distintas etapas de división celular y expresarlos en la tabla. .Observar a la lupa y dibujar detalladamente las alteraciones o daños producidos sobre las raíces a las diferentes diluciones ensayadas. .Observar al microscopio óptico las aberraciones o anomalías de las mismas.

CONTR OL AGUA

PARAMET RO

CONTR OL POSITIV O

CONTR OL 100 ppm

CONTR OL 1000 ppm

CONTR OL 10000 ppm

EXTRA CTO 100 ppm

M I% RL [mm] MA % Ma % II % PI% PM I % MI % A I % TI %

MI % RL [mm] MA % Ma % II %

: Indice mitótico (Frecuencia de divisiones mitóticas) : Longitud de raíz : Aberraciones macroscópicas : Aberraciones microscópicas : Indice interfásico

PI%

: Indice Profásico

PM I % MI% A I % TI %

: Indice Prometafásico : Indice Metafásico : Indice Anafásico : Indice Telofásico

Fitoterapia: Diseño de un trabajo práctico. Análisis de la factibilidad de su realización en el laboratorio. Preparación de una monografía.

Los objetivos planteados para este trabajo práctico son:

Que el alumno:

A) Diseñe un trabajo práctico en el que se demuestren las propiedades medicinales de plantas utilizadas popularmente como medicinales en Argentina. B) Realice un análisis de la factibilidad de realización en las instalaciones del laboratorio de Fitoquímica en base a la infraestructura disponible.

Para ello: El alumno deberá: 1- Realizar una adecuada búsqueda bibliográfica sobre el tema sugerido por la Cátedra utilizando los recursos disponibles. 2- Establecer hipótesis y planteos experimentales que le permitan validar los usos populares de las plantas seleccionadas 3- Evaluar los recursos disponibles en la Cátedra para realizar los análisis químicos/biológicos, utilizando metodología moderna y ensayos que puedan ser realizados en un trabajo práctico de no mas de 3 horas 4- Realizar la experimentación en el laboratorio para comprobar la factibilidad de realización 5- Elaborar una monografía que deberá tener la estructura de una guía de trabajos prácticos: Marco teórico y diseño experimental. 6- Exposición oral del trabajo realizado

Para cumplir con estos objetivos: Se sugiere la formación de grupos de trabajos de hasta cuatro alumnos El proyecto debe ser elaborado durante el cuatrimestre de manera que la monografía se presente al finalizar los trabajos prácticos.

El docente guía atenderá todas las consultas necesarias para lo cual establecerá un cronograma de trabajo con los distintos grupos.