RESUMEN

Salmonella enterica serovar Typhimurium es un patógeno intracelular facultativo que muestra una tasa de proliferación reducida tras infectar fibroblastos in vitro. El sistema de dos componentes PhoP-PhoQ está implicado en el fenómeno del control de la proliferación intracelular. En esta Tesis hemos examinado el patrón de expresión génica global de fibroblastos infectados in vitro con la estirpe silvestre y con el mutante phoP de Salmonella mediante la tecnología de “microarrays”. Los resultados indican que los fibroblastos responden a la infección aumentando principalmente los niveles de expresión de genes relacionados con respuesta inmune innata. Además, hemos analizamos los cambios de expresión del genoma de la estirpe silvestre y el mutante phoP de Salmonella serovar Typhimurium durante la infección de fibroblastos. Los resultados revelan información novedosa sobre el estilo de vida intracelular de Salmonella en cuanto a funciones y necesidades energéticas, metabólicas, de nutrición y con mecanismos de supervivencia y virulencia de la bacteria.

Palabras clave: Salmonella, fibroblastos, patógeno intracelular, sistema PhoP-PhoQ, isla de patogenicidad, “microarrays”, atenuación del crecimiento intracelular.

SUMMARY

Salmonella enterica serovar Typhimurium is a facultative intracellular pathogen that remains in a non proliferative state upon infecting fibroblasts in vitro. Salmonella utilizes the twocomponent system PhoP-PhoQ to down-regulate the intracellular growth rate within fibroblasts. In this Thesis, we examined the gene expression program in fibroblasts infected in vitro with the wildtype or the overgrowing phoP mutant of Salmonella using microarray technology. The results showed that fibroblasts respond to the Salmonella infection by increasing the transcription levels of genes linked to inflammation. We also addressed the analysis of the transcriptional profile of wildtype and phoP mutant of S. enterica serovar Typhimurium upon fibroblast infection. This analysis has revealed that 138 genes were differentially expressed only by intracellular wild-type bacteria. Our results have provided novel information about the intracellular lifestyle of Salmonella concerning to energy metabolism, nutrition and mechanisms involved in survival and virulence.

Keywords: Salmonella, fibroblasts, PhoP-PhoQ system, pathogenicity island, microarrays, intracellular growth attenuation.

UN NIVERS SIDAD AUTÓNO A OMA DE E MADR RID FACULT TAD DE CIIENCIAS DEPART TAMENTO DE BIOLO OGÍA MOL LECULAR

ESTU UDIO DE D LA IN NTERAC CCIÓN Salmoneella-FIB BROBLA ASTO MED DIANTE TRANS SCRIPT TÓMICA A: CARA ACTERIIZACIÓN N DE RESPUE ESTAS LIGAD DAS A LA ATEN NUACIÓ ÓN DEL L C CRECIM MIENTO O INTRA ACELULAR DE EL PATÓGENO O

TE ESIS DOC CTORAL

CRISTIN NA NÚÑEZ HERNÁND DEZ 2 Madrid 2008

Memoria presentada por Cristina Núñez Hernández para optar al grado de Doctor en Ciencias por la Universidad Autónoma de Madrid

Director de Tesis

Dr. Francisco García del Portillo

La realización de este trabajo ha sido posible gracias a las ayudas a la investigación recibidas del Ministerio de Ciencia e Innovación (GEN2003-20234-C06) y de la Consejería de Educación de la Comunidad de Madrid (beca del programa de Formación de Personal Investigador 7580/2003).

A mis padres

AGRADECIMIENTOS Durante estos más de cuatro años desde que empecé el doctorado he tenido la oportunidad de conocer personas extraordinarias y vivir momentos únicos que recordaré siempre. Quizás esto haya sido el motor que me empujó en muchos de los momentos difíciles que he pasado durante este tiempo. A todos ellos, GRACIAS. Cuando decidí realizar el doctorado e introducirme “formalmente” en el mundo de la investigación, Francisco García del Portillo me dio la oportunidad de entrar a formar parte de su laboratorio. Paco, gracias por haber depositado tu confianza en mí para sacar adelante este trabajo y por tu constante optimismo. Quiero agradecer a José Berenguer, mi tutor, por su amabilidad y disposición siempre que he necesitado su ayuda, su consejo o simplemente su “firma”. A Armando Reyna, gracias por darme a conocer el lado divertido de la investigación, por las estimulantes e interminables “conversas” sobre ciencia, por ayudarme a mantener la ilusión y por estar siempre pendiente de mis progresos a pesar de la distancia. Al servicio de Genómica del CNB, en especial a Irene, Manuel y Juan Carlos Oliveros. A todas aquellas personas con las que coincidí en el 280 y de las cuales intenté siempre aprender lo mejor. A Alberto, Gustavo, Leticia, Charo, Fátima, Laura, Ana Alonso, Valentina, Mónica, Ana Aiastui, Javier, Graciela, Blanca, Jose, Pilar, Natalia y Lorena. Gracias por ayudarme en las miles de dudas que me surgieron en estos cuatro años y por los momentos divertidos que hacían el día a día mucho más agradable. A Charo, por siempre estar dispuesta a ayudarme en todo con una sonrisa en la cara. A Javier, por enseñarme los miles de truquitos en el ordenador. A Laura y a Fátima, por escucharme en tantas ocasiones y hacer las tardes más dulces compartiendo “chuches” de gordas. A Leticia, porque además de ayudarme con mis experimentos (fue la creadora de “etiquetor”) y de los momentos de risas, se convirtió en un gran apoyo para mí dentro del laboratorio. Quiero agradecer a Gustavo por siempre estar dispuesto a responder con dedicación a mis miles de “preguntitas” durante mis primeros meses en el laboratorio y por poner su empeño y esfuerzo en ayudarme de forma desinteresada y sincera en muchos aspectos de este trabajo. ¡Gracias súper Gus! A Alberto, mi panita. Gracias por tu dedicación y preocupación. Por haber escuchado pacientemente todos mis rollos y enseñarme a ver las cosas con serenidad la mayoría de las veces. Por las conversaciones sobre ciencia que muchas veces iniciaban soluciones y por tu valiosa ayuda durante la elaboración de este trabajo. Gracias además por los buenos e inolvidables ratos de risas, por Alfredo y la Bratz y por tus e-mails, que me hacían reír incluso en los días más torcidos. A Chema, por estar a mi lado siempre. Gracias por tu bondad y paciencia, por aguantar mis malos humos en los días más tensos y siempre con un buen consejo al final. Por aprender conmigo, incluso sobre Salmonella, con la intención de ayudarme. Gracias pitu por ser mi columnita. A mi hermano Raúl y a mis padres. Son tantas las cosas que os tengo que agradecer… desde el simple gesto de preguntarme cómo me había ido con las células, el microscopio y los eppendorfs, hasta el hecho de escucharme, hacerme ver el lado positivo de todo y tratar de guiarme hacia la dirección adecuada. Gracias porque sé que sin vuestra ayuda, apoyo y paciencia, este camino habría sido mucho más difícil.

 

ÍNDICE Listado de figuras .................................................................................................................

v

Listado de tablas .................................................................................................................. viii Listado de abreviaturas .........................................................................................................

x

Summary ..............................................................................................................................

xi

INTRODUCCIÓN ...............................................................................................................

1

EL GÉNERO Salmonella. TAXONOMÍA ......................................................................

3

PATOLOGÍAS ASOCIADAS A INFECCIONES POR Salmonella ..............................

4

Enterocolitis .................................................................................................................

4

Fiebre tifoidea ..............................................................................................................

5

Bacteriemia ..................................................................................................................

6

ELEMENTOS GENÉTICOS ASOCIADOS A LA VIRULENCIA DE Salmonella .......

7

Plásmido de virulencia .................................................................................................

7

Islas de patogenicidad ..................................................................................................

7

El sistema de dos componentes PhoP-PhoQ ................................................................ 11 INTERACCIÓN DE Salmonella CON DISTINTOS TIPOS CELULARES EN MODELOS in vitro ......................................................................................................... 13 Comportamiento de Salmonella en el interior de células epiteliales ............................ 13 Comportamiento de Salmonella en el interior de macrófagos ..................................... 15 Comportamiento de Salmonella en el interior de células dendríticas .......................... 16 Comportamiento de Salmonella en el interior de fibroblastos ..................................... 16 INTERACCIÓN DE Salmonella CON CÉLULAS DEL HOSPEDADOR EN MODELOS ANIMALES ................................................................................................. 17 ESTUDIOS GLOBALES DEL PROCESO DE INFECCIÓN POR Salmonella ............. 19

i

OBJETIVOS .....................................................................................................................

23

MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................

27

MATERIAL BIOLÓGICO ............................................................................................

29

Estirpes bacterianas y plásmidos ................................................................................

29

Bacteriófagos .............................................................................................................

29

Anticuerpos ................................................................................................................

29

Líneas celulares eucariotas .........................................................................................

30

MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO ................................................................

30

Cultivo de bacterias ....................................................................................................

30

Cultivo de células eucariotas ......................................................................................

31

GENÉTICA BACTERIANA .........................................................................................

32

Electroporación de Salmonella ...................................................................................

32

Preparación de lisados de bacteriófagos P22 .............................................................

32

Transducción en medio líquido ..................................................................................

32

Etiquetado de proteínas de Salmonella ......................................................................

33

INFECCIÓN DE CULTIVOS CELULARES ...............................................................

34

Ensayo de infección de fibroblastos con Salmonella .................................................

34

Índice de proliferación intracelular ............................................................................

35

PREPARACIÓN DE EXTRACTOS DE PROTEÍNAS ................................................

35

Proteínas totales de Salmonella en medios de cultivo ................................................

35

Proteínas totales de fibroblastos infectados con Salmonella ......................................

35

ENSAYOS DE DETECCIÓN DE PROTEÍNAS ..........................................................

36

Microscopía de inmunofluorescencia .........................................................................

36

Inmunodetección de proteínas en soportes de membranas (“Western blot”) .............

37

AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS ................................................................ 37

ii

Extracción de ADN genómico de Salmonella ............................................................

37

Extracción de ARN ...................................................................................................... 38 ENSAYOS DE TRANSCRIPTÓMICA CON “MICROARRAYS” ............................... 40 Análisis del patrón de expresión global de fibroblastos infectados con Salmonella .... 40 Análisis de los cambios de expresión del genoma de Salmonella en el interior de fibroblastos ................................................................................................................... 42 ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA MEDIANTE RT-PCR CUANTITATIVA ...... 45 Transcripción reversa de ARN ..................................................................................... 45 PCR cuantitativa .......................................................................................................... 45 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS .......................................................................................... 46 RESULTADOS ................................................................................................................... 47 CAPÍTULO 1. Análisis global de la respuesta de fibroblastos a la infección por Salmonella enterica serovar Typhimurium ..................................................................... 49 CAPÍTULO 2. Estudio de transcriptómica de Salmonella enterica serovar Typhimurium en el interior de fibroblastos ...................................................................... 69 Optimización de protocolos de obtención de ARN de Salmonella en el interior de fibroblastos infectados ............................................................................................ 71 Expresión del genoma de S. enterica durante la infección de fibroblastos .................. 73 Validación de los resultados de transcriptómica obtenidos en Salmonella intracelular ................................................................................................................... 95 Expresión de las proteínas MgtA, MgtB, MgtC y PagC en bacterias localizadas en el interior de fibroblastos ......................................................................................... 99 Expresión y secreción de SopB en Salmonella intracelular ......................................... 103 Contribución de las proteínas efectoras PipB y PipB2 a la supervivencia de Salmonella durante la infección de fibroblastos .......................................................... 110 Secreción de PipB, PipB2 y SseJ por Salmonella intracelular tras la infección de fibroblastos ................................................................................................................... 112 Regulación de la expresión de SPI-2 del serovar Typhimurium en el interior de fibroblastos ................................................................................................................... 129

iii

DISCUSIÓN ...................................................................................................................... 139 La respuesta del fibroblasto a la infección por Salmonella ........................................ 141 Estilo de vida de Salmonella en el interior de la vacuola del fibroblasto ................... 144 Factores de virulencia de Salmonella con expresión ligada a la ausencia de crecimiento en la vacuola del fibroblasto ................................................................... 148 El regulón PhoP-PhoQ de Salmonella durante la infección de fibroblastos .............. 150 Regulación de SPI-2 en Salmonella dentro de la vacuola del fibroblasto .................. 152 CONCLUSIONES ............................................................................................................ 163 BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................. 167 ANEXO I ........................................................................................................................... 183 ANEXO II .......................................................................................................................... 191 ANEXO III ........................................................................................................................ 213 ANEXO IV ........................................................................................................................ 225

iv

LISTADO DE FIGURAS Figura 1. Índice de proliferación (Ipro) de la estirpe silvestre SV5015 de S. enterica serovar Typhimurium y el mutante isogénico phoP (MD1120) en el interior de la línea de fibroblastos NRK-49F ..................................................................

52

Figura 2. Comportamiento de S. enterica serovar Typhimurium en el interior de la línea de fibroblastos NRK-49F a las 24 horas post-infección ..............................................

52

Figura 3. Número de genes de fibroblastos NRK-49F diferencialmente expresados tras 6 horas de infección con la estirpe silvestre SV5015 de S. enterica serovar Typhimurium o el mutante MD1120 (phoP) con respecto a fibroblastos sin infectar .........

53

Figura 4. Gráfico MA de los valores de expresión de genes de fibroblastos NRK-49F después de 6 horas de infección con la estirpe silvestre SV5015 de S. enterica serovar Typhimurium, con respecto a los registrados en fibroblastos no infectados .......................

55

Figura 5. Gráfico MA de los valores de expresión de genes de fibroblastos NRK-49F después de 6 horas de infección con el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium, con respecto a los registrados en fibroblastos no infectados ..........

56

Figura 6. Niveles de expresión de los genes ccl20, cinc-1, cinc-2β y cinc-3 de fibroblastos NRK-49F infectados con la estirpe silvestre SV5015 o el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium cuantificados por RT-PCR cuantitativa ........

62

Figura 7. Niveles de expresión de los genes icam-1, rip-2 y mmp-3 de fibroblastos NRK-49F infectados con la estirpe silvestre SV5015 o el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium cuantificados por RT-PCR cuantitativa ....................

63

Figura 8. Niveles de expresión de genes de fibroblastos NRK-49F infectados con la estirpe silvestre SV5015 o el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium cuantificados por RT-PCR cuantitativa ........................................................

65

Figura 9. Electroferogramas en los que se muestra la calidad del ARN extraído ..............

72

Figura 10. Esquema de las comparaciones realizadas entre los patrones globales de expresión génica de S. enterica serovar Typhimurium en las diferentes condiciones utilizadas ..............................................................................................................................

73

Figura 11. Número de genes de S. enterica serovar Typhimurium diferencialmente expresados (-2 > M > 2, valor p < 0,1) en el ambiente intracelular de fibroblastos NRK-49F con respecto al medio LB ...................................................................................

77

Figura 12. Expresión de genes relacionados con el metabolismo del carbono en la estirpe silvestre (SV5015) y el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium .......................................................................................................................

87

Figura 13. Expresión de los genes del flagelo, quimiotaxis y fimbrias en la estirpe silvestre (SV5015) y el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium .......................................................................................................................

89

v

Figura 14. Expresión de los genes relacionados con el transporte de iones inorgánicos en la estirpe silvestre (SV5015) y el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium ......................................................................................................................

90

Figura 15. Expresión de genes de las islas de patogenicidad de la estirpe silvestre (SV5015) y el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium ..................

93

Figura 16. Expresión de genes que codifican proteínas efectoras de SPI-2 en la estirpe silvestre (SV5015) y el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium ....

94

Figura 17. Cuantificación de los niveles de expresión de genes de la estirpe silvestre (SV5015) y el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium relacionados con SPI-1 y SPI-2 a distintos tiempos de la infección de fibroblastos NRK-49F ............................................................................................................................

97

Figura 18. Cuantificación de los niveles de expresión de genes de la estirpe silvestre (SV5015) y el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium relacionados con el sistema PhoP-PhoQ a distintos tiempos de la infección de fibroblastos NRK-49F ............................................................................................................................ 98 Figura 19. Cuantificación de los niveles de expresión de los genes mgtA, mgtB y mgtC de la estirpe silvestre (SV5015) y el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium en el medio de cultivo N mediante RT-PCR cuantitativa ...............

99

Figura 20. Inmunodetección de las proteínas MgtA, MgtB, MgtC y PagC de S. enterica serovar Typhimurium tras la infección de fibroblastos NRK-49F .................... 101 Figura 21. Inmunodetección de las proteínas MgtA y MgtB de S. enterica serovar Typhimurium tras la infección de fibroblastos NRK-49F ................................................... 102 Figura 22. Localización subcelular de SopB durante la infección de fibroblastos NRK-49F con S. enterica serovar Typhimurium (estirpe silvestre) ................................... 105 Figura 23. Localización subcelular de SopB durante la infección de fibroblastos NRK-49F con S. enterica serovar Typhimurium (mutante phoP) ...................................... 107 Figura 24. Inmunodetección de SopB en S. enterica serovar Typhimurium intracelular .......................................................................................................................... 109 Figura 25. Índice de proliferación (Ipro) de la estirpe silvestre SL1344 y los mutantes MD1954 (ΔpipB), MD1955 (ΔpipB2) y MD1956 (ΔpipBΔpipB2) y de los mutantes SV4056 (phoP), MD1126 (phoPΔpipB), MD1127 (phoPΔpipB2) y MD1128 (phoPΔpipBΔpipB2) de S. enterica serovar Typhimurium en el interior de fibroblastos NRK-49F. ........................................................................................................................... 111 Figura 26. Localización de PipB durante la infección de fibroblastos NRK-49F con S. enterica serovar Typhimurium (estirpe silvestre) ............................................................... 115 Figura 27. Localización de PipB durante la infección de fibroblastos NRK-49F con S. enterica serovar Typhimurium (mutante phoP) ............................................................. 117 Figura 28. Localización de PipB2 durante la infección de fibroblastos NRK-49F con S. enterica serovar Typhimurium (estirpe silvestre) ........................................................... 119

vi

Figura 29. Localización de PipB2 durante la infección de fibroblastos NRK-49F con S. enterica serovar Typhimurium (mutante phoP) .............................................................. 121 Figura 30. La proteína PipB2 se localiza en zonas periféricas de fibroblastos NRK-49F infectados con S. enterica serovar Typhimurium ................................................................ 123 Figura 31. Localización de SseJ durante la infección de fibroblastos NRK-49F con S. enterica serovar Typhimurium (estirpe silvestre) ............................................................ 125 Figura 32. Localización de SseJ durante la infección de fibroblastos NRK-49F con S. enterica serovar Typhimurium (mutante phoP) .............................................................. 127 Figura 33. Inmunodetección de las proteínas SsrB, PipB, PipB2 y SseJ en S. enterica serovar Typhimurium intracelular ....................................................................................... 131 Figura 34. Inmunodetección de las proteínas SsrB, PipB, PipB2 y SseJ en S. enterica serovar Typhimurium intracelular ....................................................................................... 133 Figura 35. Inmunodetección de las proteínas SsrB y PipB en S. enterica serovar Typhimurium intracelular .................................................................................................... 134 Figura 36. Índice de proliferación (Ipro) de la estirpe silvestre SL1344 y los mutantes SV4056 (phoP), SV4237 (ssrA), SV4241 (phoP ssrA), SV4235 (ompR) y SV4236 (phoP ompR) de S. enterica serovar Typhimurium en el interior de la línea de fibroblastos NRK-49F ......................................................................................................... 135 Figura 37. Distribución de bacterias intracelulares en el interior de fibroblastos NRK-49F ......................................................................................................... 137 Figura 38. Modelo propuesto para la regulación de SPI-2 durante la infección de fibroblastos por Salmonella ................................................................................................. 159

vii

LISTADO DE TABLAS

Tabla 1. Genes de fibroblastos NRK-49F inducidos al menos tres veces (M ≥ 1,5;              valor p < 0,05) en respuesta a la infección con las estirpes SV5015 (silvestre) y MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium (6 horas post-infección) ............................... 57 Tabla 2. Genes de fibroblastos NRK-49F inducidos al menos tres veces (M ≥ 1,5;              valor p < 0,05) en respuesta a la infección con la estirpe SV5015 (silvestre) de S. enterica serovar Typhimurium (6 horas post-infección) .................................................................. 59 Tabla 3. Genes de fibroblastos NRK-49F inducidos al menos tres veces (M ≥ 1,5;              valor p < 0,05) en respuesta a la infección con la estirpe MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium (6 horas post-infección) .................................................................. 60 Tabla 4. Genes de fibroblastos NRK-49F reprimidos al menos tres veces (M ≤ -1,5;           valor p < 0,05) en respuesta a la infección con la estirpe SV5015 (silvestre) de S. enterica serovar Typhimurium (6 horas post-infección) .................................................................. 66 Tabla 5. Número de genes de S. enterica serovar Typhimurium diferencialmente expresados en la estirpe silvestre SV5015 o el mutante MD1120 (phoP) en el ambiente intracelular de fibroblastos NRK-49F comparado a condiciones de crecimiento en medio de laboratorio LB (-2 > M > 2, valor p < 0,1) ..........................................................

74

Tabla 6. Genes de S. enterica serovar Typhimurium diferencialmente expresados                  (M > 2, valor p < 0,1) comunes entre la estirpe silvestre SV5015 y el mutante MD1120 (phoP) durante la infección de fibroblastos NRK-49F (24 horas post-infección) en comparación a bacteria en la fase exponencial de crecimiento en medio LB ..................... 78 Tabla 7. Genes de S. enterica serovar Typhimurium diferencialmente expresados                  (M < -2, valor p < 0,1) comunes entre la estirpe silvestre SV5015 y el mutante MD1120 (phoP) durante la infección de fibroblastos NRK-49F (24 horas post-infección) en comparación a bacteria en la fase exponencial de crecimiento en medio LB ..................... 79 Tabla 8. Genes de S. enterica serovar Typhimurium diferencialmente expresados                  (M > 2, valor p < 0,1) en la estirpe silvestre SV5015 durante la infección de fibroblastos NRK-49F (24 horas post-infección) en comparación a bacteria en la fase exponencial de crecimiento en medio LB .................................................................................................... 81 Tabla 9. Genes de S. enterica serovar Typhimurium diferencialmente expresados                  (M < -2, valor p < 0,1) en la estirpe silvestre SV5015 durante la infección de fibroblastos NRK-49F (24 horas post-infección) en comparación a bacteria en la fase exponencial de crecimiento en medio LB .................................................................................................... 83  Tabla A1. Estirpes de Salmonella enterica serovar Typhimurium .................................... 185  Tabla A2. Plásmidos utilizados ......................................................................................... 187  Tabla A3. Oligonucleótidos utilizados en los análisis de PCR cuantitativa ...................... 187  Tabla A4. Oligonucleótidos utilizados para el etiquetado de genes cromosómicos .......... 189 

viii

Tabla A5. Genes diferencialmente expresados (M < -1,5 valor p < 0,05) en fibroblastos NRK-49F infectados con la estirpe silvestre de Salmonella enterica serovar Typhimurium en relación a fibroblastos sin infectar (6 horas p.i.) ...................................... 195 Tabla A6. Genes diferencialmente expresados en la estirpe silvestre de Salmonella enterica serovar Typhimurium en el interior de fibroblastos y en medio LB en la fase estacionaria de crecimiento ................................................................................. 199 Tabla A7. Niveles de expresión de genes de Salmonella enterica serovar Typhimurium relacionados con metabolismo ............................................................................................ 202 Tabla A8. Niveles de expresión de genes de Salmonella enterica serovar Typhimurium relacionados con fimbrias, flagelo y quimiotaxis ................................................................ 204 Tabla A9. Niveles de expresión de genes de Salmonella enterica serovar Typhimurium relacionados con el transporte de iones inorgánicos ............................................................ 207 Tabla A10. Niveles de expresión de genes de Salmonella enterica serovar Typhimurium relacionados con las Islas de Patogenicidad ........................................................................ 208 Tabla A11. Niveles de expresión de los genes de Salmonella enterica serovar Typhimurium que codifican proteínas efectoras de SPI-2 ................................................. 211 Tabla A12. Patrón de expresión génica global de Salmonella enterica serovar Typhimurium ....................................................................................................................... 227

ix

LISTADO DE ABREVIATURAS ADN ADNc ARN ARNa ARNm ARNr ARNt ATP CSIC DAPI DMEM dNTP DO600 EDTA GTP HA IL-18 IL-1β kb LB LPS MMP MTOC NLR ORF p. i. pag PBS PCN PCR prg RNI ROI RT SCV SDS SFB Sifs SPI-1 SPI-2 SPI-3 SPI-4 SPI-5 SST3 STM TLR ufc

Ácido desoxirribonucleico ADN copia Ácido ribonucleico ARN amplificado ARN mensajero ARN ribosomal ARN de tranferencia Adenosín trifosfato Consejo Superior de Investigaciones Científicas 4',6-diamidino-2-fenilindol diclorhidrato Medio de Eagle modificado por Dulbecco Deoxinucleótido trifosfato Densidad óptica a 600 nm de longitud de onda Ácido etilén-diamino-tetraacético Guanosina trifosfato Hemaglutinina Interleuquina 18 Interleuquina 1β kilobase Medio de cultivo Luria y Bertani Lipopolisacárido Metaloproteinasa de matriz Centro organizador de microtúbulos Receptor de tipo NOD Fase de lectura abierta post-infección Genes activados por PhoP (“PhoP-activated genes”) Solución tamponada fosfato salina Medio mínimo fosfato-carbón-nitrógeno Reacción en cadena de la polimerasa Genes reprimidos por PhoP (“PhoP-repressed genes”) Intermediarios de nitrógeno reactivo (“reactive nitrogen intermediate”) Intermediarios de oxígeno reactivo (“reactive oxigen intermediate”) Transcripción reversa Vacuola que contiene a Salmonella (“Salmonella-containing vacuole” Dodecil sulfato sódico Suero fetal bovino Filamentos inducidos por Salmonella (“Salmonella-induced filaments”) Isla de patogenicidad 1 de Salmonella Isla de patogenicidad 2 de Salmonella Isla de patogenicidad 3 de Salmonella Isla de patogenicidad 4 de Salmonella Isla de patogenicidad 5 de Salmonella Sistema de secreción de tipo 3 Mutagénesis de marcaje (“signature-tagged mutagenesis”) Receptor de tipo Toll unidades formadoras de colonias

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SUMMARY Salmonella enterica serovar Typhimurium is a facultative intracellular pathogen that remains in a non proliferative state upon infecting fibroblasts in vitro. Our group has recently observed a similar response in fibroblast-like cells located in the lamina propria of the mouse intestine. Among other bacterial functions, Salmonella utilizes the two-component system PhoP-PhoQ to down-regulate the intracellular growth rate within fibroblasts. This regulatory system regulates hundreds of genes, including important virulence properties as intracellular survival inside macrophages, resistance to antimicrobial peptides, lipopolysaccharide modifications and adaptation to low magnesium environments. In this work, we examined the gene expression program in fibroblasts infected in vitro with the wild-type or the overgrowing phoP mutant of Salmonella using microarray technology. We show that a high proportion of the upregulated genes encode for proteins related to innate immunity, such as cytokines, chemokines and the cell adhesion protein ICAM-1. We also found that some genes encoding proteins related to vesicle traffic and cytoskeleton were downregulated in the wild-typeinfected fibroblasts. The quantitative RT-PCR analyses confirmed expression changes of genes related to innate immune response. These results indicate that fibroblasts respond to the Salmonella infection by increasing the transcription levels of genes linked to inflammation. In this work, we also addressed the analysis of the transcriptional profile of S. enterica serovar Typhimurium upon fibroblast infection. We compared gene expression profile of intracellular wild-type and phoP mutant bacteria. 138 genes that were differentially expressed only by intracellular wild-type bacteria were identified. Almost half of these genes were of unknown function, which suggests that there are uncharacterized functions of Salmonella related to intracellular growth attenuation and survival within fibroblasts. This analysis also has revealed a common transcriptional response in the wild-type and the phoP mutant to the intracellular environment of fibroblasts. This response involves the upregulation of genes associated with ion uptake systems and fatty acid metabolism. Genes encoding the flagellar machinery and genes involved in chemotaxis were downregulated in intracellular bacteria, irrespective of the growth rate. Previous studies have suggested that the PhoP-PhoQ system is required for the intramacrophage expression of genes of the Salmonella pathogenicity island 2 (SPI-2). Here we show the induction of SPI-2-associated genes in the wild-type and phoP mutant within fibroblasts after 24 hours of infection. However, we also provide evidence that the PhoP-PhoQ system and the OmpR protein play an important role in the regulation of SPI-2-associated genes at early times of infection. Moreover, we demonstrated the synthesis of two magnesium transporters of Salmonella, MgtA and MgtB, during infection of fibroblasts. The production of these proteins suggests that the intravacuolar environment is low in magnesium. It is therefore likely that limiting concentrations of magnesium could be one of the activating signals for the PhoP-PhoQ system. In summary, our results have provided novel information about the intracellular lifestyle of Salmonella while staying in a non-growth state inside fibroblasts.

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INTRODUCCIÓN

Introducción

EL GÉNERO Salmonella. TAXONOMÍA El género Salmonella está compuesto por bacilos gram-negativos, móviles e intracelulares facultativos, que pueden ser patógenos para muchas especies de vertebrados. Pertenece a la familia Enterobacteriaceae y se encuentra próximo filogenéticamente a los géneros Escherichia, Shigella y Citrobacter. El genoma de Salmonella tiene un tamaño de aproximadamente 5x106 pares de bases y muestra un 80% de homología con Escherichia coli (McClelland et al., 2001). El género Salmonella debe su nombre al bacteriólogo Joseph Léon Marcel Ligniéres que en 1900 lo sugirió en honor a Daniel Elmer Salmon, quien en 1885 caracterizó los bacilos causantes del “cólera de cerdo” junto a Theobald Smith (Stalheim, 1983). La nomenclatura del género Salmonella ha sufrido numerosos cambios en los últimos años. En la actualidad, mediante el uso de la hibridación ADN-ADN, el análisis electroforético múltiple de enzimas y el análisis comparativo de secuencias de ARN ribosomal se reconocen tres especies, Salmonella enterica, Salmonella bongori y Salmonella subterranea (Euzeby, 1999; Shelobolina et al., 2004; Tindall et al., 2005). Salmonella enterica comprende seis subespecies: enterica (I), salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV) e indica (VI). En total, se han caracterizado más de 2500 serovares en el género Salmonella mediante el análisis de diversidad antigénica en el lipopolisacárido (antígeno O), flagelo (antígeno H) y antígeno capsular Vi (Popoff et al., 2004). Los serovares patógenos para el hombre y otros animales homeotermos se incluyen dentro de S. enterica subespecie enterica. S. bongori, S. subterranea y los serovares de las subespecies salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica se aíslan de animales poiquilotermos y del medio ambiente. A pesar de la relación genética que existe entre los diferentes serovares de Salmonella, éstos difieren en el tipo de enfermedad que ocasionan y en el rango de hospedadores susceptibles de ser infectados. Existe gran variabilidad en la gravedad y las características de las enfermedades que causan, desde infecciones asintomáticas o diarrea, hasta infección sistémica grave que puede culminar con la muerte del hospedador (Baumler, 1997; Shelobolina et al., 2004; Chan et al., 2003). De esta manera, ciertos serovares se han clasificado por tener rango de hospedador restringido, como Typhi y Paratyphi, que sólo infectan humanos y primates superiores, y el serovar Pullorum que infecta solamente aves. Por otra parte, algunos serovares infectan preferentemente un hospedador, causando de forma infrecuente enfermedades en otras especies. Tal es el caso del serovar Choleraesuis, que infecta principalmente cerdos, del serovar Dublin que infecta ganado

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bovino y del serovar Arizonae, que infecta reptiles. Finalmente, existen serovares de amplio espectro de hospedador, con la capacidad para infectar y causar enfermedad en un gran número de especies. En este grupo se encuentran los serovares Typhimurium y Enteritidis que causan enterocolitis en humanos, infección sistémica en ratones e infección asintomática crónica en pollos (Edwards et al., 2002b; Porwollik y McClelland, 2003).

PATOLOGÍAS ASOCIADAS A INFECCIONES POR Salmonella Las infecciones por Salmonella generalmente se adquieren mediante el consumo de agua o alimentos contaminados (Winfield y Groisman, 2003). La exposición a reptiles y anfibios que son portadores frecuentes de la bacteria representa también una fuente de infección (Centers for Disease Control and Prevention, 2008). La infección en el hombre por Salmonella puede conducir a tres tipos de procesos: enterocolitis, fiebre tifoidea y bacteriemia. El empleo de modelos animales que reproducen estos procesos patológicos ha sido de gran valor para el análisis de las bases moleculares y celulares de la infección (Santos et al., 2001). Enterocolitis En el hombre se relaciona comúnmente con infecciones producidas por los serovares Typhimurium y Enteritidis. La enterocolitis usualmente está limitada al intestino donde la bacteria induce una respuesta inflamatoria temprana que genera la infiltración de leucocitos polimorfonucleares (neutrófilos) a la mucosa intestinal (McCormick et al., 1998). Sin embargo, en individuos pertenecientes a los grupos de riesgo (niños, ancianos e inmunodeprimidos) pueden desarrollar cuadros severos de enteritis acompañados de bacteriemia (Doffinger et al., 2005; Hsu et al., 2003). La infección de terneros con el serovar Typhimurium causa enterocolitis con características clínicas y patológicas similares a la enfermedad en humanos, incluyendo la diarrea y la infiltración de leucocitos polimorfonucleares. Esto, junto con el hecho de que el serovar Typhimurium es un patógeno natural del ternero, hacen de la infección de este animal un excelente modelo para el estudio de la patogénesis de la enterocolitis humana (Santos et al., 2003; Santos et al., 2002). Se ha propuesto que durante el proceso de colonización del intestino una proporción de organismos sobrevive al pH bajo del estómago (García-del Portillo et al., 1993a; Smith,

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2003) y a la exposición de sales biliares y péptidos antimicrobianos (Prouty et al., 2004; Selsted et al., 1992). De esta forma, la bacteria alcanza el íleo distal y el ciego donde competiría con la microbiota residente. En esta etapa de la infección, la bacteria se adhiere a la superficie intestinal e invade las células epiteliales y las células M de las placas de Peyer (Frost et al., 1997; Galán, 2001). A nivel celular el modelo más aceptado asigna un importante papel a las células epiteliales en el resultado de la infección. La invasión de Salmonella produce la expresión y secreción de la quimioquina CXCL8 en la pared basolateral de la célula epitelial. CXCL8 es un factor quimiotáctico de los neutrófilos y desencadena la infiltración de este tipo celular a la lámina propia momentos después de la infección. Estos neutrófilos recién llegados, junto con los macrófagos residentes, fagocitan la bacteria que ha atravesado las células de la barrera epitelial intestinal (Eckmann et al., 1993). Posteriormente ocurre una migración masiva de neutrófilos a través del epitelio hacia la luz intestinal (Santos et al., 2002) originada por la secreción del factor quimiotáctico epitelial inducido por el patógeno (PEEC) (McCormick et al., 1998). La liberación de gránulos citotóxicos por parte de los leucocitos polimorfonucleares, así como los efectos de varias moléculas bacterianas que estimulan la respuesta inmune innata del hospedador, resultan en la destrucción de la mucosa intestinal que favorece la secreción de fluidos hacía la luz y el desarrollo de la diarrea (Zhang et al., 2003). Recientemente se ha observado que el tratamiento de ratones con estreptomicina antes de la infección con S. enterica serovar Typhimurium aumenta la colonización de la bacteria en el intestino y favorece el desarrollo de una patología que se asemeja en muchos aspectos a la enteritis en terneros y humanos, con daños en el epitelio intestinal y la generación de un infiltrado rico en células polimorfonucleares (Barthel et al., 2003; Hapfelmeier y Hardt, 2005). Fiebre tifoidea La fiebre tifoidea en humanos se asocia con la infección causada por serovares adaptados al hombre y primates superiores como Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B y Paratyphi C (Santos et al., 2001). Este proceso patológico resulta de la diseminación sistémica de Salmonella desde el intestino a órganos del sistema retículoendotelial. La infección de ratones con el serovar Typhimurium desencadena una enfermedad similar a la fiebre tifoidea humana, por lo que se ha utilizado como modelo de estudio de esta patología. Procesos relacionados con virulencia, y en especial con el crecimiento y

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supervivencia intracelular de la bacteria, se han analizado e identificado en este modelo (Santos et al., 2003). En el modelo de ratón, varios estudios han demostrado que la bacteria puede atravesar el epitelio intestinal por diversas rutas. Entre ellas están la invasión activa de enterocitos y la captación de la bacteria por las células M (García-del Portillo et al., 1999; Mavris y Sansonetti, 2004). Estas últimas son células especializadas que captan antígenos intestinales mediante pinocitosis, transportándolos al interior del tejido linfoide subyacente (placas de Peyer y folículos linfoides) (Jang et al., 2004). La invasión de células M es considerada la principal ruta de entrada de Salmonella en infecciones sistémicas (Santos y Baumler, 2004). Salmonella es también capaz de atravesar el epitelio intestinal usando un mecanismo dependiente de las células dendríticas, sin producirse alteración de la integridad de la barrera epitelial (Niess et al., 2005; Rescigno et al., 2001; Vázquez-Torres et al., 1999). Recientemente se ha demostrado que las células M localizadas en las placas de Peyer y en los folículos linfoides intestinales son la principal ruta de invasión utilizada por Salmonella, siendo minoritaria la captación por células M de la vellosidades intestinales y por las células dendríticas de la lámina propia (Halle et al., 2007). Además de su papel directo en la captación de las bacterias desde el lumen, las células dendríticas inmaduras que abundan en la cúpula subepitelial de las placas de Peyer capturan la bacteria una vez ha atravesado la barrera epitelial, sufren un proceso de maduración y migran hacia las zonas donde se encuentran las células T en las placas de Peyer o hacia los linfonódulos mesentéricos (Niedergang et al., 2004). Estudios recientes han demostrado que la bacteria puede persistir en esta localización en el interior de células fagocíticas hasta aproximadamente un año (Monack et al., 2004). Se ha propuesto que las células dendríticas maduras serían las responsables de la diseminación del serovar Typhimurium al hígado y al bazo a través del torrente sanguíneo (Niedergang et al., 2004; Vázquez-Torres et al., 1999). Bacteriemia En el hombre es un proceso causado por los serovares Choleraesuis y Dublin adaptados a cerdos y a bovinos respectivamente. Es una patología muy poco común en el hombre, siendo los individuos más propensos aquellos que están inmunológicamente comprometidos. La mayoría de estos pacientes desarrollan infecciones locales como meningitis, artritis séptica y osteomielitis. La sintomatología difiere de la enteritis en que en este caso, la bacteria es aislada de la sangre, y la diarrea sólo se produce en un tercio de los casos (Chiu et al., 2004; Zhang et al., 2003; Hohmann, 2001; Santos et al., 2001).

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ELEMENTOS GENÉTICOS ASOCIADOS A LA VIRULENCIA DE Salmonella Plásmido de virulencia Los miembros del género Salmonella han evolucionado mediante la adquisición de funciones de virulencia que han dotado a estos organismos con la capacidad de colonizar el interior de las células eucariotas. En algunos serovares, algunas de estas funciones están codificadas en el denominado plásmido de virulencia (Rotger y Casadesús, 1999). Los serovares Abortusovis, Abortusequi, Choleraesuis, Dublin, Enteritidis, Pullorum, Sendai y Typhimurium de la subespecie I de S. enterica tienen un plásmido de virulencia cuyo tamaño varía según el serovar. En el serovar Typhimurium es de 94,7 kb y contiene un operón denominado spv (Chu y Chiu, 2006). El operón spv consiste de cinco genes, spvRABCD, necesarios para el desarrollo de la infección sistémica por el serovar Typhimurium (Gulig et al., 1993). La expresión de los genes spv se induce en la bacteria cuando se encuentra en el interior de células eucariotas en cultivo y en modelos animales infectados (Wilson et al., 1997; Ygberg et al., 2006). La proteína SpvB modifica y bloquea la polimerización de actina e induce la apoptosis de las células eucariotas infectadas (Kurita et al., 2003; Lesnick et al., 2001). Además, la proteína SpvC, esencial para la virulencia del serovar Typhimurium en ratones (Matsui et al., 2001), podría tener un efecto inhibitorio sobre la respuesta pro-inflamatoria de la célula hospedadora (Mazurkiewicz et al., 2008). Dentro del plásmido de virulencia del serovar Typhimurium se encuentran además otras funciones ligadas a la infección. Tal es el caso del operón pef que codifica fimbrias, estructuras involucradas en la adhesión a la superficie externa de las células hospedadoras (Baumler et al., 1996), y el gen mig-5, que se expresa en el interior de macrófagos y codifica una proteína de función desconocida (Rychlik et al., 2006; Valdivia y Falkow, 1997). Islas de patogenicidad Salmonella comparte gran parte de su contenido genético con E. coli. Sin embargo, en las secuencias del genoma de los aislados de Salmonella obtenidos hasta la fecha se observan grandes inserciones ausentes en E. coli. Se considera que este material genético fue adquirido por la bacteria mediante transferencia horizontal y se denomina isla de patogenicidad (SPI, “Salmonella pathogenicity island”). Estos elementos codifican factores de virulencia necesarios para la colonización y supervivencia dentro del hospedador. La mayoría de las islas de patogenicidad tienen un porcentaje menor de G+C comparado con el promedio de 52% correspondiente a la totalidad del genoma de Salmonella (Edwards et al., 2002b; Schmidt y Hensel, 2004).

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La posible adquisición de las islas de patogenicidad puede explicar la hipotética evolución del género Salmonella en dos grandes etapas. En la primera fase, Salmonella se pudo diferenciar de E. coli mediante la adquisición de la isla de patogenicidad 1 de Salmonella (SPI-1), la cual codifica factores de virulencia requeridos para la infección durante la etapa intestinal. El surgimiento de las dos especies de Salmonella, S. enterica y S. bongori, es considerada la segunda etapa de la evolución, cuando se adquirió la isla de patogenicidad 2 de Salmonella (SPI-2) por la especie S. enterica (Ehrbar y Hardt, 2005; Porwollik y McClelland, 2003). Isla de patogenicidad 1 de Salmonella (SPI-1) Durante su coevolución con sus hospedadores, Salmonella ha podido desarrollar sofisticados mecanismos y herramientas para manipular funciones de la célula hospedadora en su propio beneficio. Un ejemplo son los sistemas de secreción especializados capaces de inyectar proteínas efectoras dentro de la célula hospedadora, como el denominado “sistema de secreción de tipo 3” (SST3). Este sistema tiene un importante papel en la interacción Salmonella-célula hospedadora (Schlumberger y Hardt, 2006). Su estructura básica se compone de una jeringa molecular formada por más de veinte proteínas que abarca desde la membrana interna de la bacteria hasta la membrana externa y contacta, mediante una estructura en forma de canal, con la membrana de la célula hospedadora (Galán y Wolf-Watz, 2006). Este sofisticado aparato media la translocación de factores de virulencia bacterianos a la célula hospedadora (Ly y Casanova, 2007). SPI-1 está localizada en el centisoma 63 del cromosoma de Salmonella, comprende 40 kb (Galán, 2001) y está presente tanto en S. enterica como en S. bongori (Hensel, 2004). En la SPI-1 se codifican todas las proteínas estructurales de un aparato de SST3, varias proteínas efectoras y algunas proteínas reguladoras como HilA, HilC, HilD e InvF. Los genes estructurales y las proteínas efectoras más importantes están codificadas por tres operones: prg/org, inv/spa y sic/sip (Ellermeier y Slauch, 2007). Otras proteínas efectoras secretadas por este SST3 están codificadas en profagos localizados en otras posiciones del genoma (Ehrbar y Hardt, 2005). La proteína HilA es el regulador central de la expresión de SPI-1. Esta proteína activa la expresión de los operones inv/spa y prg/org uniéndose a su región promotora (Eichelberg y Galán, 1999; Ellermeier y Slauch, 2007). InvF es otro regulador transcripcional que induce la expresión tanto de los genes sic/sip como de genes relacionados con SPI-1 que se encuentran en otras localizaciones del cromosoma (Darwin y Miller, 2001). Además de las proteínas reguladoras específicas codificadas en SPI-1, la expresión de este SST3 está influenciada por

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varios reguladores globales como los sistemas de dos componentes OmpR-EnvZ, BarA/SirA y PhoP-PhoQ (Ellermeier y Slauch, 2007; Gerlach y Hensel, 2007). La invasión de células eucariotas no fagocíticas está mediada por SPI-1. Salmonella manipula el citoesqueleto de la célula hospedadora a través de la inyección de proteínas efectoras en el citoplasma de la célula. La acción combinada de estas proteínas induce cambios en el nivel de actividad de determinadas GTPasas de la familia Rho, que producen la reorganización del citoesqueleto de actina (Ly y Casanova, 2007). Como resultado, se forman pliegues en sitios localizados de la membrana (“membrane ruffling”) que engloban la bacteria promoviendo su internalización. La bacteria permanece dentro de una vacuola denominada SCV (“Salmonella-containing vacuole”) (García-del Portillo y Finlay, 1995; Ly y Casanova, 2007). Hasta la fecha se considera que al menos cinco proteínas efectoras de SPI-1 son necesarias para la entrada eficiente de Salmonella en la célula hospedadora: SopE, SopE2, SopB, SipA y SipC (Patel y Galán, 2005). Isla de patogenicidad 2 de Salmonella (SPI-2) SPI-2 tiene un tamaño de 40 kb y se encuentra localizada entre el centisoma 30 y 31 del cromosoma de S. enterica. Al igual que SPI-1, SPI-2 contiene genes que codifican las proteínas de otro SST3. Estos genes están concentrados en una región de aproximadamente 26 kb de longitud. Aquí, un total de 31 genes están organizados en: i) dos operones que codifican componentes del aparato de secreción (ssa), ii) una unidad transcripcional que codifica proteínas efectoras (sse) y chaperonas (ssc) y iii) un operón que codifica las proteínas que comprenden el sistema regulador de dos componentes SsrAB (ssr) (Shea et al., 1996). SPI-2 se expresa durante la fase intracelular de la infección siendo esencial para establecer y mantener la integridad de la SCV como un nicho intracelular en el cual la bacteria pueda sobrevivir y replicarse (Kuhle y Hensel, 2004). Hasta la fecha se conocen veinte proteínas efectoras relacionadas con el SST3 de SPI2 (Haraga et al., 2008). De éstas, sólo tres se codifican en la isla de patogenicidad: SsaB/SpiC, SseF y SseG. El resto de las proteínas efectoras están codificadas en otras regiones del cromosoma, bien en otras islas o isletas de patogenicidad, o en genes asociados a fagos, indicando que han sido adquiridas independientemente por transferencia génica horizontal. Las mutaciones en la mayoría de estos genes afectan levemente o no afectan a la proliferación intracelular y a la virulencia de Salmonella. Se ha postulado que este hecho podría deberse a que diferentes proteínas tengan funciones redundantes (Kuhle y Hensel, 2004).

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La expresión de los genes asociados a SPI-2 está controlada por un sistema regulador local y por sistemas reguladores globales. El sistema de dos componentes SsrAB está codificado dentro de la isla y varios estudios han demostrado que es esencial para la expresión de los genes relacionados con SPI-2 (Cirillo et al., 1998; Lober et al., 2006; Worley et al., 2000). La expresión del sistema SsrAB está controlada por reguladores globales como los sistemas de dos componentes OmpR-EnvZ (Feng et al., 2003; Garmendia et al., 2003; Kim y Falkow, 2004; Lee et al., 2000) y PhoP-PhoQ (Bijlsma y Groisman, 2005; Deiwick et al., 1999), el regulador transcripcional SlyA (Linehan et al., 2005; Navarre et al., 2005) y las proteínas asociadas al nucleoide Fis, H-NS y YdgT (Coombes et al., 2005; Kelly et al., 2004; Lucchini et al., 2006). La mayoría de trabajos establecen que los efectores de SPI-1 están involucrados en la entrada de la bacteria, mientras que los relacionados con SPI-2 son responsables de la supervivencia y la diseminación de la bacteria intracelular. Sin embargo, trabajos recientes sugieren que los límites de acción entre estas dos islas de patogenicidad no están muy definidos en términos espacio-tiempo. Así, se ha detectado la proteína efectora de SPI-1, SopB/SigD, en macrófagos varias horas después de la infección (Drecktrah et al., 2005). Igualmente, se ha demostrado que la proteína relacionada con invasión, SipA, está involucrada en mantener la morfología de la SCV y su posición yuxtanuclear durante la infección (Brawn et al., 2007). Además, estudios realizados en ratones infectados con Salmonella revelan la presencia de cuatro efectores de SPI-1 en el bazo e hígado del animal varios días post-infección (Giacomodonato et al., 2007). Por otro lado diferentes proteínas codificadas en SPI-1 parecen ser requeridas por la bacteria para establecer un estado de persistencia en el modelo murino (Lawley et al., 2006). Estudios hechos en ratones muestran además que el SST3 de SPI-2 se expresa durante la fase inicial de la infección con el serovar Typhimurium en la luz del intestino y antes de penetrar la bacteria en el epitelio intestinal (Brown et al., 2005). Los autores sugieren que la inducción temprana de la expresión de estos genes prepara a la bacteria para el ambiente hostil que va a encontrar dentro de los macrófagos. Estos resultados indican que los SST3 de Salmonella no actúan de forma independiente y que posiblemente cooperan durante distintas fases de la infección (Haraga et al., 2008). Otras islas de patogenicidad La isla de patogenicidad 3 de Salmonella (SPI-3) tiene un tamaño de 17 kb. El factor de virulencia mejor caracterizado de SPI-3 es el operón mgtCB, relacionado con la supervivencia dentro de macrófagos, la virulencia en ratones y con la adaptación a ambientes bajos en magnesio (Blanc-Potard y Groisman, 1997; Blanc-Potard et al., 1999). SPI-3

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comprende otros ocho genes, entre ellos misL, el cual codifica una adhesina necesaria para la persistencia intestinal (Blanc-Potard et al., 1999; Dorsey et al., 2005). La isla de patogenicidad 4 de Salmonella (SPI-4) comprende una región génica de 25 kb muy conservada entre los diferentes serovares de Salmonella (Edwards et al., 2002b; Wong et al., 1998). SPI-4 comprende seis genes designados ssiA-ssiF (“Salmonella intestinal infection”), que codifican proteínas que forman un “sistema de secreción tipo 1” (SST1) y una proteína de 595 kD llamada SiiE que es secretada por el SST1 (Gerlach et al., 2007b; Morgan et al., 2007). Se ha sugerido que SiiE podría mediar la adherencia de la bacteria a las células epiteliales, contribuyendo a la colonización intestinal en terneros y la inflamación intestinal en el modelo murino de colitis (Gerlach et al., 2007b). Recientemente se ha demostrado que existe una regulación coordinada de la expresión de los genes de SPI-1 y SPI-4 que compartirían el control por un mismo panel de reguladores en determinadas condiciones ambientales. Esta evidencia sugiere que estas dos islas podrían tener papeles complementarios durante la interacción de Salmonella con la mucosa intestinal del hospedador (Gerlach et al., 2007a; Main-Hester et al., 2007). Aunque SPI-1, SPI-2, SPI-3 y SPI-4 son las más estudiadas, en el género Salmonella se conocen otras trece islas (SPI-5-17) que codifican proteínas necesarias para virulencia (Gerlach y Hensel, 2007). La isla de patogenicidad 5 de Salmonella (SPI-5) es una pequeña región génica que abarca 7,6 kb y comprende los genes que codifican proteínas efectoras secretadas por los SST3 de SPI-1 y SPI-2, como SopB y PipB respectivamente (Knodler et al., 2002; Wood et al., 1998). De igual forma, SPI-6 y SPI-10 contienen los operones saf y sef que codifican fimbrias que median la adhesión de Salmonella a la superficie de células epiteliales. Por otra parte, SPI-7 es específica de los serovares Typhi, Dublin y Paratyphi C y codifica el antígeno Vi, necesario para virulencia (Folkesson et al., 2002; Gerlach y Hensel, 2007; Hensel, 2004). El sistema de dos componentes PhoP-PhoQ Los sistemas de dos componentes son ampliamente utilizados por los organismos procariotas para percibir y responder a diversas señales ambientales. Estos sistemas están compuestos por una proteína sensora y un regulador transcripcional (West y Stock, 2001). PhoP-PhoQ es un sistema de dos componentes esencial para la virulencia de varias bacterias Gram-negativas (Groisman, 2001). PhoQ es la proteína de membrana sensora con actividad quinasa y PhoP es el regulador de respuesta citoplasmático asociado cuya actividad es

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modulada por el estado de fosforilación (Groisman et al., 1989; Miller et al., 1989). PhoP pertenece a la subfamilia de reguladores OmpR (Castelli et al., 2000). La proteína PhoQ presenta dos dominios transmembrana que delimitan un dominio periplásmico sensor y un dominio citoplasmático con actividad quinasa. Estímulos como baja concentraciones de magnesio, pH ácido o presencia de péptidos antimicrobianos conducen a la autofosforilación de la proteína PhoQ en un residuo conservado de histidina en su dominio citoplasmático. Este grupo fosfato es transferido posteriormente a un residuo de ácido aspártico en la proteína PhoP (Castelli et al., 2000). La proteína PhoP fosforilada se une al ADN para controlar la expresión de los genes activados por PhoP (pag) y los genes reprimidos por PhoP (prg), de los cuales se ha postulado que podrían existir más de 200 (Monsieurs et al., 2005). El sistema PhoP-PhoQ es muy importante para la supervivencia intracelular de S. enterica pues promueve la virulencia y resistencia de la bacteria ante la respuesta inmune innata del hospedador, actuando como un sistema regulador que controla muchas de las propiedades patogénicas de la bacteria. Mutantes del serovar Typhimurium que carecen de PhoP o PhoQ son avirulentos en ratones (Groisman et al., 1989; Miller et al., 1989). El sistema PhoP-PhoQ regula una gran variedad de funciones de virulencia de la bacteria como invasión, motilidad, transporte de pequeñas moléculas, tolerancia a ambientes ácidos, resistencia a péptidos antimicrobianos y la modificación de la superficie de la bacteria (Adams et al., 2001; Bearson et al., 1998; Behlau y Miller, 1993; Fields et al., 1989; Guo et al., 1997; Soncini et al., 1996). Estas funciones podrían relacionarse con su capacidad para regular la expresión de factores de transcripción relacionados con virulencia como SsrB (Bijlsma y Groisman, 2005), SlyA (Norte et al., 2003), PmrA (Kox et al., 2000) e HilA (Bajaj et al., 1996). Se ha comprobado que S. enterica serovar Typhimurium sobrevive en el interior de macrófagos tras la infección de ratones susceptibles. Dentro de estas células, la bacteria ha de resistir a la acción de mecanismos antimicrobianos como intermediarios reactivos de oxígeno (ROI) y nitrógeno (RNI), péptidos antimicrobianos, proteasas y pH ácido (Linehan y Holden, 2003). Salmonella es capaz de percibir este ambiente hostil y activar mecanismos específicos como el sistema PhoP-PhoQ para evitar ser eliminada. PhoQ se activa en el interior de fagosomas de macrófagos (Alpuche Aranda et al., 1992) y en diferentes tejidos de ratones infectados (Merighi et al., 2005). Se ha sugerido que la proteína PhoQ puede ser activada en los fagosomas de macrófagos en respuesta a la baja concentración de cationes divalentes, particularmente magnesio, ya que PhoP activa la transcripción de los genes que codifican dos transportadores de magnesio de Salmonella, MgtA y MgtB (García Vescovi et al., 1996;

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Soncini et al., 1996). No obstante, estos transportadores no son esenciales para la virulencia y supervivencia intracelular de la bacteria (Blanc-Potard y Groisman, 1997). Por otra parte, se ha sugerido que es poco probable que la bacteria se encuentre in vivo con concentraciones mínimas de cationes necesarias para la activación de PhoQ. Por un lado, la concentración de Ca2+ se incrementa con la acidificación del fagosoma (Christensen et al., 2002) y por otro, en la vacuola fagosomal el Mg2+ está presente en concentraciones milimolares en el momento de la activación de la proteína PhoP (Martín-Orozco et al., 2006). Trabajos recientes han demostrado que PhoQ podría responder a otras señales como el pH ácido y la presencia de péptidos antimicrobianos que están presentes en la SCV de macrófagos y en el estómago y la luz intestinal de ratones infectados (Bader et al., 2005; Merigui et al., 2005; Prost et al., 2007). Aún así, todavía existen controversias sobre cuál podría ser la señal ambiental que activa el sistema PhoP-PhoQ en la bacteria intracelular (Groisman y Mouslim, 2006; Prost y Miller, 2008).

INTERACCIÓN DE Salmonella CON DISTINTOS TIPOS CELULARES EN MODELOS in vitro Comportamiento de Salmonella en el interior de células epiteliales Salmonella tiene la habilidad de invadir células no fagocíticas como las células epiteliales mediante “fagocitosis inducida por la bacteria” (Schlumberger y Hardt, 2006). Para que este proceso ocurra, es necesaria la función coordinada de SopE, SopE2, SopB, SipA y SipC, proteínas efectoras secretadas por el SST3 de SPI-1. Estas proteínas modulan el citoesqueleto de actina de la célula hospedadora de diferentes maneras para causar pliegues localizados de la membrana y la subsiguiente captación de la bacteria. SopE, SopE2 y SopB cooperan para activar las proteínas GTPasas de la familia Rho bien sea directamente (SopE y SopE2) o indirectamente (SopB) (Patel y Galán, 2006). Esto genera la activación de N-WASP y WAWE2, dos miembros de la familia de proteínas WASP (“Wiskott-Aldrich Syndrome”), produciéndose el reclutamiento del complejo Arp2/3 (“actin-related protein-2/3”) al sitio de entrada. SipA y SipC actúan directamente sobre la actina y cooperan para promover la polimerización y el ensamblaje de F-actina en el sitio de invasión de la bacteria (Hayward y Koronakis, 1999; Lilic et al., 2003). Estos cambios en el citoesqueleto de actina de la célula hospedadora producen finalmente el englobamiento e internalización de la bacteria. Después de la invasión de la célula, el citoesqueleto de actina vuelve a su arquitectura normal. Se ha visto que otra proteína efectora de SPI-1, SptP, antagoniza la acción de SopE, SopE2 y SopB actuando como una proteína estimuladora de GTPasa (GAP) sobre Cdc42 y Rac1 (Fu y

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Galán, 1999). La regulación temporal del proceso parece ser debida a que la degradación proteosomal de SptP está retardada con respecto a la de SopE (Kubori y Galán, 2003). De esta forma SptP persistiría en el citoplasma hasta después de que los efectores que median la polimerización de actina hayan sido degradados, restaurando el citoesqueleto de actina a su dinámica normal. La habilidad para sobrevivir y proliferar dentro de células eucariotas es considerada el principal factor de virulencia de S. enterica. La maduración de la SCV, así como la adaptación de la bacteria al nuevo ambiente y la posterior proliferación intracelular, podrían son procesos dependientes de SPI-2 (Cirillo et al., 1998). Durante su maduración en células epiteliales, la SCV interactúa transitoriamente con la ruta endocítica temprana ya que rápidamente gana y pierde marcadores endocíticos como EEA1, Rab5 y el receptor de transferrina (Smith et al., 2005; Steele-Mortimer, 2008). Seguidamente, la SCV adquiere marcadores endosomales tardíos como Rab7, la ATPasa vacuolar y glicoproteínas lisosomales como LAMP-1 y LAMP-2 (Drecktrah et al., 2007; García-del Portillo y Finlay, 1995; SteeleMortimer, 2008). En células epiteliales la maduración de la SCV coincide con el desplazamiento físico de la SCV hacia una región yuxtanuclear de la célula, cerca del aparato de Golgi y del centro organizador de microtúbulos (MTOC). Esta migración inicial de la SCV depende del reclutamiento de RILP (“Rab-7-interacting lysosomal protein”) y del complejo dineínadinactina (Harrison et al., 2004). El posicionamiento de la SCV posterior en esta región y la proliferación de la bacteria dependen principalmente de la acción de las proteínas efectoras de SPI-2, SseF, SseG y SifA (Ramsden et al., 2007), y además de la proteína efectora de SPI-1, SipA (Brawn et al., 2007). Por otra parte, alrededor de la SCV se forma una densa malla de actina involucrada tal vez en el mantenimiento de la integridad de la membrana de la vacuola (Meresse et al., 2001). Recientemente se ha determinado que la formación de esta estructura depende de la actividad quinasa del efector de SPI-2, SteC (Poh et al., 2008). En células epiteliales infectadas se induce la formación de estructuras filamentosas llamadas Sifs (“Salmonella-induced filaments”), un fenómeno dependiente de SPI-2 (Garcíadel Portillo et al., 1993b; Stein et al., 1996). Estas estructuras presentan el marcador LAMP-1 y tienen una composición similar a la de la membrana de la SCV (Brumell et al., 2001). No se conoce con exactitud la importancia de la formación de los Sifs en la patogénesis de Salmonella (Steele-Mortimer, 2008). La formación de estas estructuras tubulares depende principalmente de la proteína efectora de SPI-2, SifA, y en menor grado de las proteínas SseF, SseG, SopD2 y PipB2. La función de las proteínas PipB2, SopD2, SseG y SseF en la formación de los Sifs no se conoce con certeza. Sin embargo, cepas mutantes de Salmonella

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Introducción

defectuosas en alguno de estos efectores son incapaces de producir Sifs de forma similar a la estirpe silvestre (Knodler y Steele-Mortimer, 2005; Stein et al., 1996). Comportamiento de Salmonella en el interior de macrófagos De forma similar a lo observado en células epiteliales, Salmonella modula activamente la SCV en el interior de macrófagos, creando un nicho de replicación intracelular. Para ello altera el tráfico endocítico, la membrana vacuolar y reorganiza el citoesqueleto de actina y los microtúbulos asociados a la vacuola mediante el SST3 de SPI-2 (Garvis et al., 2001; Knodler et al., 2003; Uchiya et al., 1999; Waterman y Holden, 2003). Como se mencionó anteriormente, los datos actuales son consistentes con la exposición de Salmonella en el fagosoma a pH ácido, péptidos antimicrobianos e intermediarios reactivos de oxígeno y nitrógeno (Linehan y Holden, 2003; Martín-Orozco et al., 2006). Salmonella intracelular es capaz, mediante el SST3 de SPI-2, de evitar el reclutamiento de la NADPH-oxidasa a la membrana de la SCV, de esta manera impide la generación de concentraciones bactericidas de ROS (Vázquez-Torres et al., 2000). De igual forma, SPI-2 está relacionada con la protección ante los efectos dañinos de los RNI, pues la bacteria es capaz de reducir la colocalización de la enzima óxido nítrico sintetasa (iNOS) en la membrana de la SCV (Chakravortty et al., 2002). El ambiente ácido de la SCV induce varios sistemas reguladores que ayudan a la supervivencia intracelular de la bacteria. Entre estos sistemas encontramos OmpR-EnvZ, PhoP-PhoQ, RpoS/RpoE y PmrA/PmrB que confieren resistencia ante péptidos antimicrobianos y stress oxidativo (Gunn et al., 2000; Lee et al., 2000; Miller et al., 1989; Nickerson y Curtiss, 1997). La infección de macrófagos con Salmonella estimula un programa de muerte de la célula hospedadora conocido como piroptosis, dependiente de caspasa 1. A diferencia de la apoptosis, la piroptosis es un proceso de muerte celular que produce la activación de caspasa 1 y una respuesta inflamatoria importante para la protección del hospedador. La activación de caspasa 1 en macrófagos infectados por Salmonella da lugar a la liberación de las citoquinas IL-1β e IL-18 (Fink y Cookson, 2007). El serovar Typhimurium puede causar la piroptosis rápida tras la infección de macrófagos (aproximadamente 45 minutos post-infección) que es dependiente del SST3 de SPI-1 y flagelina. Además, después de 24 horas de infección in vitro, Salmonella induce la piroptosis tardía de macrófagos. Este proceso es dependiente de caspasa 1, y es necesario el SST3 de SPI-2, el receptor tipo Toll 4 (TLR4) y los genes spv de Salmonella (Cook et al., 2007; Fink y Cookson, 2007).

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Introducción

Caspasa 1 es un importante factor de la respuesta inmune innata que confiere resistencia ante infecciones. Comparado con ratones silvestres, los animales deficientes en caspasa 1 son más susceptibles a la infección por Salmonella (Lara-Tejero et al., 2006; Raupach et al., 2006). De igual forma, los sustratos de caspasa-1, IL-1β e IL-18, contribuyen al control de la infección, ya que ratones deficientes en alguna de estas citocinas son más susceptibles que los ratones silvestres (Raupach et al., 2006). El papel de caspasa 1 no se limita al procesamiento de estas citocinas pues la lisis celular expone ante Salmonella otros mecanismos antimicrobianos (Fink y Cookson, 2007). Por lo tanto, la piroptosis representa un respuesta del hospedador que produce inflamación y la eliminación de células infectadas (Cookson y Brennan, 2001). Comportamiento de Salmonella en el interior de células dendríticas Una vez que Salmonella invade las células dendríticas se mantiene en un estado no proliferativo pero activo en la expresión de genes de SPI-2. Sin embargo la expresión de la mayoría de los factores de virulencia, incluyendo SPI-2 y el sistema PhoP-PhoQ, no son necesarios para la supervivencia intracelular (García-del Portillo et al., 2000; Jantsch et al., 2003; Niedergang et al., 2000). Aunque la infección por Salmonella induce la maduración de la célula dendrítica, se reduce la presentación de antígenos de la bacteria a las células T a través de las moléculas MHC de clase I y II (Alaniz et al., 2006; Mitchell et al., 2004; Svensson et al., 2000; Tobar et al., 2004; Tobar et al., 2006). Salmonella es capaz de modificar el tráfico vesicular en la célula dendrítica y así evitar la fusión de la SCV con el compartimento lisosomal, de esta manera la bacteria impide el procesamiento de antígenos evitando la ruta lisosomal de degradación (Jantsch et al., 2003; Tobar et al., 2004). SPI-2 media la reducción de la presentación de antígenos y la proliferación de células T, evitando así la generación de una respuesta inmune específica frente a Salmonella (Cheminay et al., 2005; Tobar et al., 2006). Del mismo modo que ocurre en macrófagos, Salmonella induce la muerte celular de células dendríticas tras su infección. En este tipo celular, este proceso es dependiente de SPI-1 y requiere la activación de caspasa 1, no obstante, es aparentemente independiente de SPI-2 (van der Velden et al., 2003). Comportamiento de Salmonella en el interior de fibroblastos Al igual que ocurre con las células dendríticas, la infección de fibroblastos por el serovar Typhimurium resulta en una población homogénea de bacterias intracelulares que muestran ausencia de crecimiento (Cano et al., 2001; Martínez-Moya et al., 1998). En la

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mayoría de las líneas estables de fibroblastos utilizadas se obtiene un promedio de entre dos y tres bacterias por fibroblasto. Utilizando los fibroblastos como modelo de infección se ha determinado que diferentes funciones de Salmonella relacionadas con virulencia, requeridas para la infección sistémica en modelos animales y para proliferar en el interior de macrófagos, podrían controlar la proliferación de la bacteria en el interior de fibroblastos. Tal es el caso del sistema de dos componentes PhoP-PhoQ, los reguladores SpvR y SlyA, el factor sigma alternativo RpoS y la proteína IgaA. Así, la inactivación de estas funciones causa un marcado incremento en la proliferación intracelular de las bacterias (Cano et al., 2001). Además, los fibroblastos infectados mantienen su integridad y viabilidad durante largos períodos de tiempo, hasta tres semanas después de ser infectados (Cano et al., 2003). Esto sugiere que Salmonella es capaz de percibir el tipo celular donde se encuentra y ajustar en consecuencia la tasa de crecimiento intracelular.

INTERACCIÓN

DE

Salmonella

CON

CÉLULAS

DEL

HOSPEDADOR

EN

MODELOS ANIMALES Un factor importante en la resistencia de los ratones a la infección por Salmonella es la presencia del gen Nramp1 (también conocido como Slc11a1). Este gen codifica un transportador protón/catión divalente de tipo “antiporter” relacionado con la susceptibilidad a las infecciones por Salmonella spp., Mycobacterium spp. y Leishmania spp (Vidal et al., 1993). La expresión de Nramp1 está restringida a células del linaje monocito/macrófago y se localiza en la membrana del fagosoma. Nramp1 limita la captación de cationes divalentes por parte de las bacterias, de esta forma, se dificulta el crecimiento intravacuolar de Salmonella (Gruenheid et al., 1997). En consecuencia, los ratones Nramp1-/- son más susceptibles a la infección por el serovar Typhimurium. La mayoría de la información que se tiene sobre la patogénesis de Salmonella se ha obtenido principalmente de infecciones experimentales de ratones Nramp1-/- susceptibles (estirpes BALB/c o C57BL/6). Sin embargo este modelo no es apropiado para el estudio de la persistencia de Salmonella. En este sentido, se ha optimizado un modelo de infección basado en ratones Nramp1+/+ (estirpe 129sv) (Monack et al., 2004), los cuales soportan dosis de infección con el serovar Typhimurium de hasta mil veces superior en comparación a ratones susceptibles (Vidal et al., 1995). Varios estudios han demostrado la presencia de Salmonella en el interior de células dendríticas, neutrófilos y macrófagos en la lámina propia y linfonódulos mesentéricos de animales infectados (Cheminay et al., 2004; Conlan, 1997; Rydstrom y Wick, 2007; Uematsu et al., 2006). Sin embargo, se ha demostrado que el serovar Typhimurium persiste

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Introducción

predominantemente en el interior de macrófagos situados en los linfonódulos mesentéricos de ratones Nramp1+/+ durante al menos un año. Además se observó que estos macrófagos tenían un promedio de tres bacterias por célula (Monack et al., 2004). De igual forma, se ha demostrado que el serovar Typhimurium infecta células CD18 negativas/CD45 negativas en la lámina propia de ratones infectados que pudieran ser fibroblastos (Boyle et al., 2007; Tierrez y García-del Portillo, 2005). En los órganos diana del serovar Typhimurium, bazo e hígado, se han observado bacterias en el interior de células dendríticas, macrófagos, neutrófilos y linfocitos T y B (Geddes et al., 2007; Richter-Dahlfors et al., 1997; Nix et al., 2007; Salazar-Gonzalez et al., 2006; Salcedo et al., 2001; Sheppard et al., 2003; Yrlid et al., 2001). Estudios recientes realizados con ratones 129sv (Nramp1+/+) infectados con el serovar Typhimurium han demostrado que la bacteria reside dentro de macrófagos que han digerido otros tipos celulares (Nix et al., 2007). Estos macrófagos son conocidos como macrófagos hemofagocíticos. La bacteria sobrevive y prolifera dentro de macrófagos que ha fagocitado otros tipos de células viables, pero es eliminada por macrófagos que han ingerido células muertas o que no han ingerido nada. Estos resultados indican que los macrófagos hemofagocíticos pueden proporcionarle a la bacteria un nicho en el cual puede sobrevivir y persistir in vivo (Nix et al., 2007). A diferencia de lo que ocurre con las líneas celulares de macrófagos o células epiteliales frecuentemente usadas como modelos de infección por Salmonella, el número de bacterias intracelulares presentes en el hígado, el bazo y linfonódulos mesentéricos de ratones infectados resulta escaso (menos de diez bacterias por célula) (Geddes et al., 2007; Grant et al., 2008; Monack et al., 2004; Salcedo et al., 2001). Sheppard et al. demostraron que la proliferación del serovar Typhimurium en los tejidos de animales infectados se debe principalmente a la diseminación continúa de microorganismos a nuevas células no infectadas y a nuevos focos de infección, y no al aumento del número de bacterias en la célula inicial. Esto implica que existe un bajo número de bacterias en cada célula infectada y que es el número de células infectadas el que aumenta (Sheppard et al., 2003). Se ha postulado que la diseminación y distribución de la bacteria en tejidos posiblemente se produzca mediante la muerte de la célula hospedadora por necrosis y/o apoptosis mediada por caspasa 3 (Brown et al., 2006; Grant et al., 2008).

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Introducción

ESTUDIOS GLOBALES DEL PROCESO DE INFECCIÓN POR Salmonella Todo proceso de infección transcurre gracias a una delicada coordinación espacial y temporal de la expresión de los genes de virulencia (Cotter y DiRita, 2000). Las técnicas experimentales que permiten estudiar de forma simultánea la expresión global de genes o proteínas aportan, por tanto, una valiosa información para entender los mecanismos de patogenicidad. La tecnología de microsoportes de ADN (“microarrays”) ha permitido la identificación de genes importantes para la supervivencia de las bacterias patógenas dentro de células eucariotas (Hinton et al., 2004; Jansen y Yu, 2006). La información generada por esta técnica, complementada con sistemas de análisis a gran escala basado en colecciones de mutantes, como la mutagénesis de marcaje (STM, “signature-tagged mutagenesis”), ha permitido la identificación de nuevos genes de Salmonella importantes para la colonización e infección del hospedador (Shelburne y Musser, 2004). El análisis de transcriptómica del serovar Typhimurium en el interior de macrófagos ha revelado que la bacteria experimenta un cambio de expresión en el 20% de su genoma (Eriksson et al., 2003). Los datos de este trabajo sugieren que durante la infección de macrófagos (4, 8 y 24 horas post-infección), la bacteria se encuentra en un ambiente oxigenado, limitante en fosfato, hierro y magnesio, donde el gluconato y otros carbohidratos relacionados podrían ser la principal fuente de carbono. Además, los resultados obtenidos sugieren la naturaleza ácida de la SCV y la represión de los genes asociados al flagelo y quimiotaxis, lo que indicaría que la motilidad no es necesaria para la replicación intracelular de Salmonella (Eriksson et al., 2003; Lucchini et al., 2005). En un estudio de transcriptómica del serovar Typhi a diferentes tiempos durante la infección de monocitos humanos (2, 8 y 24 horas post-infección) se observó la inducción de genes asociados con el transporte de magnesio y represión de genes relacionados con motilidad, sin embargo, no se encontraron evidencias que apoyaran la escasez de hierro en la SCV (Faucher et al., 2006). Además, este estudio sugiere que el serovar Typhi podría utilizar ácidos grasos como fuente de carbono (Faucher et al., 2006). Por otra parte, en un estudio similar del serovar Typhimurium en el interior de células epiteliales HeLa ha mostrado que existe una gran cantidad de genes de Salmonella con niveles de expresión altos, comunes a los observados durante la infección de macrófagos (Hautefort et al., 2007). Todo ello sugiere que en la SCV que habita el serovar Typhimurium en ambos tipos celulares (macrófagos, células epiteliales) existen señales ambientales comunes. Tal es el caso de los genes relacionados con la captación de magnesio, hierro y fosfato, y de los genes inducidos en ambientes oxigenados. Sin embargo, este serovar parece inducir la expresión de genes involucrados con la biosíntesis de la maquinaria flagelar y de genes asociados con SPI-1 tras 4 y 6 horas después de haber infectado la célula epitelial.

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Introducción

Estas diferencias indican que la adaptación de Salmonella al ambiente intracelular tendría características únicas dependiendo del serovar y del tipo de célula hospedadora infectada. A pesar de las diferencias encontradas en estos estudios de transcriptómica, todos coinciden en la fuerte inducción de los genes relacionados con SPI-2 en Salmonella intracelular. Estas observaciones se ven reforzadas por estudios que han identificado genes asociados a SPI-2 como importantes para la supervivencia dentro de macrófagos en cultivo mediante mutagénesis de marcaje (STM) (Chan et al., 2005), y para la virulencia y persistencia durante la infección de ratones resistentes (Lawley et al., 2006; Monack et al., 2004). Por otra parte, las células eucariotas infectadas con microorganismos patógenos responden con variaciones en la expresión génica. La tecnología de “microarrays” de ADN permite el estudio y la compresión de la respuesta de células hospedadoras ante la infección bacteriana, mediante la identificación de patrones de expresión génica que pueden no ser evidentes a través el estudio de genes individuales por técnicas convencionales (Rosenberger et al., 2001). Se han analizado los cambios transcripcionales de células epiteliales y macrófagos en cultivo infectados con los serovares Typhimurium (Detweiler et al., 2001; Rosenberger et al., 2000) y Dublin de S. enterica (Eckmann et al., 2000). Estos estudios sugieren que la bacteria podría inducir la muerte celular de macrófagos infectados mediante el sistema PhoP-PhoQ (Detweiler et al., 2001) y, además, la infección podría alterar la progresión normal del ciclo celular (Rosenberger et al., 2000). A pesar de las diferencias de tipo celular, serovar de Salmonella y diseño experimental utilizados entre estos trabajos, todos coinciden en que la infección con esta bacteria induce la fuerte expresión de los genes relacionados con la respuesta inmune innata en la célula hospedadora, principalmente de los genes que codifican citoquinas proinflamatorias. Igualmente, en estudios recientes sobre el patrón transcripcional en diferentes tejidos de animales infectados con S. enterica, se determinó que se produce una respuesta común en los tejidos analizados caracterizada por la inducción de la respuesta inmune innata e inflamación (Handley y Miller, 2007; Rodenburg et al., 2007a; Rodenburg et al., 2007b; Wang et al., 2007; Zhao et al., 2006). Los análisis sobre los cambios transcripcionales globales durante la interacción Salmonella-célula hospedadora in vitro se han realizado utilizando modelos de infección basados en células epiteliales y de macrófagos. Como se ha dicho anteriormente, en estas líneas celulares se ha observado tradicionalmente una proliferación masiva de las bacterias intracelulares. Este comportamiento de S. enterica difiere considerablemente con el observado en el interior de células de tejidos in vivo, donde la mayoría de las células infectadas contienen un número bajo de bacterias intracelulares (Geddes et al., 2007; Grant et al., 2008;

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Salcedo et al., 2001). En este sentido podría considerarse que es más apropiado el uso de otros tipos celulares como los fibroblastos o las células dendríticas en cultivo, ya que muestran una población de bacterias intracelulares escasa y homogénea acorde con lo observado in vivo. Esta homogeneidad también debería favorecer el estudio de la interacción Salmonella-célula hospedadora mediante análisis globales de expresión génica. El fibroblasto, además de ser un tipo celular adecuado como modelo de estudio in vitro de la patogénesis de S. enterica (Cano et al., 2001), se ha demostrado que es una célula clave para el inicio y la amplificación de la respuesta inflamatoria. Así, este tipo celular produce quimioquinas que reclutan leucocitos al sitio de inflamación en respuesta a la infección de microorganismos u otros factores ambientales (Jordana et al., 1994; Smith et al., 1997). Los fibroblastos modulan activamente el comportamiento y función de las células del sistema inmunológico pues determinan la composición de citoquinas en tejidos, en consecuencia, tienen un importante papel en la transición de la inflamación aguda hacía la respuesta inmune adquirida (Buckley et al., 2001; Parsonage et al., 2005). La ubicuidad en tejidos de este tipo celular le confiere la capacidad de poder actuar como célula centinela del sistema inmunológico que al ser estimulada por proteínas bacterianas como el lipopolisacárido (LPS) son capaces de producir quimioquinas para el reclutamiento de células inflamatorias (Smith et al., 1997). La participación activa de los fibroblastos en la generación de la respuesta inflamatoria en tejidos hacen de este tipo celular un modelo de estudio interesante para el análisis del proceso de infección con Salmonella.

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OBJETIVOS

Objetivos

El empleo de la línea de fibroblastos de rata denominada “normal rat kidney” (NRK49F) para el estudio de la patogénesis de Salmonella enterica ha permitido establecer un modelo de infección donde la bacteria permanece en un estado de latencia. Este escenario se asemeja a lo observado en infecciones utilizando modelos animales. Estudios realizados en nuestro laboratorio han revelado que en el modelo de infección de fibroblastos, el sistema de dos componentes PhoP-PhoQ es importante para controlar la tasa de crecimiento intracelular de Salmonella. Con base en estos antecedentes y con el propósito de caracterizar la interacción de Salmonella con el fibroblasto, nos planteamos en esta Tesis los siguientes objetivos principales: 1. Examinar la respuesta del fibroblasto a la infección por S. enterica serovar Typhimurium mediante el análisis de expresión génica global. 2. Analizar los cambios en la expresión del genoma de S. enterica serovar Typhimurium que ocurren durante la atenuación del crecimiento en el interior de fibroblastos. 3. Examinar la contribución de la isla de patogenicidad 2 de S. enterica serovar Typhimurium sobre el control del crecimiento intracelular en el interior del fibroblasto. 4. Definir el papel de los sistemas PhoP-PhoQ y OmpR-EnvZ en la regulación de la isla de patogenicidad 2 de S. enterica serovar Typhimurium en el interior del fibroblasto.

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MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y métodos

MATERIAL BIOLÓGICO Estirpes bacterianas y plásmidos Todas las estirpes de Salmonella enterica serovar Typhimurium y plásmidos usados en este trabajo se describen en las tablas A1 y A2 del Anexo 1. Bacteriófagos Como bacteriófago transductor se usó P22 HT105/1 (Schmieger, 1972). Para los ensayos de sensibilidad a P22 se utilizó el derivado no lisogénico H5. Anticuerpos Los anticuerpos primarios usados en los ensayos de detección de proteínas fueron los siguientes: ƒ

Policlonal de conejo anti-LPS del serovar Typhimurium grupo B, factores 1, 4, 5, 12 (Difco Laboratories), dilución 1:1000.

ƒ

Monoclonal

de

ratón

anti-FLAG

(clon

M2,

Sigma),

dilución

1:3000

(inmunofluorescencia) y 1:5000 (“Western blot”). ƒ

Monoclonal

de

ratón

anti-HA

(clon

16B12,

Covance),

dilución

1:100

(inmunofluorescencia) y 1:1000 (“Western blot”). ƒ

Policlonal de conejo anti-OmpA (cedido por el Dr. H. Schwarz, Tübingen, Germany), dilución 1:10000.

ƒ

Policlonal de conejo anti-Calnexina (Stressgen), dilución 1:10000.

Los anticuerpos secundarios utilizados fueron: ƒ

Policlonal de cabra anti-conejo conjugado con Alexa 488 (Molecular Probes), dilución 1:1000.

ƒ

Policlonal de cabra anti-ratón conjugado con Alexa 594 (Molecular Probes), dilución 1:1000.

ƒ

Policlonal de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano (BIO-RAD), dilución 1:5000.

ƒ

Policlonal de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano (BIO-RAD), dilución 1:5000.

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Materiales y métodos

Líneas celulares eucariotas Se utilizó la línea NRK-49F (fibroblastos de riñón de rata, ATCC CRL-1570).

MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO Cultivo de bacterias Para el crecimiento de bacterias se usó el medio rico en nutrientes Luria y Bertani (LB) (Lennox, 1955). Su composición es de 10 g/l de peptona, 5 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de NaCl. Para el crecimiento en medio sólido se añadió agar a una concentración de 15 g/l. Cuando fue necesario, los medios de suplementaron con kanamicina (30 μg/ml), ampicilina (50 μg/ml) y tetraciclina (10 μg/ml). El medio N se utilizó para cultivar la bacteria en condiciones de escasez de magnesio (García Vescovi et al., 1996). Está compuesto por Tris 0,1 M pH 7,4; KCl 5 mM; (NH4)2SO4 7,5 mM; K2SO4 0,5 mM; KH2PO4 1 mM y glicerol 38 mM. En el caso de cultivar la estirpe SL1344 de Salmonella y sus mutantes derivados, auxótrofos para histidina, se suplementó el medio con L-histidina a una concentración de 50 μg/ml. Se utilizaron dos concentraciones de MgCl2: 8 μM y 10 mM. Los cultivos se incubaron hasta saturación en medio N 10mM MgCl2. Al día siguiente el cultivo se lavó dos veces con medio N sin MgCl2 y se inoculó una dilución 1:10 en medio N nuevo suplementado con 8 μM ó 10 mM MgCl2. El medio PCN (fosfato-carbón-nitrógeno) se utilizó como medio mínimo para inducir la expresión de los genes codificados en SPI-2 y de aquellos que codifican las proteínas efectoras del SST3 de SPI-2 (Lober et al., 2006). La composición de este medio es MES 80 mM; Tricina 4 mM; FeCl3 100 mM; K2SO4 376 mM; NaCl 50 mM; K2HPO4/KH2PO4 0,4 mM; glucosa 0,4 %; NH4Cl 15 mM; MgSO4 1 mM; CaCl2 10 μM; Na2MoO4 10 nM; NaSeO3 10 nM; H3BO3 4 nM; CoCl2 300 nM; CuSO4 100 nM; MnCl2 800 nM; ZnSO4 1 nM y Lhistidina 50 μg/ml. El pH de este medio de cultivo se ajustó a 5,8. Para la preparación de lisados de fago P22 se emplearon los medios NB (“Nutrient Broth”), suplementado con NaCl, y el medio E. El medio NB se adquirió en forma de preparado comercial (Difco) y se preparó añadiendo 8 g del preparado y 5 g de NaCl a un litro de agua destilada. Su composición final es de 3 g/l de extracto de carne, 5 g/l de peptona y 5 g/l de NaCl. El medio E (Vogel y Bonner, 1956) se preparó como una solución de sales concentrada 50 veces (MgSO4 38 mM; ácido cítrico 0,5 M; K2HPO4 3,75 M y NaNH4HPO4

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Materiales y métodos

0,83 M) y se esterilizó con cloroformo. El caldo de fagos se preparó mezclando 100 ml de medio NB, 2 ml de medio E 50x, 1 ml de glucosa al 20% y 0,1 ml de un lisado de fago obtenido sobre una estirpe silvestre. El medio EBU (“Evans Blue Uranine”) se utilizó para comprobar el estado de lisogenia en cepas obtenidas en ensayos de transducción. Su composición es la del medio LB al que se le añaden por cada 100 ml: 0,5 ml de glucosa al 50%; 1 ml de K2HPO4 al 25%; 125 µl de azul de Evans al 1% y 250 µl de fluoresceína al 1%. Todos los reactivos químicos utilizados son de grado analítico de las casas proveedoras Sigma, Merck y Fluka. Los cultivos se realizaron en agitación suave (180 rpm) a 37 ºC en una estufa Microtermic I (Radiber S.A.). Para los ensayos de infección de células eucariotas, las bacterias se cultivaron en un volumen de 1 ml de medio LB a 37 ºC sin agitación durante 18 horas (estufa Memmert Modell 500). Cultivo de células eucariotas Los fibroblastos NRK-49F se cultivaron en medio DMEM (Medio de Eagle modificado por Dulbecco, Invitrogen) suplementado con 5% de suero fetal bovino (SFB) (Invitrogen) y 2 mM de L-glutamina (Invitrogen). Las células se incubaron a 37ºC en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 utilizando el incubador Forma Scientific Inc. modelo 311. Para la propagación del cultivo se despegaron los fibroblastos de la placa de cultivo añadiendo tripsina-EDTA (0,5/0,2%) (Invitrogen) e incubando durante 5 minutos a 37ºC y 5% de CO2. Seguidamente, se diluyeron con DMEM 5% SFB y 2 mM L-glutamina y se sembraron a la confluencia adecuada. Los fibroblastos NRK-49F se congelaron en criotubos (Nunc) en medio DMEM 5% SFB y 2 mM L-glutamina, conteniendo 10% de dimetil sulfóxido (DMSO) (Sigma), en nitrógeno líquido a una temperatura de -170ºC aproximadamente. Para descongelar los fibroblastos NRK-49F, el criotubo se colocó en un baño de agua a 37ºC. Posteriormente se depositó el contenido del mismo en una placa de cultivo (Nunc) y se incubaron a 37ºC y 5% de CO2. Pasadas aproximadamente dos horas, cuando las células estaban adheridas al soporte sólido, se retiró el medio de cultivo con DMSO y se agregó medio DMEM 5% SFB y 2 mM L-glutamina fresco.

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Materiales y métodos

GENÉTICA BACTERIANA Electroporación de Salmonella Para la obtención de células electrocompetentes se realizó una dilución 1:100 de un cultivo saturado de bacteria [densidad óptica a 600 nm (DO600) ~ 3,0] en 20 ml de medio LB fresco. Las bacterias se incubaron a 37ºC en agitación hasta que la DO600 del cultivo alcanzó valores de 0,5-0,6, seguidamente se centrifugó el cultivo durante 15 minutos a 3220 x g a 4ºC. Después de resuspender cuidadosamente las bacterias con 10 ml de agua destilada con 10% de glicerol, se volvieron a centrifugar otros 15 minutos a 3220 x g a 4ºC. Este procedimiento se repitió dos veces, disminuyendo el volumen de glicerol al 10% a 4 y 2 ml respectivamente. Finalmente, las bacterias se resuspenden en 200 μl de agua con 10% glicerol. Para realizar la electroporación se mezclaron 100 μl de bacterias electrocompetentes con 200-500 ng de ADN y se mantuvo en hielo durante 2 minutos. Seguidamente se transfirió la mezcla a una cubeta de electroporación de 0,2 cm (BIO-RAD) previamente enfriada. A continuación, se sometió la mezcla a un pulso de 12,5 kV/cm (1,8 kV, 200 Ω y 25 μF) en el electroporador GENE PULSER® II de BIO-RAD. Se agregó 1 ml de medio LB a la cubeta y esta mezcla se transfirió a un tubo estéril que se incubó a 37ºC en agitación durante 1 hora y 30 minutos. Tras la incubación, la mezcla se sembró en un medio selectivo con antibiótico. Preparación de lisados de bacteriófagos P22 Se mezclaron 4 ml de caldo P22 con 1 ml de un cultivo saturado de la estirpe donadora. Esta mezcla se cultivó en agitación suave (100 rpm) durante 8 horas a 37ºC. Los fagos se recogieron mediante centrifugación del lisado durante 20 minutos a 3220 x g. Se guardó el sobrenadante en un tubo al que se le añadieron 100 μl de cloroformo. Los lisados se almacenaron a 4ºC. Transducción en medio líquido Para la construcción de estirpes mutantes de Salmonella con marcadores cromosómicos se utilizó el fago P22. En un tubo se mezclaron 100 μl de un cultivo saturado de la estirpe receptora con 100 μl del lisado de P22 de la estirpe donadora. Después de 30 minutos de agitación suave (150 rpm) a 37ºC, esta mezcla se sembró en placas de LB-agar en medio selectivo para el marcador utilizado y se incubaron a 37ºC hasta la aparición de transductantes. Los transductantes, además de haber recibido el marcador seleccionado, pueden haber sido infectados por el fago P22. Estos pseudolisógenos se hacen resistentes o inmunes a

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Materiales y métodos

nuevas infecciones por P22 y a partir de ese momento no pueden ser lisados ni transducidos nuevamente. Para comprobar que los transductantes estaban libres de fago se sembraron cuatro colonias obtenidas en el ensayo de transducción en placas de medio EBU (Chan et al., 1972). En estas placas, las colonias de pseudolisógenos aparecen de color azul oscuro y las colonias libres de P22 son claras. La diferencia de color se debe a que las placas EBU contienen indicadores de pH que bajo condiciones de pH ácido se tornan de color azul oscuro. Las colonias de pseudolisógenos se acidifican debido a la existencia de lisis y por ello aparecen de este color. Se considera que un transductante está limpio de fago cuando en el aislamiento no aparece ninguna colonia de color azul oscuro. Para determinar si una estirpe está libre de fago se utilizó como método alternativo el ensayo de sensibilidad al fago P22. Consiste en someter a los transductantes a una infección con el fago mutante virulento H5 que no desarrolla el ciclo lisogénico. Los transductantes pseudolisogénicos no son infectados por H5 y por el contrario, sí los transductantes libres de P22. Sobre una placa de LB se extendió una estría central con lisado del fago H5 y se dejó secar. Posteriormente, utilizando los transductantes que se iban a comprobar, se trazaron estrías perpendiculares que cruzaban con la estría de H5. Se incubaron las placas a 37ºC hasta la apreciación de crecimiento bacteriano en las estrías (de 6 a 8 horas). Las estirpes libres de P22 y por lo tanto, sensibles a la infección con H5, sólo presentaron crecimiento hasta la estría de H5, mientras que las resistentes crecen cruzando la estría. Etiquetado de proteínas de Salmonella Para la construcción de las estirpes pipB::3xFLAG, pipB2::HA, sseJ::3xFLAG, sopB::3xFLAG, pagC::3xFLAG, mgtA::3xFLAG, mgtB::3xFLAG y mgtC::3xFLAG se siguió el protocolo de etiquetado de genes en el cromosoma de Salmonella descrito anteriormente (Uzzau et al., 2001). Para ello se utilizaron los oligonucleótidos descritos en la tabla A4 (Anexo I) y los plásmidos pSUB11 y pSU315 como ADN molde. De esta forma, se generó un fragmento mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) que contiene en los extremos la secuencia del gen que queremos etiquetar. En su interior, este fragmento de PCR tiene el gen de resistencia a kanamicina flanqueado por sitios FRT de reconocimiento de la recombinasa FLP. Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron en un volumen de 50 μl con 10-100 ng de plásmido, 2 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs, 0,3 μM de oligonucleótidos y 0,05 U/μl de Taq polimerasa. Se utilizó un termociclador GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems), siguiendo el siguiente programa: (i) 5 minutos a 94ºC; (ii) 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC y 90 segundos a 72ºC; (iii) 5 minutos a 72ºC. El

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Materiales y métodos

producto amplificado se purificó a partir del gel de agarosa utilizando el kit PureLink Quick Gel Extraction (Invitrogen). El fragmento de ADN amplificado se electroporó en bacterias competentes de la estirpe 14028s que portaban el plásmido pKD46. Este plásmido es termosensible, no replica a 37ºC y porta el sistema λRed que permite la recombinación homóloga del fragmento de PCR con el ADN cromosómico. La mezcla de la reacción de electroporación se sembró en placas de LB suplementadas con 30 μg/ml de kanamicina para seleccionar aquellos clones en los que tuvo lugar el fenómeno de recombinación y que, por lo tanto, incorporaron el marcador de resistencia en el cromosoma. Las placas se incubaron a 37ºC hasta la aparición de colonias resistentes. A continuación se comprobó que la secuencia de la región insertada es correcta mediante secuenciación automática de ADN (Secugen S. L., Centro de Investigaciones Biológicas, Madrid, España). Seguidamente, se preparó un lisado con P22 del mutante con el gen etiquetado para transferir esta construcción a la estirpe silvestre SL1344. Finalmente, se transformaron estas estirpes con el plásmido pCP20 que codifica la recombinasa FLP. Esta enzima elimina el casete de resistencia a kanamicina flanqueado por los sitios FRT (Cherepanov y Wackernagel, 1995).

INFECCIÓN DE CULTIVOS CELULARES Ensayo de infección de fibroblastos con Salmonella Los fibroblastos se sembraron en medio DMEM con 5% SFB y 2 mM L-glutamina utilizando placas de cultivo de diferente tamaño según el ensayo a realizar. Después de 24 horas, cuando el cultivo había alcanzado una confluencia del 50-60%, las células se infectaron con una multiplicidad de infección de 10:1 (bacteria:célula eucariota). Tras 30 minutos de infección, se retiró el medio de cultivo y se lavaron las células 3 veces con la solución tamponada fosfato salina (PBS) pH 7,4 estéril a 37ºC. Esta solución está compuesta por 1,9 mM de NaH2PO4; 8,1 mM de Na2HPO4 y 154 mM de NaCl. Seguidamente, se añadió DMEM 5% SFB, 2 mM L-glutamina fresco a 37ºC suplementado con 100 μg/ml de gentamicina (Sigma). A las 2 horas post-infección se cambió el medio por DMEM 5% SFB, 2 mM Lglutamina conteniendo 10 μg/ml de gentamicina. Este antibiótico sólo elimina las bacterias extracelulares sin afectar a la viabilidad de aquellas que se encuentran en el interior de los fibroblastos debido a que no atraviesa la membrana plasmática de la célula eucariota (Finlay y Falkow, 1988).

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Materiales y métodos

Índice de proliferación intracelular Los fibroblastos se sembraron en 0,5 ml de medio DMEM con 5% SFB y 2 mM Lglutamina utilizando placas de 24 pocillos (2 cm2) (Nunc) y se infectaron con S. enterica serovar Typhimurium siguiendo el protocolo descrito en el apartado anterior. A las 2 y 24 horas post-infección, los fibroblastos infectados se lisaron con Tritón X-100 al 1% en PBS durante 5 minutos a 37ºC. El número de las bacterias intracelulares viables se determinó sembrando distintas diluciones del lisado en placas de LB-agar y contando el número de colonias. Para cada estirpe y tiempo se infectaron 2 pocillos y el lisado de cada pocillo se sembró por duplicado. El índice de proliferación intracelular (Ipro) se calculó como el cociente entre el número de las bacterias intracelulares viables a las 24 horas con respecto a las 2 horas post-infección. Este ensayo se realizó un mínimo de tres veces.

PREPARACIÓN DE EXTRACTOS DE PROTEÍNAS Proteínas totales de Salmonella en medio de cultivo Las bacterias se cultivaron en los diferentes medios (LB, N, PCN) a 37ºC en agitación hasta alcanzar la fase estacionaria (DO600 ~ 2,8-3,0), se recogieron mediante centrifugación a 20000 x g durante 5 minutos a 4ºC y después se resuspendieron en PBS a 4ºC. Después de repetir dos veces los lavados con PBS, el sedimento se resuspendió en un volumen determinado de PBS, ajustando todas las muestras de manera que 7 μl corresponden a 0,005 unidades de DO600 (~5x106 bacterias) que es la cantidad que se utilizó en los geles de poliacrilamida. Seguidamente, a estos 7 μl de muestra se le agregó el tampón de lisis 6x (350 mM Tris-Cl pH 6,8, 600 mM ditiotreitol, 30% glicerol, 10% SDS, 0,012% azul de bromofenol) y se hirvieron durante 10 minutos. Finalmente, las muestras se centrifugaron 5 minutos a 20000 x g para retirar posibles restos de peptidoglicano y ADN. Proteínas totales de fibroblastos infectados con Salmonella Los fibroblastos se sembraron en 3 ml de medio DMEM con 5% SFB y 2 mM Lglutamina utilizando placas de 6 pocillos (9,5 cm2) (Nunc) y se infectaron con S. enterica serovar Typhimurium siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Después de los diferentes tiempos post-infección, las células infectadas se lavaron 4 veces con PBS a 4ºC y se agregaron 80 μl de tampón de lisis 1,5x a 95ºC. Seguidamente, y con la ayuda de un raspador celular, se recogió el lisado de células y se transfirió a tubos de 1,5 ml. Las muestras se hirvieron durante 10 minutos y posteriormente se centrifugaron 5 minutos a 20000 x g.

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Materiales y métodos

Para la detección de las proteínas MgtA-3xFLAG y MgtB-3xFLAG de Salmonella intracelular, los fibroblastos se sembraron en 100 ml de medio DMEM con 5% SFB y 2 mM L-glutamina utilizando placas de 500 cm2 de superficie (Nunc). A las 24 horas post-infección, las células se lavaron 4 veces con PBS a 4ºC. Seguidamente, se agregaron 10 ml de PBS con inhibidores de proteasas (Roche) a 4ºC y se despegaron las células infectadas con ayuda de un raspador celular. La muestra se transfirió a un tubo de 15 ml y se centrifugó a 3220 x g a 4ºC durante 15 minutos. El sedimento obtenido se resuspendió en 1 ml de PBS con 0,1% de SDS e inhibidores de proteasas para disgregar las membranas de la célula eucariota. En estas condiciones se incubó 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, el lisado se centrifugó a 20000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente, se retiró el sobrenadante y se lavó el sedimento dos veces con PBS. Finalmente, este sedimento de resuspendió en 80 μl de tampón de lisis 6x a 95ºC. Las muestras se hirvieron durante 10 minutos y posteriormente se centrifugaron 5 minutos a 20000 x g.

ENSAYOS DE DETECCIÓN DE PROTEÍNAS Microscopía de inmunofluorescencia Los fibroblastos se sembraron en 0,5 ml de medio DMEM con 5% SFB y 2 mM Lglutamina utilizando placas de 24 pocillos (Nunc) sobre lentillas de 12 mm de diámetro (Marienfeld) y se infectaron con S. enterica serovar Typhimurium siguiendo el protocolo descrito anteriormente. A las 2 y 24 horas post-infección se lavaron las células tres veces con 0,5 ml de PBS a 37ºC y se fijaron en 300 μl de paraformaldehído al 3% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se hicieron tres lavados con 0,5 ml de PBS y se incubaron las células con 40 μl de solución de bloqueo compuesta por 2% de suero de cabra (Sigma) y 0,2% de saponina en PBS (Sigma) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente las células se incubaron con los anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo durante 45 minutos a temperatura ambiente (40 μl). Pasado este tiempo, se hicieron tres lavados con 0,5 ml de PBS, se agregaron los anticuerpos secundarios diluidos igualmente en la solución de bloqueo y se realizó una nueva incubación de 45 minutos a temperatura ambiente. Los núcleos se marcaron con DAPI (4,6-diamino-2-fenilindol) 0,5 μg/ml durante 5 minutos. Finalmente, las lentillas se montaron en un portaobjetos con 5 μl de Prolong Gold Antifade (Molecular Probes) y se sellaron con esmalte de uñas.

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Materiales y métodos

Las muestras se visualizaron en un microscopio Olympus BX61 y las imágenes se tomaron con una cámara Olympus DP70 acoplada al microscopio. El software de captura de imágenes fue DP Controller y DP Manager y el de procesamiento, Adobe Photoshop. Inmunodetección de proteínas en soportes de membranas (“Western blot”) Las proteínas se separaron mediante electroforesis en geles de 10% de poliacrilamida y tampón Tris-HCl/tricina (Schagger y von Jagow, 1987). Se utilizó el equipo Mini-Protean 3 Cell (BIO-RAD) y una fuente Power Pac (BIO-RAD) para la electroforesis. Consecutivamente, las proteínas se transfirieron a membranas de polivinildeno difluorado (PDVF, Immobilon-P Millipore) humedecidas en metanol y equilibradas en Tris-HCl 48 mM, glicina 39 mM, 0,036% de SDS y metanol 20% a pH 8,5. La transferencia se realizó en un aparato Trans-Blot® Semi-Dry de BIO-RAD durante 1 hora a 15 V. Una vez terminada la transferencia, las membranas se bloquearon con 5% de leche desnatada diluida en TBS-T (Tris-HCl 20 mM a pH 7,5; NaCl 150 mM con 0,1% de Tween-20) durante al menos 1 hora a

temperatura ambiente. Posteriormente, las membranas se incubaron con el anticuerpo primario diluido en TBS-T con 5% de leche desnatada durante aproximadamente 18 horas a 4ºC. Después de lavar las membranas durante 5 minutos tres veces con TBS-T, se incubaron con el anticuerpo secundario diluido en TBS-T con 5% de leche desnatada durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron nuevamente tres veces con TBS-T. La posición y cantidad relativa de las proteínas reconocidas por los anticuerpos se detectaron mediante el ensayo de quimioluminiscencia basado en la reacción luciferina-luminol.

AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Extracción de ADN genómico de Salmonella El ADN genómico se obtuvo a partir de 6 ml de cultivo de la estirpe silvestre SL1344 de S. enterica serovar Typhimurium en LB en fase estacionaria (DO600 ~ 2,8-3,0). Las bacterias se recogieron por centrifugación a 10000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Con el sedimento se siguió el protocolo de extracción del kit QIAGEN Genomic DNA (QIAGEN). El ADN genómico se resuspendió finalmente en 400 μl de agua y se determinó la concentración en un NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer. La cantidad total de ADN que se obtuvo por preparación estaba en el rango de 90-130 μg. El ADN se fragmentó preparando una solución de 10-15 μg de ADN en 30 μl de agua. Se aplicaron tres pulsos de ultrasonido a baja potencia a la muestra, manteniéndola en

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Materiales y métodos

hielo. Posteriormente se confirmó la fragmentación por electroforesis en un gel de 1% de agarosa. Extracción de ARN Extracción de ARN de fibroblastos infectados con Salmonella Se utilizó este protocolo para los ensayos de transcriptómica de fibroblastos NRK49F infectados con Salmonella y el subsiguiente análisis de expresión génica mediante RTPCR cuantitativa. Las células se sembraron en 3 ml de medio DMEM con 5% SFB y 2 mM L-glutamina utilizando placas de 6 pocillos (9,5 cm2) (Nunc) y se infectaron con la estirpe silvestre y el mutante isogénico phoP de S. enterica serovar Typhimurium siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Después de 6 horas de infección, se realizó el aislamiento de ARN utilizando el kit SV Total RNA Purification Protocol (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Como control, se extrajo ARN de fibroblastos sin infectar, a los que se les añadió 15 μl de medio LB, igual al volumen de cultivo bacteriano añadido a las células infectadas. De cada extracción de obtuvieron alrededor de 2 μg de ARN de fibroblastos. Para la cuantificación de los niveles de expresión de genes de Salmonella intracelular, mediante RT-PCR cuantitativa, se aisló simultáneamente ARN y ADN de fibroblastos infectados. Para ello, las células se sembraron en 3 ml de medio DMEM con 5% SFB y 2 mM L-glutamina utilizando placas de 6 pocillos (9,5 cm2) (Nunc) y se infectaron con la estirpe silvestre y el mutante isogénico phoP de S. enterica serovar Typhimurium siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Después de 1, 4, 8 y 24 horas de infección se realizó el aislamiento de ARN y ADN utilizando el reactivo TRIZOL (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. De cada extracción de obtuvieron alrededor de 10 μg de ARN de fibroblastos. Seguidamente, se realizó un tratamiento con TURBO DNA-free (Ambion) para eliminar los posibles restos de ADN genómico de la muestra. La

concentración

y

pureza ®

espectrofotometría (NanoDrop

del

ARN

obtenido

se

cuantificó

mediante

ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer) y la calidad se

determinó utilizando un Bioanalyzer 2100 (Agilent, California, Estados Unidos de América). Extracción de ARN de Salmonella en medio de cultivo Para los ensayos de transcriptómica de Salmonella se aisló ARN de la estirpe silvestre y del mutante isogénico phoP de S. enterica serovar Typhimurium en la fase exponencial de crecimiento en medio LB (DO600 ~ 0,18-0,22). Además, se extrajo ARN de la

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Materiales y métodos

estirpe silvestre en la fase estacionaria de crecimiento (DO600 ~ 2,8-3,0). Para ello, se recolectaron ~2x109 bacterias en cada condición de crecimiento. El volumen del cultivo correspondiente se transfirió a un tubo conteniendo una mezcla de fenol y etanol (a la concentración final de 1 y 19% respectivamente) (McDowall et al., 1994). Tras una incubación en hielo durante 30 minutos, las bacterias se recogieron por centrifugación (3220 x g, 10 minutos, 4ºC) y se procesó con el kit SV Total RNA Purification Protocol (Promega). De cada extracción se obtuvieron alrededor de 60 μg de ARN de bacteria en la fase exponencial y 20 μg de bacteria en la fase estacionaria de crecimiento. Para los análisis de expresión génica mediante RT-PCR cuantitativa, se aisló ARN de la estirpe silvestre y el mutante isogénico phoP de S. enterica serovar Typhimurium en medio LB y en medio mínimo N. Se utilizaron ~ 2x109 bacterias en fase exponencial (DO600 ~ 0,180,22). El volumen del cultivo correspondiente se procesó utilizando el reactivo TRIZOL (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmente, con el ARN de bacteria obtenido se realizó un tratamiento con TURBO DNA-free (Ambion) para eliminar los posibles restos de ADN genómico de la muestra. De cada extracción se obtuvieron alrededor de 20 μg de ARN. La

concentración

y

pureza ®

espectrofotometría (NanoDrop

del

ARN

obtenido

se

cuantificó

mediante

ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer) y la calidad se

determinó utilizando un Bioanalyzer 2100 (Agilent, California, Estados Unidos de América). Extracción de ARN de Salmonella intracelular Para la extracción de ARN de bacterias intracelulares se optimizó el protocolo descrito anteriormente para Salmonella durante la infección de macrófagos J774.A1 (Eriksson et al., 2003). Para cada extracción, se utilizaron cinco placas de cultivo celular de 500 cm2 de superficie (Nunc), donde se sembraron los fibroblastos en 100 ml de medio DMEM con 5% SFB y 2 mM L-glutamina. Las células se infectaron con la estirpe silvestre o el mutante isogénico phoP de S. enterica serovar Typhimurium. Después de 24 horas post-infección, se retiró completamente el medio de cultivo de las células y se agregó 30 ml de la solución de lisis conteniendo fenol 1%, etanol 19% y 0,4% de SDS. Tras 30 minutos de incubación a 4ºC, se recogió el lisado de células y se transfirió a tubos de polipropileno de 50 ml (Sorvall), donde se centrifugó a 18000 x g durante 30 minutos a 4ºC para obtener las bacterias intracelulares. Tras retirar el sobrenadante, se hicieron tres lavados utilizando 1 ml de solución de fenol 1% y etanol 19%, centrifugando durante 10 minutos a 20800 x g. El sedimento de bacterias intracelulares se procesó usando el kit SV Total RNA Purification Protocol (Promega). De cada extracción se obtuvieron alrededor de 20 μg de ARN del

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Materiales y métodos

mutante phoP intracelular, mientras que de la estirpe silvestre se obtuvieron entre 0,5 y 1,5 μg de ARN. Finalmente, con el ARN de bacterias intracelulares obtenido se realizó un tratamiento con TURBO DNA-free (Ambion) para eliminar los posibles restos de ADN genómico de la muestra. La

concentración

y

pureza ®

espectrofotometría (NanoDrop

del

ARN

obtenido

se

cuantificó

mediante

ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer) y la calidad se

determinó utilizando un Bioanalyzer 2100 (Agilent, California, Estados Unidos de América).

ENSAYOS DE TRANSCRIPTÓMICA CON “MICROARRAYS” Análisis del patrón de expresión global de fibroblastos infectados con Salmonella Los microsoportes de ADN (“microarrays”) utilizados en este estudio están fabricados con oligonucleótidos de 70 nucleótidos de longitud que representan 26962 genes de Rattus norvegicus (Operon). Los oligonucleótidos se diseñaron a partir de la base de datos “Ensembl” del genoma de Rattus norvegicus versión v19.3b.2 (www.ensembl.org) y del “Proyecto de Genoma de Rata”. La impresión de los oligonucleótidos sobre los portaobjetos se realizó en el Laboratorio de Genómica y Microarrays de la Universidad de Cincinnati (Estados Unidos de América). El cristal de los portaobjetos está tratado químicamente con gamma amino propil silano (UltraGAPS, Corning). Para estos análisis de transcriptómica se realizaron 9 extracciones de ARN de fibroblastos no infectados, que representan 9 experimentos biológicos independientes. Estas muestras se agruparon para formar 3 mezclas diferentes que se utilizaron para realizar las hibridaciones de los “microarrays”. El mismo número de muestras se obtuvieron de fibroblastos infectados tanto con la estirpe silvestre como con el mutante phoP de S. enterica serovar Typhimurium. Amplificación y marcaje del ARN Con el fin de aumentar la cantidad de ARN mensajero (ARNm) de los fibroblastos, se amplificó la cantidad de ARNm original. La amplificación se realizó usando el kit MessageAmpTM II aRNA (Ambion). Durante el paso de la transcripción in vitro de la amplificación se utilizaron nucleótidos marcados con aminoalil [5-(3-aminoalil)-UTP)], que permite la incorporación de los fluorocromos mediante afinidad química. Se utilizaron 7,5 μg del ARN amplificado (ARNa) para el marcaje con los fluorocromos. Los fluorocromos

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Materiales y métodos

utilizados fueron Cyanine 3 (Cy3) y Cyanine 5 (Cy5) (CyDye™ Post-Labeling Reactive Dye Packs, Amersham Biosciences). En cada análisis se utilizó uno de los fluorocromos para la muestra “experimento” (fibroblastos infectados) y el otro para la muestra “control” (fibroblastos sin infectar). Se eliminaron nucleótidos no incorporados, sales y enzimas del ARNa mediante columnas de purificación (MessageAmpTM II aRNA, Ambion). Estas tareas fueron realizadas por el Servicio de Genómica del Centro Nacional de Biotecnología (CSIC). Hibridación, escaneado y cuantificación de la imagen Para cada hibridación se utilizaron al menos 250 pmoles de cada ARNa marcado con un fluorocromo (50-60 ng). Se resuspendió la mezcla de los dos ARNa marcados (Cy3/Cy5) en 100 μl de la solución de hibridación (SSC (NaCl 0,15 M; Na3C6H5O7 0,015 M), solución de Denharts 5x, formamida 50%, SDS 0,5%), calentándose a 95ºC durante 3 minutos con posterior enfriamiento en hielo durante 30 segundos. Sobre la cámara de hibridación se colocó el portaobjetos, en el cual se añadió la mezcla de ARNa marcado, incubándose en un baño de agua a 37ºC durante 16-20 horas. Tras repetidos lavados con soluciones decrecientes en sales (SSC 0,5x, 0,1x) y secado mediante centrifugación, se procedía al escaneado (GenePix 4000B, Axon Instruments) y cuantificación de señales de fluorescencia (programa GenePix Pro 5.1, Axon Instruments). Estas tareas fueron realizadas por el Servicio de Genómica del Centro Nacional de Biotecnología (CSIC). Análisis de datos La corrección del fondo de la intensidad de cada punto del “array” se realizó con el método "normexp" del paquete limma (Smyth, 2004) del proyecto Bioconductor (http://bioconductor.org). Las intensidades se transformaron a escala logarítmica en base 2. Para compensar desviaciones de las intensidades de cada punto debido a diferencias en la eficiencia del marcaje y/o en la detección de los fluorocromos usados en cada cristal, las intensidades se normalizaron mediante “loess” usando la función “normalizeWithinArrays” incluida en el paquete limma de Bioconductor (Smyth y Speed, 2003). Después se realizó una normalización de la intensidad entre réplicas mediante normalización cuantil usando la función “normalizeBetweenArrays” del paquete limma (Smyth y Speed, 2003). Con estas intensidades normalizadas, se ajustó un modelo lineal para cada gen (Smyth, 2004) usando el paquete limma y se estimó la expresión diferencial entre las dos muestras de ARN. Los genes diferencialmente expresados se identificaron usando el estadístico t del paquete limma y corrigiendo los valores de p mediante prueba de múltiples hipótesis (“multiple testing”) calculando la tasa de descubrimientos falsos (FDR) (Benjamini y Hochberg, 1995). Los cambios en la expresión de los genes se consideraron significativos cuando el valor M (log2

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Materiales y métodos

fibroblastos infectados/ fibroblastos no infectados) está en el rango -1,5 ≥ M ≥ 1,5 y el valor de p es menor de 0,05. Se utilizó el programa FIESTA para visualizar gráficamente los resultados al aplicar diferentes filtros estadísticos a los valores (Oliveros, 2007). El análisis de datos fue realizado por el Servicio de Genómica del Centro Nacional de Biotecnología (CSIC). Los resultados se representaron gráficamente como gráficos MA. Cada punto del grafico corresponde a un elemento del “microarray”. Los valores M (ordenada) son el logaritmo (log2) de la expresión diferencial. Los valores de A (abscisa) son el log2 de la intensidad de los puntos. M y A se calculan con los valores de intensidad de la condición a comparar (X) frente a la de referencia (Y): M = log 2 (X Y )

(

A = log2 X × Y

)

Los puntos cuyo valores M son positivos (parte superior del gráfico) corresponden a genes inducidos. Aquellos elementos con valores negativos M (parte inferior del gráfico) corresponden a genes reprimidos. Los genes muy expresados tienen altos valores A (derecha del gráfico) y los genes con nivel de expresión bajo tienen valores bajos A (izquierda del gráfico). Análisis de los cambios de expresión del genoma de Salmonella en el interior de fibroblastos El “microarray” SALGENOMICS ha sido desarrollado dentro del proyecto GEN2003-20234-C06 del Ministerio de Ciencia e Innovación, y con asistencia técnica e informática del Servicio de Genómica del Centro Nacional de Biotecnología (CSIC). El diseño de los oligonucleótidos que conforman el “microarray” SALGENOMICS se realizó sobre la secuencia del genoma de la estirpe SL1344 de S. enterica serovar Typhimurium (ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/pathogens/Salmonella). En noviembre del 2004, en el momento de comenzar el proyecto, estaban disponibles 20 “contigs” de la secuencia del genoma de SL1344. Estos “contigs”, que abarcan más del 95% del genoma, se utilizaron para el diseño de 6119 oligonucleótidos de 70 nucleótidos usando el sistema OliGO (http://www.bioalma.com). Estos oligonucleótidos incluyen 5116 fases de lectura abierta (ORFs) codificantes de proteínas, 21 ARN ribosomales (ARNr), 86 ARN de transferencia (ARNt), 51 ARN pequeños (“small RNA”), y 845 regiones intergénicas (IGRs). De las 5116 ORFs, 4369 son ortólogos a genes de S. enterica serovar Typhimurium previamente anotados en el genoma de la estirpe LT2 (McClelland et al., 2001), por lo que se mantuvo la

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Materiales y métodos

nomenclatura “STM” para evitar discrepancias con la nomenclatura oficial asignada por el Welcome Trust Sanger Institute. Los ARN pequeños y las ORFs predichas en la secuencia de SL1344, que no tenían un número STM asignado en la secuencia de LT2, se identificaron con números consecutivos a CNB1344-0001. Los 6119 elementos se imprimieron en el cristal por duplicado, situando cada duplicado en coordenadas diferentes. Para el análisis de los datos, cada duplicado se trató de forma individual, obteniendo de esta manera dos valores para cada elemento genético. Además, se incluyeron un total de 16 oligonucleótidos “control”, que abarcan genes de bacterias, diferentes a Salmonella, y genes de organismos eucariotas. Al igual que en el caso de los estudios de transcriptómica de fibroblastos infectados, se realizaron 9 extracciones independientes de ARN de bacterias. Con estas muestras se formaron 3 mezclas diferentes de ARN para generar el ADN copia (ADNc) usado en las 3 hibridaciones de los “microarrays”. De esta forma, se hicieron 9 extracciones de ARN de la estirpe silvestre en medio LB en la fase exponencial y estacionaria de crecimiento, y del mutante phoP en la fase exponencial en medio LB y en el interior de fibroblastos 24 horas post-infección. Debido a la ausencia de crecimiento de la estirpe silvestre en el interior de fibroblastos y a la escasa cantidad de material que se obtenía (0,5-1,5 μg de ARN por experimento), se incrementó el número de extracciones de ARN de esta estirpe hasta un total de 22. Las muestras obtenidas se agruparon igualmente para crear dos mezclas diferentes de material biológico. Transcripción reversa La transcripción reversa del ARN (~ 20 μg) se realizó con la enzima SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente, se purificaron las muestras de ADNc con el kit QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). Marcaje del ADN genómico y ADN copia Los fragmentos de ADN conteniendo 5-aminohexilacrilamido-dUTP (aha-dUTP) se sintetizaron a partir de 4 μg de ADN con la enzima exo-Klenow usando el kit BioPrime Plus Array CGH Indirect Genomic Labeling System (Invitrogen). Posteriormente, se procedió a acoplar los fluorocromos que reaccionan con el aha-dUTP: Alexa Fluor 647 para el ADNc y Alexa Fluor 555 para el ADN genómico. Finalmente se purificaron las muestras con el módulo de purificación y se determinó la cantidad de marca incorporada en el ADN utilizando un NanoDrop® ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer. Estas tareas fueron realizadas por el Servicio de Genómica del Centro Nacional de Biotecnología (CSIC).

43

Materiales y métodos

Hibridación, escaneado y cuantificación de la imagen Los cristales se pre-hibridaron durante 1 hora a 42ºC con una solución compuesta por SSC 6x, SDS 0,5% y albúmina sérica bovina (BSA) 1%. Se mezcló el ADNc y el ADN genómico en una relación 3:1 (500 pmoles y 166 pmoles respectivamente). Esta mezcla se redujo hasta un volumen de 10 µl, se le añadió 70-100 μl de solución de hibridación (formamida 50%, SSC 3x, SDS 1%, solución de Denharts 5x, dextransulfato 5%) y se incubó durante 5 minutos a 95ºC. La mezcla se aplicó al “microarray” y la hibridación se llevó a cabo durante toda la noche a 42ºC. Trascurrido este tiempo, se realizaron lavados en agitación (230 rpm): tres lavados de 5 minutos con SSPE 0,5x (SSPE 20x: NaCl 175,3 g/l; NaH2PO4 27,6 g/l; Na2EDTA 7,4 g/l; pH 7,4) y Tween-20 0,1% a 42ºC; tres lavados de 5 minutos con SSPE 0,5x a 42ºC y dos lavados de 5 minutos con SSPE 0,1x a 37ºC. Los cristales se secaron por centrifugación durante 1 minuto a 600 x g y se escanearon con el GenePix 4000B (Axon Instruments). Las imágenes se cuantificaron con el programa GenePix Pro 5.1 (Axon Instruments). Estas tareas fueron realizadas por el Servicio de Genómica del Centro Nacional de Biotecnología (CSIC). Análisis de datos El análisis de los datos obtenidos se realizó usando los paquetes limma (Smyth, 2004) y affy (Gautier et al., 2004) del proyecto Bioconductor (http://bioconductor.org). Para la corrección del fondo de la intensidad de cada punto del “array” se utilizó el método "normexp" de limma y se transformaron a escala logarítmica en base 2. Para compensar desviaciones de las intensidades de cada punto debido a la diferente eficiencia del marcaje o de detección de los fluorocromos entre las diferentes réplicas, las intensidades se normalizaron usando la función “normalize.quantiles” del paquete affy. Este proceso se realizó de forma individual para cada fluorocromo. La señal normalizada del genómico (“señal log DNA”) proporciona una buena estimación de la cantidad de ADN presente en cada punto del “microarray”, y por lo tanto es usada para corregir las diferencias en la señal que proviene de las muestras de ARN (“señal log RNA”). Esta señal de ARN corregida (logRNAsignalF) se normalizó nuevamente mediante normalización cuantil. Seguidamente, se ajustó un modelo lineal para cada gen (Smyth, 2004) usando el paquete limma y se estimó la expresión diferencial entre las dos muestras de ARN. Los genes diferencialmente expresados se identificaron usando el estadístico t del paquete limma y corrigiendo los valores de p mediante prueba de múltiples hipótesis (“multiple testing”) calculando la tasa de descubrimientos falsos (FDR) (Benjamini y Hochberg, 1995). Los cambios en la expresión de los genes se consideraron significativos cuando el valor M está en el rango -2 > M > 2 y el valor de p ajustado es menor de 0,1. Durante el análisis se trató cada punto del array como

44

Materiales y métodos

genes diferentes, de esta manera, sólo cuando los dos puntos que corresponden a un gen particular ubicados en diferentes coordenadas del “microarray” tengan valores de M > 2 y M < -2 y el valor de p ajustado sea menor de 0,1, los cambios de expresión de este gen se consideran

significativos.

Se

utilizó

el

programa

FIESTA

(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/FIESTA) para visualizar gráficamente los resultados al aplicar diferentes filtros estadísticos a los valores (Oliveros, 2007). En los resultados presentados en esta Tesis se omitieron los valores de expresión obtenidos en los oligonucleótidos que representan regiones intergénicas, por considerar esta información fuera de los objetivos propuestos en este trabajo. La forma de hibridación usada, ADN copia versus ADN genómico, permite las comparaciones entre diferentes estirpes y/o condiciones de crecimiento de la bacteria como se ha descrito anteriormente (Eriksson et al., 2003). El análisis de datos fue realizado por el Servicio de Genómica del Centro Nacional de Biotecnología (CSIC).

ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA MEDIANTE PCR CUANTITATIVA Transcripción reversa de ARN Para obtener el ADNc, se sometió el ARN a transcripción reversa utilizando el kit High Capacity cDNA Archive (Applied Biosystems) en un volumen total de 100 μl y siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la validación de los resultados del análisis de transcriptómica de fibroblastos infectados se utilizó 1 μg de ARN. Por otro lado, para corroborar los datos obtenidos de los cambios de expresión del genoma de Salmonella en el interior de fibroblastos, se utilizaron 3 μg de ARN de fibroblastos infectados. PCR cuantitativa Para la cuantificación de los niveles de expresión de genes de fibroblastos en respuesta a la infección por Salmonella y de los genes mgtA, mgtB y mgtC de bacteria crecida en medio N, los ensayos de PCR cuantitativa se realizaron sobre el ADNc obtenido de la reacción de transcripción reversa de las muestras de ARN. En el caso de los niveles de expresión de genes de Salmonella intracelular, la cuantificación se llevó a cabo sobre el ADNc y el ADN genómico de fibroblastos infectados. Se utilizaron oligonucleótidos específicos para cada gen diseñados con el programa Primer Express 1.0 (Applied Biosystems) (Tabla A3 del Anexo I). En el caso de los genes de fibroblastos se utilizaron las secuencias de ADNc obtenidas en la base de datos del genoma de

45

Materiales y métodos

Rattus norvegicus (www.ensembl.org). Para el análisis de genes de Salmonella, los oligonucleótidos se diseñaron utilizando la secuencia del genoma de la estirpe SL1344 (McClelland et al., 2001). Las reacciones de PCR se realizaron en la unidad de amplificación ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems), usando SYBR Green como sistema de detección del producto amplificado (Power SYBR Green PCR Master Mix, Applied Biosystems). Para cada reacción de PCR se usó un volumen de 15 μl, donde cada oligonucleótido está a una concentración de 400 nM. El programa de amplificación consistió en: (i) 10 minutos a 95ºC y (ii) 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC; 1 minuto a 60ºC. En cada análisis se realizó una curva de disociación para verificar que sólo se amplificó un producto de PCR con cada par de oligonucleótidos usado. Para la cuantificación de los niveles de expresión se usó el método por comparación de CT (ΔΔCT), una vez que se comprobó que la eficiencia de amplificación de los oligonucleótidos usados para cada gen era similar (User Bulletin #2, ABI Prism 7700 Sequence Detection System). Los niveles de expresión de los genes de fibroblastos infectados se normalizaron con los valores de ARN mensajero del gen que codifica β-actina, y se representaron como niveles de expresión relativa a fibroblastos sin infectar. Los valores de expresión de los genes mgtA, mgtB y mgtC de Salmonella en medio de cultivo se normalizaron con los valores de ARN mensajero del gen ompA. Por otra parte, los datos de la cuantificación de la expresión de los genes de Salmonella intracelular se normalizaron con la cantidad de ADN genómico para cada muestra (Drecktrah et al., 2006). De esta forma se corrigen las diferencias en la cantidad de ARN de bacterias intracelulares debido a la distinta tasa de proliferación de la estirpe silvestre y el mutante phoP en el interior de fibroblastos. Finalmente, los resultados son expresados en cantidades de expresión relativa con respecto a Salmonella en medio de cultivo LB en fase exponencial de crecimiento.

ANÁLISIS ESTADÍSTICOS Los análisis estadísticos de todos los datos de este trabajo, exceptuando los obtenidos mediante los experimentos de “microarrays”, se realizaron con el programa GraphPad Prism 5 (GraphPad Inc., San Diego, California, Estados Unidos de América).

46

RESULTADOS

Capítulo 1 Análisis global de la respuesta de fibroblastos a la infección por Salmonella enterica serovar Typhimurium

Resultados

El estudio de la interacción patógeno-hospedador constituye un requisito importante para comprender los mecanismos de la patogénesis en enfermedades infecciosas. El análisis global de la expresión del genoma (transcriptómica) ha permitido identificar en varios casos funciones de la célula hospedadora que juegan un papel importante en la infección. En el ejemplo de Salmonella existen tres estudios realizados en cultivos de macrófagos y células epiteliales en los que se investigó la respuesta de la célula hospedadora a la infección por Salmonella (Detweiler et al., 2001; Eckmann et al., 2000; Rosenberger et al., 2000). En todos ellos, la bacteria muestra un fenotipo de crecimiento en el interior de la célula infectada. Nuestro primer objetivo fue caracterizar, mediante abordajes similares, la respuesta del hospedador en condiciones en las que Salmonella no prolifera dentro de la vacuola. Como se mencionó en la introducción, el sistema de dos componentes PhoP-PhoQ de Salmonella regula el control de la proliferación durante la infección de fibroblastos. Así, un mutante phoP presenta un fenotipo de sobrecrecimiento en el interior de este tipo celular (Fig. 1). Nuestra hipótesis inicial planteaba una respuesta celular diferente entre fibroblastos que albergan un escaso número de bacteria intracelular en comparación con aquellos que contienen muchas bacterias en su interior (Fig. 2). Esta respuesta diferencial podría revelar funciones de la célula hospedadora involucradas en el control del crecimiento intracelular de Salmonella. Nos propusimos estudiar el patrón de respuesta a nivel de ARN mensajero de fibroblastos NRK-49F de rata infectados con la estirpe silvestre o el mutante phoP del serovar Typhimurium. Escogimos para ello seis horas de infección, tiempo en el que se inicia la fase de crecimiento en el mutante phoP (Tesis Doctoral M. Martínez Moya, 1999). Como herramienta, utilizamos un microsoporte (“microarray”) comercial que representa 26962 genes de Rattus norvegicus (ver materiales y métodos). Consideramos genes diferencialmente expresados aquellos que presentan cambios en sus niveles de expresión de al menos 3 veces en fibroblastos infectados en relación a fibroblastos sin infectar (-1,5 ≥ M ≥ 1,5). Los resultados obtenidos revelan que los fibroblastos infectados con la estirpe silvestre experimentan cambios en la expresión de 175 genes con respecto a las células sin infectar. De éstos, 24 genes se muestran inducidos (Fig. 3) mientras que los 151 restantes presentan valores de expresión disminuidos (Fig. 3, tabla A5). Aproximadamente, el 40% de estos genes con valores de expresión negativos son de función desconocida. Por otra parte, los fibroblastos infectados con el mutante phoP sufren cambios

51

Capítulo 1

50 45

***

Ipro (ufc 24h/ufc 2h)

40 35 30 25 20 15 10 5 0 wt

phoP

Figura 1. Índice de proliferación (Ipro) de la estirpe silvestre SV5015 de S. enterica serovar Typhimurium y el mutante isogénico phoP (MD1120) en el interior de la línea de fibroblastos NRK-49F. El valor de Ipro resulta de calcular el cociente entre el número de las bacterias viables a las 24 horas en relación a las 2 horas post-infección. Los valores mostrados corresponden a la media y a la desviación estándar de tres experimentos independientes. Se realizó análisis estadístico de los datos mediante prueba t no pareada de las diferencias entre las dos medias (p < 0,05), ***p < 0,001.

A

Estirpe silvestre 24h p.i.

B

10 μm

Mutante phoP 24h p.i.

10 μm

Figura 2. Comportamiento de S. enterica serovar Typhimurium en el interior de la línea de fibroblastos NRK-49F a las 24 horas post-infección. Las células se infectaron con la estirpe silvestre SV5015 (panel A) y el mutante isogénico phoP MD1120 (panel B). Obsérvese el fenotipo de sobrecrecimiento de Salmonella resultado de la perdida de funcionalidad del sistema PhoP-PhoQ. Se realizó inmunomarcaje con un anticuerpo policlonal anti-LPS. Como secundario se utilizó un anticuerpo de cabra anti-conejo acoplado al fluorocromo Alexa 488 (verde). Los núcleos de los fibroblastos se tiñeron con DAPI (0,5 μg/ml, azul).

52

Resultados

de al menos tres veces en 25 de sus genes, todos ellos con expresión aumentada con respecto a células no infectadas (Fig. 3).

INDUCIDOS

A

7

17

B

8

REPRIMIDOS

151

0

0

Fibroblastos NRK-49F infectados con la estirpe silvestre Fibroblastos NRK-49F infectados con el mutante phoP

Figura 3. Número de genes de fibroblastos NRK-49F diferencialmente expresados tras 6 horas de infección con la estirpe silvestre SV5015 de S. enterica serovar Typhimurium o el mutante MD1120 (phoP) con respecto a fibroblastos sin infectar. (A) Genes inducidos (M ≥ 1,5; valor p < 0,05). (B) Genes reprimidos (M ≤ -1,5; valor p < 0,05). El valor de M representa el logaritmo de la expresión diferencial de cada gen (M = log2 fibroblastos infectados/fibroblastos sin infectar)

Un grupo de 17 genes aumentaron sus niveles de expresión en fibroblastos infectados por la estirpe silvestre y por el mutante phoP (Fig. 3), de los cuales 7 están relacionados con respuesta inmune innata (Tabla 1, fig. 4 y 5). Tal es el caso de las quimioquinas CINC-1 (“cytokine-induced neutrophil chemoattractant 1”), CINC-2α, CINC-2β, CINC-3, CCL20 (“chemokine C-C motif ligand 20”) y CCL22. Tanto las proteínas CINC como CCL20 y CCL22 son pequeñas proteínas que median el reclutamiento de leucocitos a sitios de inflamación (Charo y Ransohoff, 2006). Además, observamos la inducción del gen que codifica RIP-2 (“receptor interacting protein 2”), un componente de la ruta de activación del factor de transcripción NF-κβ dependiente de los receptores solubles de tipo NOD (“nucleotide-binding oligomerization domain”) (Park et al., 2007). Otros genes de este grupo, que aumentan sus valores de expresión en respuesta a la infección por Salmonella, son los que codifican la metaloproteinasa de matriz 3 (MMP-3), la manganeso superóxido dismutasa (MnSOD) y el receptor farnesoide X (FXR) (Tabla 1, fig. 4 y 5). La proteína MMP-3 se ha asociado con la respuesta inmune ante la invasión de patógenos como Citrobacter rodentium, Yersinia enterocolitica y S. enterica serovar Typhimurium (Handley y Miller, 2007; Li et al.,

53

Capítulo 1

2004). Por otra parte, MnSOD funciona como una molécula antioxidante que protege la célula ante los efectos dañinos de los superóxidos generados en respuesta a estrés celular (Wong et al., 1996). Finalmente, FXR es un miembro de la superfamilia de receptores nucleares (NR) que es activado por ácidos biliares (Edwards et al., 2002a). Recientemente se ha demostrado que FXR está relacionado con el mantenimiento de la integridad del epitelio intestinal y en el control del crecimiento bacteriano en el intestino delgado (Inagaki et al., 2006). Al comparar los genes que aumentan sus niveles de expresión de forma diferencial entre las células infectadas con la estirpe silvestre y con el mutante phoP, encontramos también genes relacionados con respuesta inmune innata e inflamación (Tablas 2 y 3, fig. 4 y 5). Tal es el caso de las quimioquinas CCL2 y CXCL10 y de la proteína de adhesión ICAM-1 (“intercellular adhesion molecule-1”) (Albelda et al., 1994; Charo y Ransohoff, 2006). Igualmente hay inducción de la expresión de los genes que codifican las citoquinas G-CSF (“granulocyte colony-stimulating factor”) y GM-CSF (“granulocyte-macrophage colonystimulating factor”), factores de crecimiento hematopoyéticos relacionados con la diferenciación, proliferación, supervivencia y activación de los neutrófilos y sus precursores. En particular, la citoquina G-CSF aumenta propiedades funcionales de los neutrófilos como la quimiotaxis, la fagocitosis y la actividad bactericida (Barreda et al., 2004). Es preciso señalar que, aunque estos genes presentan valores de expresión diferentes entre los fibroblastos infectados con la estirpe silvestre y con el mutante phoP, en ambas situaciones se registra la misma tendencia de aumento de la expresión con respecto a células sin infectar (Tablas 2 y 3), no obstante, el cambio relativo de expresión es inferior a tres veces en fibroblastos infectados con una u otra estirpe.

54

Resultados

Fibroblastos infectados (estirpe silvestre) → fibroblastos sin infectar 5

4

CINC-3 3

FXR

2

CINC-2α CCL22 RIP-2

M

1

CCL20 G-CSF CINC-2β MnSOD CXCL10 ICAM-1

CINC-1 MMP-3

0

-1

IKL -2

Ret-3

Tm3

CAP-1 Tm3

RPS2

-3

RPS2

-4

-5 6

8

10

A

12

14

16

Genes inducidos en fibroblastos infectados tanto con la estirpe silvestre como con el mutante phoP (M ≥ 1,5; valor p < 0,05) Genes inducidos sólo en fibroblastos infectados con la estirpe silvestre (M ≥ 1,5; valor p < 0,05) Genes reprimidos en fibroblastos infectados con la estirpe silvestre seleccionados para validación por RT-PCR cuantitativa (M ≤ -1,5; valor p < 0,05)

Figura 4. Gráfico MA de los valores de expresión de genes de fibroblastos NRK-49F después de 6 horas de infección con la estirpe silvestre SV5015 de S. enterica serovar Typhimurium, con respecto a los registrados en fibroblastos no infectados. El eje de las ordenadas muestra el valor M que representa el logaritmo de la expresión diferencial de cada gen (log2 infectados/no infectados). El eje de las abscisas muestra el valor A, representando el logaritmo de la intensidad de señal de cada punto (log2 √infectados x no infectados ). En color gris se muestran todos los elementos del “microarray”.

55

Capítulo 1

Fibroblastos infectados (phoP) → fibroblastos sin infectar 5

CINC-3

4

CCL20 CINC-1

3

MMP-3 CINC-2α MnSOD RIP-2 FXR CCL22 GM-CSF

2

CINC-2β CCL2

ICAM-1

M

1

0

-1

-2

-3

-4

-5

6

8

10

12

14

16

A

Genes inducidos en fibroblastos infectados tanto con la estirpe silvestre como con el mutante phoP (M ≥ 1,5; valor p < 0,05) Genes inducidos sólo en fibroblastos infectados con el mutante phoP (M ≥ 1,5; valor p < 0,05)

Figura 5. Gráfico MA de los valores de expresión de genes de fibroblastos NRK-49F después de 6 horas de infección con el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium, con respecto a los registrados en fibroblastos no infectados. El eje de las ordenadas muestra el valor M que representa el logaritmo de la expresión diferencial de cada gen (log2 infectados/no infectados). El eje de las abscisas muestra el valor A, representando el logaritmo de la intensidad de señal de cada punto (log2 √infectados x no infectados ). En color gris se muestran todos los elementos del “microarray”.

56

Tabla 1. Genes de fibroblastos NRK-49F inducidos al menos tres veces (M ≥ 1,5; valor p < 0,05) en respuesta a la infección con las estirpes SV5015 (silvestre) y MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium (6 horas post-infección). Como referencia se usaron en cada caso fibroblastos sin infectar. Los nombres de los genes fueron tomados directamente de la base de datos del genoma de Rattus norvegicus (www.ensembl.org). Expresión relativa a fibroblastos NRK-49F sin infectar (valor M) Valor p

Fibroblastos infectados con el mutante phoP

Valor p

3,22

0,00002

3,79

0,00271

Growth regulated protein (CXCL1) (CINC1)

2,21

0,00393

3,21

0,00042

ENSRNOG00000002826

Estradiol 17 beta-dehydrogenase 7

2,97

0,00001

2,93

0,00097

ENSRNOG00000002832

Monocarboxylate transporter 8

2,86

0,00001

2,38

0,00041

ENSRNOG00000007166

Similar to RIKEN cDNA A930008A22

2,36

0,00001

2,00

0,00291

ENSRNOG00000007192

Nucleoporin 160 (predicted)

2,42

0,00003

1,74

0,00067

ENSRNOG00000007197

Farnesoid X receptor

2,08

0,00006

1,62

0,00144

ENSRNOG00000008993

Matrix metalloproteinase-3 (MMP-3)

1,69

0,00135

2,57

0,00058

ENSRNOG00000009005

Solute carrier family 21 member 2

1,86

0,00073

1,66

0,01396

Gen

Descripción

ENSRNOG00000002792

Macrophage inflammatory protein 2 (CINC3)

ENSRNOG00000002802

Fibroblastos infectados con la estirpe silvestre

57

Tabla 1. Continuación Expresión relativa a fibroblastos NRK-49F sin infectar (valor M) Gen

Descripción

Fibroblastos infectados con la estirpe silvestre

Valor p

Fibroblastos infectados con el mutante phoP

Valor p

ENSRNOG00000009389

Receptor interacting protein (RIP2)

1,54

0,00127

1,87

0,00060

ENSRNOG00000015992

Small inducible cytokine A20 (CCL20)

2,66

0,00066

4,02

0,00015

Olfactory receptor gene Olr122

2,57

0,00019

2,20

0,03576

ENSRNOG00000016535

Macrophage-derived chemokine CCL22

1,92

0,00093

1,67

0,01010

ENSRNOG00000019048

Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial

1,51

0,00153

1,96

0,00131

ENSRNOG00000022398

Enzymatic glycosylation-regulating gene

1,81

0,00008

1,56

0,00155

ENSRNOG00000028043

Macrophage inflammatory protein-2-alpha (CINC2α)

2,16

0,00014

3,18

0,00233

ENSRNOG00000028049

Macrophage inflammatory protein-2-beta (CINC2β)

2,15

0,00001

2,34

0,00031

ENSRNOG00000016005

58

Tabla 2. Genes de fibroblastos NRK-49F inducidos al menos tres veces (M ≥ 1,5; valor p < 0,05) en respuesta a la infección con la estirpe SV5015 (silvestre) de S. enterica serovar Typhimurium (6 horas post-infección). Como referencia se usaron fibroblastos sin infectar. Los nombres de los genes fueron tomados directamente de la base de datos del genoma de Rattus norvegicus (www.ensembl.org). Expresión relativa a fibroblastos NRK-49F sin infectar (valor M) Gen

Descripción

Fibroblastos infectados con la estirpe silvestre

Valor p

Fibroblastos infectados con el mutante phoP

Valor p

Granulocyte colony-stimulating factor 3

2,03

0,00429

1,46

0,00146

ENSRNOG00000008533

Eukaryotic translation initiation factor 2c 2

1,87

0,02025

1,38

0,00127

ENSRNOG00000009008

RAB39, member RAS oncogene family (predicted)

1,82

0,00006

1,15

0,02743

ENSRNOG00000010803

Gamma-aminobutyric-acid receptor alpha-5 subunit

1,59

0,00004

0,81

0,00743

ENSRNOG00000020679

Intercellular adhesion molecule-1

1,59

0,00133

1,47

0,00133

ENSRNOG00000022256

Small inducible cytokine B10 precursor (CXCL10)

1,56

0,00011

1,10

0,05149

ENSRNOG00000028067

Olfactory receptor gene Olr1491

1,64

0,00016

1,26

0,00784

59

ENSRNOG00000008525

Tabla 3. Genes de fibroblastos NRK-49F inducidos al menos tres veces (M ≥ 1,5; valor p < 0,05) en respuesta a la infección con la estirpe MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium (6 horas post-infección). Como referencia se usaron fibroblastos sin infectar. Los nombres de los genes fueron tomados directamente de la base de datos del genoma de Rattus norvegicus (www.ensembl.org). Expresión relativa a fibroblastos NRK-49F sin infectar (valor M) Gen

Descripción

Fibroblastos infectados con la estirpe silvestre

Valor p

Fibroblastos infectados con el mutante phoP

Valor p

60

ENSRNOG00000000246

Similar to X83328 protein (predicted)

0,96

0,05897

1,62

0,00144

ENSRNOG00000002460

Plasminogen activator inhibitor-2, type A (PAI2A)

1,36

0,00247

1,78

0,00060

ENSRNOG00000007159

Small inducible cytokine A2 (CCL2)

0,84

0,06958

2,25

0,00210

ENSRNOG00000008999

Alpha-2U globulin PGCL3

0,32

0,01610

2,28

0,00808

ENSRNOG00000016147

Differentation-associated NA-dependent inorganic phosphate cotransporter

0,80

0,01629

1,57

0,03590

ENSRNOG00000019141

Cholesterol 25-hydroxylase (predicted)

0,91

0,00072

1,51

0,00973

ENSRNOG00000021276

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2)

-0,21

0,21507

1,58

0,00280

ENSRNOG00000026805

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)

1,01

0,00827

1,71

0,01345

Resultados

Como se aprecia en la figura 3 el número de genes diferencialmente expresados en fibroblastos infectados con cada estirpe de Salmonella difiere considerablemente. Así, los resultados muestran un grupo de genes reprimidos en las células infectadas con la estirpe silvestre (un total de 151), mientras que en los fibroblastos infectados con el mutante phoP no aparecen genes que disminuyan sus niveles de expresión (Fig. 3). Interpretamos estas diferencias basándonos en las características de la infección de los fibroblastos por Salmonella. Así, incluso en las condiciones más óptimas de invasión, se alcanzan valores de un 40% de fibroblastos infectados. En el caso del mutante phoP, la heterogeneidad de las células infectadas aumenta, ya que después de la infección coexisten fibroblastos no infectados y otros conteniendo diferente número de bacterias en su interior. En esta situación, sólo aquellos genes que experimenten cambios de expresión muy pronunciados serían los identificados como diferencialmente expresados. El presente estudio comprende el primer análisis de transcriptómica realizado en fibroblastos en cultivo infectados con S. enterica serovar Typhimurium en condiciones de ausencia de crecimiento de las bacterias intracelulares. Los resultados obtenidos mediante el análisis de transcriptómica en fibroblastos infectados con la estirpe silvestre y el mutante phoP de Salmonella, indican que se produce principalmente el aumento en los niveles de expresión de genes asociados a respuesta inmune innata e inflamación, en particular de aquellos que codifican quimioquinas y la molécula de adhesión ICAM-1. Con el fin de confirmar los niveles de expresión de algunos genes seleccionados decidimos utilizar un método experimental independiente como la RT-PCR cuantitativa (Chuaqui et al., 2002). Para ello escogimos un grupo de genes que se inducen tanto en fibroblastos infectados con la estirpe silvestre como en los infectados con el mutante phoP (Tabla 1, fig. 4 y 5, genes en color rojo). Tal es el caso de los genes que codifican las quimioquinas CINC-1, CINC-2β, CINC-3 y CCL20, la molécula de adhesión ICAM-1 y las proteínas RIP-2 y MMP-3. Observamos que estos genes aumentan los niveles de expresión en los fibroblastos infectados con Salmonella después de seis horas en comparación con las células sin infectar, independientemente de la estirpe usada para realizar la infección (Fig. 6 y 7). De esta forma, se validaron los resultados obtenidos en los análisis de transcriptómica.

61

Niveles de expresión relativos a células sin infectar (log10)

Capítulo 1

4

CCL20

CINC-1

CINC-2β

CINC-3

3 2 1 0

4 3 2 1 0

Fibroblastos NRK-49F infectados con la estirpe silvestre

Fibroblastos NRK-49F infectados con el mutante phoP

Figura 6. Niveles de expresión de los genes ccl20, cinc-1, cinc-2β y cinc-3 de fibroblastos NRK-49F infectados con la estirpe silvestre SV5015 o el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium cuantificados por RT-PCR cuantitativa. Las muestras corresponden a fibroblastos NRK-49F infectados durante 6 horas. Los datos, normalizados con los valores de ARN mensajero del gen que codifica β-actina, representan el log10 de la expresión relativa en las células infectadas con respecto a las células sin infectar. Los valores mostrados corresponden a la media y a la desviación estándar de tres experimentos independientes. Se realizó análisis estadístico de los datos mediante prueba t no pareada de las diferencias entre las dos medias (p < 0,05).

62

Niveles de expresión relativos a células sin infectar (log10)

Resultados

ICAM-1

RIP-2

1,5 1,0 0,5 0,0

MMP-3 1,5 1,0

Fibroblastos NRK-49F infectados con la estirpe silvestre

0,5

Fibroblastos NRK-49F infectados con el mutante phoP

0,0

Figura 7. Niveles de expresión de los genes icam-1, rip-2 y mmp-3 de fibroblastos NRK-49F infectados con la estirpe silvestre SV5015 o el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium cuantificados por RT-PCR cuantitativa. Las muestras corresponden a fibroblastos NRK-49F infectados durante 6 horas. Los datos, normalizados con los valores de ARN mensajero del gen que codifica β-actina, representan el log10 de la expresión relativa en las células infectadas con respecto a las células sin infectar. Los valores mostrados corresponden a la media y a la desviación estándar de tres experimentos independientes. Se realizó análisis estadístico de los datos mediante prueba t no pareada de las diferencias entre las dos medias (p < 0,05).

63

Capítulo 1

Decidimos realizar este análisis de cuantificación relativa de niveles de expresión en un grupo de genes que muestran represión en fibroblastos infectados con la estirpe silvestre, pero que no presentan cambios de expresión en aquellos infectados con el mutante phoP (Tabla 4). Es el caso de los genes que codifican la quinasa ligada a integrina (ILK), la tropomiosina 3 (Tm3), el reticulón 3 (Ret-3) y la proteína asociada a ciclasa 1 (CAP-1) (Fig. 4, genes en color violeta). Seleccionamos estos genes por estar relacionados con la regulación del citoesqueleto de actina y el tráfico de membranas (Gunning et al., 2008; Hubberstey y Mottillo, 2002; Wakana et al., 2005) y con la invasión de bacterias patógenas en células epiteliales (Wang et al., 2006). De igual forma, quisimos confirmar mediante RT-PCR cuantitativa los valores de represión del gen que codifica la proteína ribosomal S2 (RPS2) en células infectadas con la estirpe silvestre. Como se observa en la figura 8, los valores obtenidos en cuanto a los niveles de expresión de estos genes son similares entre células no infectadas y células infectadas con Salmonella (valores logarítmicos cercanos a cero), independientemente de la estirpe utilizada, difiriendo de la información obtenida mediante el análisis de transcriptómica de estos genes. La técnica de “microarrays” y RT-PCR cuantitativa tienen limitaciones inherentes que pueden influir en los datos obtenidos por cada método. Estudios recientes han determinado que el nivel de correlación entre ambas técnicas es alto en genes que muestran un incremento superior a 1,5 veces en sus niveles de expresión. Por otro lado, la correlación es baja en el caso de genes con cambios de expresión negativos o inferiores a 1,5 veces (Dallas et al., 2005; Morey et al., 2006). En su conjunto, estos resultados sugieren que la respuesta de fibroblastos infectados con S. enterica serovar Typhimurium se caracteriza principalmente por la activación de genes relacionados con respuesta inmune innata e inflamación, independientemente de la presencia del sistema PhoP-PhoQ de Salmonella. Este tipo de respuesta es similar a la observada en células epiteliales y macrófagos infectados igualmente con S. enterica (Detweiler et al., 2001; Eckmann et al., 2000; Rosenberger et al., 2000).

64

Niveles de expresión relativos a células sin infectar (log10)

Resultados

Tm3

CAP-1

Ret-3

RPS2

ILK

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 -0,1

0,5

Fibroblastos NRK-49F infectados con la estirpe silvestre

0,4 0,3

Fibroblastos NRK-49F infectados con el mutante phoP

0,2 0,1 0,0 -0,1

Figura 8. Niveles de expresión de genes de fibroblastos NRK-49F infectados con la estirpe silvestre SV5015 o el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium cuantificados por RT-PCR cuantitativa. Las muestras corresponden a fibroblastos NRK-49F infectados durante 6 horas. Los datos, normalizados con los valores de ARN mensajero del gen que codifica β-actina, representan el log10 de la expresión relativa en las células infectadas con respecto a las células sin infectar. Los valores mostrados corresponden a un único experimento.

65

Tabla 4. Genes de fibroblastos NRK-49F reprimidos al menos tres veces (M ≤ -1,5; valor p < 0,05) en respuesta a la infección con la estirpe SV5015 (silvestre) de S. enterica serovar Typhimurium (6 horas post-infección). Como referencia se usaron fibroblastos sin infectar. Los nombres de los genes fueron tomados directamente de la base de datos del genoma de Rattus norvegicus (www.ensembl.org). Expresión relativa a fibroblastos NRK-49F sin infectar (valor M) Gen

Descripción

Fibroblastos infectados con la estirpe silvestre

Valor p

Fibroblastos infectados con el mutante phoP

Valor p

Reticulon 3

-1,52

0,00005

0,46

0,35249

ENSRNOG00000027662

40S ribosomal protein S2

-2,75

0,00019

-0,21

0,57045

ENSRNOG00000014179

40S ribosomal protein S2

-2,72

0,00008

-0,34

0,45930

ENSRNOG00000017441

Tropomyosin 3

-1,99

0,00013

0,42

0,59372

ENSRNOG00000017441

Tropomyosin 3

-2,10

0,00011

0,26

0,76280

ENSRNOG00000013492

Adenylyl cyclase-associated protein 1 (CAP-1)

-1,76

0,00015

0,45

0,41015

ENSRNOG00000018993

Integrin-linked kinase (ILK)

-1,68

0,00063

0,32

0,17359

66

ENSRNOG00000021202

Capítulo 2 Estudio de transcriptómica de Salmonella enterica serovar Typhimurium en el interior de fibroblastos

Resultados

Hasta la fecha se han llevado a cabo diferentes análisis globales de la expresión del genoma de S. enterica en el interior de macrófagos (Eriksson et al., 2003; Faucher et al., 2006) y células epiteliales mantenidas en cultivo (Hautefort et al., 2007). A pesar de que estos estudios han revelado información sobre el probable ambiente de la vacuola en la que Salmonella reside, en ambos, las bacterias intracelulares proliferan masivamente. Pensamos por tanto que pueden reflejar sólo parcialmente la situación de las bacterias intracelulares observada in vivo, donde se alcanza un promedio de 2-3 bacterias por célula infectada (Geddes et al., 2007; Grant et al., 2008; Salcedo et al., 2001). Nos planteamos así realizar el análisis del patrón de expresión génica de S. enterica serovar Typhimurium durante la infección de fibroblastos NRK-49F, un tipo celular donde Salmonella mantiene un estado de ausencia de crecimiento (Cano et al., 2001; Martínez-Moya et al., 1998). Optimización de protocolos de obtención de ARN de Salmonella en el interior de fibroblastos infectados La obtención de ARN de bacterias durante la infección de células eucariotas, así como la cantidad y calidad del mismo, son determinantes para el estudio del transcriptoma de las bacterias intracelulares (Hinton et al., 2004). Decidimos utilizar el método desarrollado por Eriksson et al., consistente en la lisis diferencial de las células infectadas, permitiendo así la separación de Salmonella de la célula hospedadora antes de la extracción de ARN (Eriksson et al., 2003). Este método tiene dos características clave: la primera es el uso de un detergente iónico como el SDS a una concentración tal que disgrega la membrana de la célula eucariota sin afectar a la integridad de la pared bacteriana. La segunda es la presencia de fenol y etanol que estabilizan de forma instantánea el ARN bacteriano impidiendo su degradación (Eriksson et al., 2003; McDowall et al., 1994). Este método fue descrito originalmente para aislar ARN de S. enterica en el interior de macrófagos en cultivo (Eriksson et al., 2003). En primer lugar comprobamos si era aplicable a muestro modelo de infección en fibroblastos. Las pruebas preliminares indicaron que con una concentración de SDS de 0,1 y 0,2%, tal cual describe el método original, no se lograba la lisis y degradación de los fibroblastos y en consecuencia obteníamos contaminación con el ARN eucariota (Fig. 9A-C). Al aumentar la concentración de SDS a 0,4% comprobamos que el ARN obtenido del mutante phoP intracelular era similar al recuperado en bacterias crecidas en medio de cultivo LB, sin mostrar restos aparentes de ARN eucariota (Fig. 9D). Al utilizar este protocolo para obtener ARN de la estirpe silvestre intracelular, observamos un patrón electroforético que presenta trazas de ARN eucariota (Fig. 9E). Además, este patrón era similar al obtenido de bacterias en fase estacionaria de crecimiento en medio LB (Fig. 9F). Esta observación es consistente con la ausencia de crecimiento que presenta la estirpe silvestre intracelular.

71

Capítulo 2

A

B

Estirpe silvestre

(fase exponencial medio LB)

C

E

G

D

Mutante phoP intracelular 0,2% SDS

Mutante phoP intracelular 0,1% SDS

Mutante phoP intracelular 0,4% SDS

F

Estirpe silvestre intracelular 0,4% SDS

Estirpe silvestre

(fase estacionaria medio LB)

Fibroblastos NRK-49F

Figura 9. Electroferogramas en los que se muestra la calidad del ARN extraído. El ARN total de S. enterica serovar Typhimurium fue extraído de: (A) estirpe silvestre SV5015 en medio de cultivo LB en fase exponencial, (B, C y D) mutante MD1120 (phoP) intracelular (24 horas post-infección) utilizando 0,1%, 0,2% y 0,4% de SDS respectivamente, (E y F) estirpe silvestre intracelular (24 horas post-infección) utilizando 0,4% de SDS y en medio de cultivo LB en fase estacionaria, respectivamente. Se muestra como comparación el perfil de ARN extraído de fibroblastos no infectados (G). Las flechas señalan la ubicación del ARNr 28s de los fibroblastos.

72

Resultados

Expresión del genoma de S. enterica durante la infección de fibroblastos Una vez optimizado el método de obtención de ARN, desarrollamos los ensayos de hibridación con el “microarray” SALGENOMICS, en el que se representan todos los elementos genéticos de la estirpe SL1344 del serovar Typhimurium (ver materiales y métodos). Este “microarray” fue construido en el marco de un consorcio español dentro del proyecto GEN2003-20234-C06 del Ministerio de Ciencia e Innovación. Además de estudiar la expresión en la estirpe silvestre SV5015 (derivado His+ de SL1344), examinamos la del mutante phoP (MD1120), el cual sobrecrece en el interior de fibroblastos (Cano et al., 2001). De esta manera, pretendíamos descubrir funciones de la bacteria asociadas al control del crecimiento intracelular. Comparamos los perfiles de transcriptómica de bacterias intracelulares con los perfiles de expresión génica de las bacterias cultivadas en medio LB en la fase exponencial de crecimiento (DO600 ~ 0,18-0,22) (Fig. 10A y C). Es preciso señalar que los patrones de expresión génica de la estirpe silvestre y el mutante phoP cultivados en medio LB en la fase exponencial de crecimiento son análogos. Así, al comparar estos dos perfiles de expresión entre sí, de los 6119 elementos representados en el “microarray”, sólo el gen phoP y otros dos de función desconocida (ybjD e ybjX) mostraron cambios significativos en sus valores de expresión (-2 > M > 2, valor p < 0,1). Además, analizamos el perfil de expresión génica global de la estirpe silvestre en medio LB en la fase estacionaria (DO600 ~ 2,8-3,0) en relación a las bacterias en la fase exponencial de crecimiento (Fig. 10B).

A

Estirpe silvestre intracelular 24 horas p.i.

B

Estirpe silvestre medio LB fase estacionaria

C

Mutante phoP intracelular 24 horas p.i.

Estirpe silvestre medio LB fase exponencial

Mutante phoP medio LB fase exponencial

Figura 10. Esquema de las comparaciones realizadas entre los patrones globales de expresión génica de S. enterica serovar Typhimurium en las diferentes condiciones utilizadas.

Tal y como se describió en la sección correspondiente de materiales y métodos, se utilizaron nueve réplicas biológicas en cada condición estudiada. Esto implicaba nueve extracciones de ARN independientes agrupadas para conformar tres mezclas diferentes. Cada

73

Capítulo 2

una de estas mezclas de ARN se utilizó para la hibridación de cada “microarray”. Debido a que la estirpe silvestre de S. enterica no prolifera en el interior del fibroblasto, nos vimos en la necesidad de incrementar el número de réplicas biológicas en esta condición para obtener la cantidad de ARN suficiente de bacterias intracelulares. De esta manera, se requirieron veintidós extracciones de ARN independientes de la estirpe silvestre intracelular, las cuales se agruparon para conformar dos mezclas de material biológico. El estudio comparativo mostró que un gran número de genes se expresan diferencialmente en la bacteria intracelular. Tanto en el caso de la estirpe silvestre como en el mutante phoP, aproximadamente 400 genes presentan cambios de expresión (> 4 veces) durante la transición al ambiente intracelular (Tabla 5). Un número mayor de genes (670) mostraron alteración en sus niveles de expresión cuando se comparó la estirpe silvestre en la fase estacionaria con la fase exponencial de crecimiento en LB (Tabla 5). Tabla 5. Número de genes de S. enterica serovar Typhimurium diferencialmente expresados en la estirpe silvestre SV5015 o el mutante MD1120 (phoP) en el ambiente intracelular de fibroblastos NRK-49F comparado a condiciones de crecimiento en medio de laboratorio LB (-2 > M > 2, valor p < 0,1)

Comparativa

Número de genes diferencialmente expresados Total

Inducidos

Reprimidos

389

162

227

385

241

143

670

262

408

Estirpe silvestre intracelular → estirpe silvestre LB exponencial (DO600 ~ 0,18-0,22) Mutante phoP intracelular → mutante phoP LB exponencial (DO600 ~ 0,18-0,22) Estirpe silvestre LB estacionaria (DO600 ~ 2,8-3,0) → estirpe silvestre LB exponencial (DO600 ~ 0,18-0,22)

Nuestra hipótesis inicial contemplaba la existencia de una actividad transcripcional diferente en la estirpe silvestre y el mutante phoP durante la infección de fibroblastos, debido a la tasa de crecimiento diferente que presentan estas estirpes por la ausencia del regulador transcripcional PhoP en el mutante de Salmonella utilizado. No obstante, era de esperar que algunos genes se expresaran de manera similar en las dos estirpes respondiendo a señales compartidas en las vacuolas que las contienen. Así, encontramos 101 genes comunes que se expresan diferencialmente tanto en la estirpe silvestre como en el mutante phoP en el interior de fibroblastos en relación a bacterias cultivadas en medio LB en la fase exponencial de

74

Resultados

crecimiento. De estos genes, 35 se muestran inducidos y 66 reprimidos (Fig. 11A). Este grupo de genes podría representar la respuesta de Salmonella al ambiente intravacuolar del fibroblasto después de 24 horas de infección y de forma independiente a la tasa de crecimiento de la bacteria. Dentro de este grupo se encuentran genes inducidos relacionados con SPI-2 (pipB, sscA, sseB, sseE), con captación de manganeso (sitA) y miembros del operón psp (pspA, pspB, pspC y pspE). Los genes psp conforman la denominada “respuesta de choque por fago” (“phage-shock response”) que se induce en condiciones de estrés extracitoplasmático (Darwin, 2005) (Tabla 6). Por otra parte, genes relacionados con la motilidad de la bacteria (operones flg, fli, flj y che), respiración aeróbica (operones nuo y cyo) y la ATP sintasa (operón atp) se muestran reprimidos en relación a las bacterias creciendo en medio LB (Tabla 7). Debido a que en el interior de fibroblastos la estirpe silvestre se adapta a un estado de ausencia de crecimiento, comparamos su transcriptómica con el de bacterias que habían alcanzado la fase estacionaria de crecimiento en medio LB. Como se observa en la figura 11B, un total de 224 genes muestran un patrón de respuesta similar en estas dos condiciones (Tabla A6). Este grupo de genes podría corresponder a la respuesta adaptativa de la bacteria al cese del crecimiento. Así, genes relacionados con actividad metabólica y crecimiento, como aquellos que codifican proteínas ribosomales presentan niveles reprimidos de expresión. La figura 11C muestra la combinación de los tres patrones globales de expresión génica (estirpe silvestre intracelular, mutante phoP intracelular, estirpe silvestre extracelular fase estacionaria). Este análisis permite definir grupos de genes diferencialmente expresados solamente en ausencia de crecimiento en el interior de fibroblastos (Tablas 8 y 9). De los 138 genes que componen este grupo, 78 se inducen más de 4 veces, mientras que los 60 genes restantes se reprimen en comparación a bacterias crecidas en medio LB en la fase exponencial de crecimiento (Fig. 11C). Dentro de este grupo de genes, cuya expresión se induce sólo en la estirpe silvestre intracelular, se encuentran genes del plásmido de virulencia pSLT (repA, spvC, traE y traB), SPI-1 (invJ y sopB), el sistema de dos componentes PhoP-PhoQ (pagC y mgtC) y genes relacionados con respuesta a daños en el ADN de la bacteria (aidB) (Tabla 8). Por otra parte, dentro de los genes que muestran niveles de expresión inferiores en bacterias intracelulares respecto a bacterias crecidas en medio LB, se encuentran aquellos que codifican ARN ribosomales y de transferencia. Es preciso señalar que aproximadamente el 48% de los genes diferencialmente expresados carecen de función conocida (Tabla 9). Estos genes están designados como putativos o hipotéticos en bases de datos o corresponden a “probables genes” identificados en la anotación que realizamos para la construcción del “microarray” SALGENOMICS.

75

Capítulo 2

INDUCIDOS 127

A

228

101

283

35

205

REPRIMIDOS 161

66

77

Estirpe silvestre intracelular vs. estirpe silvestre LB fase exponencial Mutante phoP intracelular vs. mutante phoP LB fase exponencial

INDUCIDOS 97

B

165

224

446

65

REPRIMIDOS 68

159 249

Estirpe silvestre intracelular vs. estirpe silvestre LB fase exponencial Estirpe silvestre LB fase estacionaria vs. estirpe silvestre LB fase exponencial

76

197

Resultados

INDUCIDOS 78 49

16 146 51

138

C

150 369

74 77

27

19 155

REPRIMIDOS

206

60 101 8 58 223 26 51

Estirpe silvestre intracelular vs. estirpe silvestre LB fase exponencial Mutante phoP intracelular vs. mutante phoP LB fase exponencial Estirpe silvestre LB fase estacionaria vs. estirpe silvestre LB fase exponencial

Figura 11. Número de genes de S. enterica serovar Typhimurium diferencialmente expresados (-2 > M > 2, valor p < 0,1) en el ambiente intracelular de fibroblastos NRK-49F con respecto al medio LB. (A) Genes diferencialmente expresados en las estirpes SV5015 (silvestre) y MD1120 (phoP) en el interior de fibroblastos. (B) Genes diferencialmente expresados en la estirpe SV5015 (silvestre) en las transiciones de fase exponencial a estacionaria en medio LB, o de ambiente extracelular a intracelular. (C) Genes diferencialmente expresados comunes y específicos de las estirpes SV5015 (silvestre) y MD1120 (phoP) en el interior de fibroblastos y durante el crecimiento en medio de cultivo LB en fase estacionaria. El valor de M representa el logaritmo de la expresión diferencial de cada gen.

77

Capítulo 2

Tabla 6. Genes de S. enterica serovar Typhimurium diferencialmente expresados (M > 2, valor p < 0,1) comunes entre la estirpe silvestre SV5015 y el mutante MD1120 (phoP) durante la infección de fibroblastos NRK-49F (24 horas post-infección) en comparación a bacteria en la fase exponencial de crecimiento en medio LB. Los nombres de los genes son tomados directamente de la base de datos del genoma de la estirpe LT2 (McClelland et al., 2001). GENES STM1088 pipB STM1251 STM1251 STM1284 yeaH STM1398 sseB STM1399 sscA STM1402 sseE STM1535 STM1535 STM1686 pspE STM1688 pspC STM1689 pspB STM1690 pspA STM1868 mig-3 STM1869 STM1869 STM1882 yebG STM2138 STM2138 STM2621 STM2621 STM2861 sitA STM2865 avrA STM2935 cysD STM4014 STM4014 PSLT040 spvA PSLT043 PSLT043 PSLT045 PSLT045 PSLT047 PSLT047 PSLT060 PSLT060 PSLT073 traM PSLT101 traG PSLT104 traD PSLT106 PSLT106 PSLT107 PSLT107 CNB1344-0014 sraL CNB1344-0140 S0140A_ORF CNB1344-0144 mobB CNB1344-0259 S0111A_ORF CNB1344-0528 S2893A_ORF

DESCRIPCIÓN secreted effector protein putative molecular chaperone hypothetical protein STM1284 translocation machinery component secretion system chaparone secreted effector protein putative hydrogenase protein phage shock protein phage shock protein phage shock protein B phage shock protein phage-tail assembly-like protein phage-tail assembly-like protein DNA damage-inducible protein putative cytoplasmic protein hypothetical protein STM2621 putative periplasmic binding protein secreted effector protein sulfate adenylyltransferase subunit 2 putative periplasmic protein outer membrane protein type II secretion system protein putative resolvase putative cytoplasmic protein putative cytoplasmic protein mating signal protein mating pair stabilization and pilus assembly protein ATP-binding protein/DNA transporter MvpA-like protein putative cytoplasmic protein sRNA (E. coli) Mobilization protein B -

78

Resultados

Tabla 7. Genes de S. enterica serovar Typhimurium diferencialmente expresados (M < -2, valor p < 0,1) comunes entre la estirpe silvestre SV5015 y el mutante MD1120 (phoP) durante la infección de fibroblastos NRK-49F (24 horas post-infección) en comparación a bacteria en la fase exponencial de crecimiento en medio LB. Los nombres de los genes son tomados directamente de la base de datos del genoma de la estirpe LT2 (McClelland et al., 2001). GENES STM0091 STM0124 STM0166 STM0439 STM0440 STM0441 STM0442 STM0678 STM1170 STM1173 STM1174 STM1175 STM1177 STM1181 STM1183 STM1916 STM1917 STM1921 STM1922 STM1958 STM1959 STM1961 STM1962 STM1969 STM1970 STM1971 STM1974 STM1975 STM1976 STM1977 STM1978 STM2085 STM2087 STM2317 STM2318 STM2319 STM2322 STM2323,S STM2324 STM2325 STM2326

pdxA murF speE cyoE cyoD cyoC cyoB leuW mviN flgA flgB flgC flgE flgI flgK cheY cheB cheA motB fliB fliC fliS fliT fliF fliG fliH fliK fliL fliM fliN fliO rfbN rfbV nuoM nuoL nuoK nuoH nuoG nuoF nuoE nuoC

DESCRIPCIÓN 4-hydroxythreonine-4-phosphate dehydrogenase D-alanine-D-alanine ligase spermidine synthase protoheme IX farnesyltransferase cytochrome o ubiquinol oxidase subunit IV cytochrome o ubiquinol oxidase subunit III cytochrome o ubiquinol oxidase subunit I Leu tRNA putative virulence protein flagellar basal body P-ring biosynthesis protein flagellar basal body rod protein flagellar basal body rod protein flagellar hook protein flagellar P-ring protein precursor flagellar hook-associated protein chemotaxis regulator chemotaxis-specific methylesterase chemotaxis sensory histidine protein kinase flagellar motor protein lysine-N-methylase flagellar biosynthesis protein flagellar protein FliS possible FliD export chaperone flagellar M-ring protein flagellar motor protein flagellar assembly protein flagellar hook-length control protein flagellar biosynthesis protein flagellar motor switch protein flagellar motor switch protein flagellar biosynthetic protein rhamnosyl transferase abequosyltransferase NADH dehydrogenase subunit M NADH dehydrogenase subunit L NADH dehydrogenase kappa subunit NADH dehydrogenase subunit H NADH dehydrogenase gamma subunit NADH dehydrogenase I chain F ATP synthase subunit E NADH dehydrogenase I chain C/D Continúa en la página siguiente

79

Capítulo 2

Tabla 7. Continuación. STM2327 STM2328 STM2770 STM2771 STM2822 STM2823 STM2824 STM3087 STM3093 STM3718 STM3728

GENES nuoB nuoA fljA fljB STM2822 STM2823 STM2824 yqgB endA rfaI rpmB

STM3742

spoT

STM3867 STM3868 STM3869 STM3870 STM3871 STM3872 STM4144 STM4150 STM4170 STM4391 STM4477 CNB1344-0096 CNB1344-0644

atpA atpH atpF atpE atpB atpI glyT rplA hupA rpsF pepA S0260A_ORF S2077A_ORF

DESCRIPCIÓN NADH dehydrogenase beta subunit NADH dehydrogenase alpha subunit phase-1 flagellin repressor flagellar biosynthesis protein tRNA tRNA tRNA putative inner membrane protein DNA-specific endonuclease I lipopolysaccharide-alpha-1,3-D-galactosyltransferase 50S ribosomal protein L28 (p)ppGpp synthetase II/guanosine-3',5'-bis pyrophosphate ATP synthase subunit A ATP synthase subunit D ATP synthase subunit B ATP synthase subunit C ATP synthase subunit A ATP synthase subunit I STM4144 50S ribosomal protein L1 DNA-binding protein HU-alpha 30S ribosomal protein S6 leucyl aminopeptidase -

80

Resultados

Tabla 8. Genes de S. enterica serovar Typhimurium diferencialmente expresados (M > 2, valor p < 0,1) en la estirpe silvestre SV5015 durante la infección de fibroblastos NRK-49F (24 horas post-infección) en comparación a bacteria en la fase exponencial de crecimiento en medio LB. Los nombres de los genes son tomados directamente de la base de datos del genoma de la estirpe LT2 (McClelland et al., 2001). STM0056 STM0279 STM0339 STM0494 STM0548 STM0561 STM0581 STM0662 STM0688 STM0717 STM0719 STM0767 STM0812 STM0965 STM1020 STM1041 STM1091 STM1246 STM1297 STM1499 STM2054 STM2139,2n STM2250 STM2285 STM2461 STM2470 STM2586 STM2620 STM2632 STM2735 STM2892 STM3352 STM3475 STM3558 STM3640 STM3764 STM3808,S STM3815 STM3847 STM4075

GENES STM0056 STM0279 stbB ushA fimF STM0561 STM0581 gltL ybfN STM0717 STM0719 STM0767 ybhO dmsB STM1020 STM1041 sopB pagC selD STM1499 pduT STM2139,2n ccmE glpB eutG eutS STM2586 STM2620 STM2632 STM2735 invJ oadA nirD STM3558 lpfA mgtC ibpB ccmE yidY ydeY

DESCRIPCIÓN putative oxaloacetate decarboxylase subunit gamma putative cytoplasmic protein putative fimbrial chaperone UDP-sugar hydrolase/5'-nucleotidase putative fimbrial protein sensor kinase putative regulatory protein glutamate/aspartate transporter putative lipoprotein putative UDP-galactopyranose mutase putative UDP-galactopyranose mutase cardiolipin synthase anaerobic dimethyl sulfoxide reductase subunit B hypothetical protein STM1020 probable minor tail protein secreted effector protein virulence membrane protein PAGC precursor selenophosphate synthetase putative dimethyl sulphoxide reductase chain A1 polyhedral body protein hypothetical protein STM2139,2n periplasmic heme-dependent peroxidase anaerobic glycerol-3-phosphate dehydrogenase subunit B putative transport protein putative carboxysome structural protein phage tail assembly-like protein exodeoxyribonuclease VIII-like protein hypothetical protein STM2735 needle length control protein oxaloacetate decarboxylase nitrite reductase small subunit death-on-curing protein long polar fimbrial protein A precursor Mg2+ transport protein small heat shock protein periplasmic heme-dependent peroxidase putative tranport protein putative sugar transport protein Continúa en la página siguiente

81

Capítulo 2

Tabla 8. Continuación. GENES STM4205 STM4319 STM4377 STM4467 PSLT006 PSLT007 PSLT008 PSLT010 PSLT029 PSLT038 PSLT046 PSLT066 PSLT070 PSLT072 PSLT079 PSLT081 CNB1344-0042 CNB1344-0121 CNB1344-0123 CNB1344-0138 CNB1344-0187 CNB1344-0226 CNB1344-0248 CNB1344-0258 CNB1344-0271 CNB1344-0273 CNB1344-0274 CNB1344-0292 CNB1344-0317 CNB1344-0324 CNB1344-0325 CNB1344-0342 CNB1344-0350 CNB1344-0351 CNB1344-0366 CNB1344-0520 CNB1344-0580 CNB1344-0605

STM4205 phoN aidB STM4467 repA PSLT007 srgC srgB PSLT029 spvC mig-5 ssbB psiA PSLT072 traE traB C0343 S0180A_ORF S0176A_ORF S0124A_ORF S4945A_ORF S4338A_ORF S4437A_ORF trbA yfhA S0097A_ORF yceB S0081A_ORF pilJ pilQ pilR sogL traS traT S4236A_ORF S2902A_ORF ymfR sb19

DESCRIPCIÓN putative phage glycosyltransferase non-specific acid phosphatase putative acyl-CoA dehydrogenase arginine deiminase DNA replication protein putative outer membrane protein putative regulatory protein putative outer membrane protein putative cytoplasmic protein hydrophilic protein putative carbonic anhydrase single-strand DNA binding protein PsiA putative transglycosylase pilus assembly protein pilus assembly protein sRNA (E. coli) TrbA protein YfhA protein (Hypothetical protein) YceB protein PilJ Nucleotide-binding protein Integral membrane protein DNA primase TraS protein TraT protein Hypothetical protein ymfR Sb19

82

Resultados

Tabla 9. Genes de S. enterica serovar Typhimurium diferencialmente expresados (M < -2, valor p < 0,1) en la estirpe silvestre SV5015 durante la infección de fibroblastos NRK-49F (24 horas post-infección) en comparación a bacteria en la fase exponencial de crecimiento en medio LB. Los nombres de los genes son tomados directamente de la base de datos del genoma de la estirpe LT2 (McClelland et al., 2001). STM0128 STM0191 STM0252 STM0443 STM0445 STM0648 STM0675 STM0679

GENES murG fhuA rrlH cyoA yajG leuS metU metT

STM0732

sdhC

STM0734 STM0753 STM0754 STM0755

sdhA lysW lysY lysZ

STM0830

glnH

STM0982 STM1070 STM1071 STM1200 STM1205 STM1376 STM1378 STM1466 STM1837 STM1943 STM2227 STM2432 STM2523 STM2543 STM2659 STM2767 STM2826 STM2953 STM3055 STM3179 STM3396 STM3510 STM3705

himD ompA sulA tmk ycfF lppB pykF ydgA cspC cysT yejL ptsI gcpE nifS rrsG STM2767 csrA pyrG gcvT mdaB rrlD yhgH yibP

DESCRIPCIÓN N-acetylglucosaminyl transferase outer membrane ferrichrome receptor protein precursor 23S ribosomal RNA cytochrome o ubiquinol oxidase subunit II putative lipoprotein leucyl-tRNA synthetase Met tRNA Met tRNA succinate dehydrogenase cytochrome b556 large membrane subunit succinate dehydrogenase catalytic subunit Lys tRNA Lys tRNA Lys tRNA glutamine ABC transporter periplasmic-binding protein integration host factor beta subunit putative hydrogenase membrane component precursor cell division inhibitor thymidylate kinase putative protein kinase C inhibitor putative methyl-accepting chemotaxis protein pyruvate kinase putative periplasmic protein cold shock protein Cys tRNA putative cytoplasmic protein PEP-protein phosphotransferase 4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase cysteine desulfurase 16S ribosomal RNA putative DNA/RNA helicase carbon storage regulator CTP synthetase aminomethyltransferase NADPH-specific quinone oxidoreductase 23S ribosomal RNA putative amidophosphoribosyltransferase hypothetical protein STM3705 Continúa en la página siguiente

83

Capítulo 2

Tabla 9. Continuación. GENES STM3711 rfaF STM3889 rrsC STM3931 argX STM3934 proM STM3937 STM3937 STM3938 hemC STM3988 rrsA STM3991 rrlA STM4037 fdoG STM4087 glpF STM4092 hslV STM4132 rrsB STM4135 rrlB STM4142 thrU STM4177 rrsE STM4179 rrlE STM4221 pgi STM4415 fbp STM4458 yjgF CNB1344-0017 csrC CNB1344-0036 gcvB CNB1344-0379 S4125A_ORF CNB1344-0744 S1463A_ORF

DESCRIPCIÓN ADP-heptose-LPS heptosyltransferase 1 16S ribosomal RNA Arg tRNA Pro tRNA uroporphyrinogen-III synthetase porphobilinogen deaminase 16S ribosomal RNA 23S ribosomal RNA formate dehydrogenase alpha subunit glycerol diffusion ATP-dependent protease peptidase subunit 16S ribosomal RNA 23S ribosomal RNA Thr tRNA 16S ribosomal RNA 23S ribosomal RNA glucose-6-phosphate isomerase fructose-1,6-bisphosphatase putative translation initiation inhibitor sRNA (E. coli) sRNA (E. coli) -

84

Resultados

A continuación se resaltan aquellos grupos de genes que se han relacionado de una u otra forma con virulencia y/o con mecanismos de adaptación a ambientes diversos. Rutas de metabolismo intermediario y energético Como se observa en la figura 12 y tomando como referencia a las bacterias creciendo en medio LB en la fase exponencial de crecimiento, los genes asociados a las rutas de catabolismo de azúcares (glicólisis, ruta de las pentosas fosfato y la vía Entner-Doudoroff) aparecen reprimidos (M < 0) o sin cambio (M ≈ 0) en la estirpe silvestre intracelular o extracelular en fase estacionaria. Este patrón de expresión se mantiene en el mutante phoP, que prolifera dentro del fibroblasto. Por otra parte, se observa un descenso general en los niveles de expresión de los genes relacionados con gluconeogénesis tanto en la estirpe silvestre intracelular y extracelular en fase estacionaria, como en el mutante phoP intracelular (Fig. 12, tabla A7). El ciclo de β-oxidación es la principal ruta de degradación de los ácidos grasos en bacterias. Esta ruta genera acetil-CoA que puede ser usado en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos o en el ciclo del glioxilato (Kunau et al., 1995). Recientemente se ha demostrado que E. coli puede utilizar ácidos grasos como única fuente de carbono en condiciones anaeróbicas. Los autores proponen las enzimas codificadas por los genes yfcY, yfcX e ydiD como indispensables en este proceso (Campbell et al., 2003; Morgan-Kiss y Cronan, 2004). Como se observa en la figura 12, los genes yfcY, yfcX e ydiD están moderadamente inducidos en la estirpe silvestre (M = 2,175; 0,27 y 1,585 respectivamente) y en el mutante phoP intracelular (M = 2,76 y 1,29; yfcX e ydiD respectivamente) (Tabla A7). E. coli o S. enterica también pueden utilizar acetato como fuente de carbono. El acetato debe ser activado antes de ser metabolizado. Una ruta de activación del acetato es la que realiza la enzima acetil-CoA sintetasa (acs) (Cozzone, 1998). Se observa inducción del gen acs tanto en la estirpe silvestre y el mutante phoP en el interior de fibroblastos, como durante el crecimiento en medio LB en fase estacionaria (M = 1,76; 3,395 y 1,995 respectivamente), lo que indica que posiblemente Salmonella esté utilizando acetato como fuente de carbono en estas condiciones. El uso de ácidos grasos o acetato como fuente de carbono requiere el funcionamiento de una ruta anaplerótica conocida como el ciclo del glioxilato. En esta ruta, dos enzimas específicas, la isocitrato liasa y la malato sintasa, se activan para desviar el isocitrato del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Esta ruta permite la acumulación de los intermediarios de cuatro carbonos necesarios para la biosíntesis de componentes celulares de la bacteria (Cozzone, 1998). Los genes que codifican las enzimas isocitrato liasa (aceA) y malato sintasa (aceB) se

85

Capítulo 2

muestran ligeramente inducidos en la estirpe silvestre (M = 0,715 y 2,135 respectivamente) y el mutante phoP (M = 1,22 y 1,985 respectivamente) en comparación con las bacterias extracelulares en medio LB en la fase exponencial de crecimiento (Fig. 12, tabla A7). Estos datos sugieren que posiblemente S. enterica serovar Typhimurium podría utilizar ácidos grasos y acetato como fuentes de carbono durante la infección de fibroblastos al menos después de 24 horas de infección. Mediante estos análisis de transcriptómica se puede inferir el estado respiratorio del serovar Typhimurium durante la infección del fibroblasto. Genes relacionados con respiración aeróbica, como los que codifican la NADH deshidrogenasa (operón nuo) y la citocromo o ubiquinol oxidasa (operón cyo) disminuyen su expresión tanto en bacterias en el interior de fibroblastos, como en fase estacionaria (valores M < 0). En contraste, algunos genes que codifican proteínas asociadas con donadores y aceptores de electrones alternativos muestran valores de expresión aumentados en bacterias intracelulares y en fase estacionaria. Tal es el caso del gen que codifica la subunidad gamma de la formato deshidrogenasa N (fdnI) que muestra valores M de 3,06; 1,70 y 4,81 en la estirpe silvestre intracelular, el mutante phoP intracelular y la estirpe silvestre en fase estacionaria, respectivamente. Igualmente, los genes narZ (nitrato reductasa 2), nirD (nitrito reductasa) y torC (óxido trimetil amina reductasa) presentan valores de expresión positivos (M = 3,72; 3,62 y 2,94 respectivamente) en la estirpe silvestre en el interior de fibroblastos (Tabla A12). La síntesis de ATP catalizada por la ATP sintasa es un proceso fundamental en la generación de energía, por lo que esta enzima es clave en el metabolismo energético de la célula (Senior et al., 2002). La expresión del operón atpABCDEFGHI, que codifica las distintas subunidades de la ATP sintasa es inferior en la estirpe silvestre y el mutante phoP intracelular con respecto a las bacterias en la fase exponencial del crecimiento en medio LB (valores M < 0). Igualmente, los genes atp se mantienen reprimidos en la fase estacionaria en relación a la fase exponencial de crecimiento de la bacteria en medio de cultivo (Tabla A12).

86

Resultados

Expresión relativa (M) -4

0

4

GLICÓLISIS

GLUCONEOGÉNESIS

RUTA PENTOSAS FOSFATO ENTNER-DOUDOROFF CICLO DE LOS ÁCIDOS TRICARBOXILICOS aceB aceA ydiD yfcX yfcY acs

CICLO DEL GLIOXILATO β OXIDACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS UTILIZACIÓN DE ACETATO

Figura 12. Expresión de genes relacionados con el metabolismo del carbono en la estirpe silvestre (SV5015) y el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium. Cada fila representa un gen y cada columna la condición experimental utilizada. De cada gen, se muestran los valores de expresión relativos (M) a fase exponencial de crecimiento en medio LB. El esquema de colores es verde cuando el gen esta reprimido, negro cuando los niveles de expresión son similares y rojo para genes inducidos. Los valores de los cambios de expresión de cada gen se muestran en la tabla A7 del Anexo II.

87

Capítulo 2

Flagelo, quimiotaxis y fimbrias Salmonella utiliza flagelos para desplazarse a través del medio donde se encuentra. Además, la bacteria usa sofisticados sistemas de percepción de señales para dirigir sus movimientos hacia ciertos estímulos, comportamiento denominado quimiotaxis (Lux y Shi, 2004). La expresión de genes que codifican los componentes del flagelo y los relacionados con quimiotaxis están fuertemente reprimidos (M < 0) en Salmonella intracelular y en bacterias en la fase estacionaria del crecimiento (Fig. 13, tabla A8). El genoma del serovar Typhimurium contiene un gran número de operones que codifican fimbrias (Humphries et al., 2001). Durante la infección de fibroblastos, en general, estos genes no muestran diferencias de expresión en relación a la bacteria extracelular, con la excepción de csgE que se muestra inducido en la estirpe silvestre tanto en el interior de fibroblastos (M = 2,46) como en fase estacionaria (M = 4,10). Además los genes stbB, stbC, lpfA y fimF muestran un incremento de sus niveles de expresión sólo en la estirpe silvestre intracelular (M = 3,505; 1,73; 2,13 y 3,02 respectivamente) (Fig. 13, tablas 8 y A8). Transporte de iones inorgánicos Los cationes inorgánicos juegan un papel clave en muchas funciones biológicas incluyendo, entre otras, su efecto alostérico sobre gran número de enzimas. Debido a la permeabilidad restringida de la membrana citoplasmática, la captación de estos iones requiere sistemas de transporte específicos (Konings, 2006). La figura 14 muestra los niveles de expresión de genes que codifican los sistemas de captación de potasio, magnesio, hierro y manganeso en bacterias intracelulares y en bacterias en la fase estacionaria de crecimiento en medio de cultivo LB. Como se puede apreciar, los resultados sugieren que tanto la estirpe silvestre como el mutante phoP activan sistemas de captación de hierro y manganeso durante la infección de fibroblastos. Además, en la estirpe silvestre intracelular se observa la inducción del gen mgtB, el cual codifica una ATPasa de tipo P que media el transporte de magnesio y que es regulado positivamente por el sistema PhoP-PhoQ (Maguire, 2006). Los genes relacionados con la captación de manganeso, sitABCD y mntH (Papp-Wallace y Maguire, 2006), muestran una fuerte inducción en bacterias intracelulares con respecto a las bacterias en la fase exponencial de crecimiento en medio LB. Además, tanto sitABCD como mntH se inducen también en las bacterias en la fase estacionaria de crecimiento en medio LB. Contrariamente, los genes kdpABC que codifican un transportador de potasio de alta afinidad (Ballal et al., 2007) no muestran cambios en sus niveles de expresión (Fig. 14).

88

Resultados

Expresión relativa (M) -4

0

4

bcf sti stf stbB stbC

stb fim

fimF csgE

FIMBRIAS

csg std lpf

lpfA

sth pef flg flh

FLAGELO

fli flj che

QUIMIOTAXIS

Figura 13. Expresión de los genes del flagelo, quimiotaxis y fimbrias en la estirpe silvestre (SV5015) y el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium. Cada fila representa un gen y cada columna la condición experimental utilizada. De cada gen, se muestran los valores de expresión relativos (M) a fase exponencial de crecimiento en medio LB. El esquema de colores es verde cuando el gen esta reprimido, negro cuando los niveles de expresión son similares y rojo para genes inducidos. Los valores de los cambios de expresión de cada gen se muestran en la tabla A8 del Anexo II.

89

Capítulo 2

Estirpe silvestre LB fase estacionaria

Estirpe silvestre intracelular 24 h p.i.

Mutante phoP intracelular 24 h p.i.

kup trkH trkA kdpA kdpB kdpC kdpD kdpE mgtB mgtA corA fepA fes fepE fepC fepG fepD fepB entS entF entE entD entC entB entA iroB iroC iroD iroE iroN feoA feoB sitA sitB sitC sitD mntH phoU pstB pstA pstC pstS -4

POTASIO

MAGNESIO

HIERRO

MANGANESO FOSFATO -2

0

2

4

6

8 -4

-2

0

2

4

6

8 -4

-2

0

2

4

6

8

Expresión relativa (M)

Figura 14. Expresión de los genes relacionados con el transporte de iones inorgánicos en la estirpe silvestre (SV5015) y el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium. Se muestran los valores de expresión (M) de cada condición experimental relativos a bacteria en fase exponencial de crecimiento en medio LB. Los valores de los cambios de expresión de cada gen se muestran en la tabla A9 del Anexo II.

90

Resultados

Muchas bacterias patógenas secretan pequeñas moléculas llamadas sideróforos para obtener hierro (Fe3+) en ambientes con cantidades limitantes de este catión inorgánico. Los sideróforos tienen la capacidad de quelar hierro con alta afinidad (Schaible y Kaufmann, 2004). S. enterica produce dos sideróforos de tipo catecolato, enterobactina y su derivado, salmoquelina, en respuesta niveles limitantes de hierro (Fischbach et al., 2006). En la figura 14 se observa que los genes relacionados con la síntesis, secreción y captación del sideróforo salmoquelina (iroBCDEN) se inducen en bacterias intracelulares, aunque de forma más evidente en el mutante phoP (Fig. 14). El fósforo es importante para el metabolismo bacteriano ya que es indispensable para el suministro de energía y para la biosíntesis de ADN, ARN y fosfolípidos. El sistema de transporte de fosfato en S. enterica está compuesto por el operón pstSCAB-phoU (van Veen, 1997). Todos ellos a excepción del gen phoU, muestran expresión aumentada en las bacterias intracelulares en comparación con las bacterias en la fase exponencial del crecimiento en medio LB (Fig. 14). En su conjunto, esto resultados sugieren que S. enterica serovar Typhimurium encuentra un ambiente intravacuolar limitante en magnesio, manganeso, hierro y fosfato durante la infección de fibroblastos. Sin embargo, los niveles de potasio parecen no ser restrictivos. Resistencia a péptidos antimicrobianos Las bacterias patógenas se enfrentan en el hospedador a condiciones de estrés como la exposición a péptidos catiónicos antimicrobianos. La resistencia de S. enterica ante los péptidos antimicrobianos está mediada parcialmente por el sistema de dos componentes PhoP-PhoQ (Miller et al., 2005). Nuestro análisis de transcriptómica muestra la inducción de la expresión de virK en la estirpe silvestre y el mutante phoP intracelular (M = 1,74 y 1,94 respectivamente). virK es un gen relacionado con la resistencia a péptidos catiónicos antimicrobianos (Detweiler et al., 2003). Igualmente, se observa un aumento de la expresión de los genes pagC y phoN en la estirpe silvestre intracelular (M = 2,74 y 2,92 respectivamente), de los cuales se ha demostrado que aumentan su expresión en presencia de péptidos antimicrobianos (Bader et al., 2003). Por otra parte, se ha determinado recientemente que el gen ydeI, regulado por el sistema Rcs, contribuye a la resistencia ante polimixina B en S. enterica (Erickson y Detweiler, 2006). Este gen muestra altos niveles de expresión tanto en la estirpe silvestre (M = 2,03) y el mutante phoP intracelular (M = 3,04), como en bacteria en la fase estacionaria de crecimiento (M = 4,515) (Tabla A12).

91

Capítulo 2

Islas de patogenicidad de Salmonella Como se comentó en la introducción, las islas de patogenicidad de Salmonella codifican factores de virulencia necesarios para la colonización y supervivencia de las bacterias dentro del hospedador. Nuestro estudio de transcriptómica revela la inducción de genes de SPI-2 en Salmonella intracelular (Fig. 15). Inesperadamente, este aumento de expresión fue más evidente en el mutante phoP (Fig. 15, tabla A10). Este patrón de altos niveles de expresión de estos genes en ambas estirpes, aunque más aún en el mutante phoP, es evidente para la mayoría de los genes que codifican las proteínas efectoras secretadas por el SST3 de SPI-2 (Fig. 16, tabla A11). De éstos, los genes con los valores de expresión más altos son pipB2 y pipB (M = 2,37 y 2,40 respectivamente en la estirpe silvestre, y M = 10,25 y 8,34 respectivamente en el mutante phoP). En general, los genes que conforman la SPI-1 no presentan cambios en los niveles de expresión en las bacterias intracelulares con respecto a las bacterias en fase exponencial cultivadas en medio LB, a excepción del operón sitABCD relacionado con el transporte de manganeso (Fig. 15). Sin embargo, en la estirpe silvestre intracelular, los genes invJ e invI, necesarios para la actividad del SST3 de la SPI-1, se muestran inducidos (M = 3,09 y 3,08 respectivamente). De igual forma, la proteína efectora de SPI-1 codificada por el gen sopB (localizado en SPI-5) se induce aparentemente sólo en la estirpe silvestre intracelular (M = 2,64). Por otra parte, los genes de SPI-3 en las bacterias intracelulares no presentan cambios sustanciales con respecto a las bacterias crecidas en medio LB en fase exponencial, exceptuando el operón mgtCB, relacionado con la adaptación a ambientes bajos en magnesio, que presenta valores aumentados de expresión en la estirpe silvestre intracelular (M = 4,71 y 2,13 respectivamente) (Fig. 15, tabla A10).

92

Resultados

Expresión relativa (M) -4

0

4

sitABCD

SPI1 invJ invI

ssrAB ssaCDE sseB sseCDE sseFG

SPI2

ssaGHIJKLM NOPQRTUV

SPI3

mgtCB

SPI4 SPI5

pipB sopB

Figura 15. Expresión de genes de las islas de patogenicidad de la estirpe silvestre (SV5015) y el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium. Cada fila representa un gen y cada columna la condición experimental utilizada. De cada gen, se muestran los valores de expresión relativos (M) a fase exponencial de crecimiento en medio LB. El esquema de colores es verde cuando el gen esta reprimido, negro cuando los niveles de expresión son similares y rojo para genes inducidos. Los valores de los cambios de expresión de cada gen se muestran en la tabla A10 del Anexo II.

93

Capítulo 2

Estirpe silvestre LB fase estacionaria

Estirpe silvestre intracelular 24 h p.i.

Mutante phoP intracelular 24 h p.i.

-2

-2

sseK1 pipB2 gogB sseL sspH2 sseK2 steC sseJ sifB steA sifA pipB sseI sopD2 slrP -4

-2

0

2

4

6

8

10 12 -4

0

2

4

6

8

10 12 -4

0

2

4

6

8

10 12

Expresión relativa (M)

Figura 16. Expresión de genes que codifican proteínas efectoras de SPI-2 en la estirpe silvestre (SV5015) y el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium. Se muestran los valores de expresión (M) de cada condición experimental relativos a bacteria en fase exponencial de crecimiento en medio LB. Los valores de los cambios de expresión se muestran en la tabla A11 del Anexo II.

94

Resultados

Validación de los resultados de transcriptómica obtenidos en Salmonella intracelular Los resultados obtenidos en el análisis de transcriptómica tras 24 horas de infección sugieren que, en el interior de fibroblastos, S. enterica serovar Typhimurium encuentra un ambiente que difiere considerablemente a lo descrito anteriormente en otros tipos celulares (Eriksson et al., 2003; Hautefort et al., 2007). Esto se refleja, por ejemplo, en el aumento de expresión de genes relacionados con la utilización de ácidos grasos y acetato como fuente de carbono. Por otro lado, este estudio confirma la expresión de determinados factores de virulencia en las bacterias intracelulares, como los relacionados con el plásmido de virulencia, el sistema PhoP-PhoQ y con algunas islas de patogenicidad (SPI-2, SPI-5). Varios trabajos han descrito que el sistema de dos componentes PhoP-PhoQ regula la expresión del sistema SsrAB, siendo este último esencial para la expresión de los genes de SPI-2 (Bijlsma y Groisman, 2005; Deiwick et al., 1999). En nuestro estudio observamos una fuerte inducción de la expresión de los genes asociados a SPI-2 en el mutante phoP (Fig. 15 y 16). Debido a la discrepancia de este resultado con el modelo de regulación de SPI-2 establecido anteriormente, decidimos seguir explorando la relación entre el sistema PhoPPhoQ y SPI-2 en Salmonella tras la infección de fibroblastos. Para ello, quisimos corroborar los niveles de expresión obtenidos mediante la técnica de “microarrays” de algunos genes relacionados con SPI-2. Mediante RT-PCR cuantitativa se determinaron los niveles de expresión de los genes ssrB, pipB y pipB2 en bacterias intracelulares relativos a bacterias en fase exponencial de crecimiento en medio de cultivo LB y a diferentes tiempos post-infección (Fig. 17). Tanto en la estirpe silvestre como en el mutante phoP intracelular se observó un aumento en la expresión de estos genes a partir de 4 y 8 horas post-infección, siendo este incremento más evidente en los genes que codifican las proteínas efectoras PipB y PipB2. De esta manera, confirmábamos que genes relacionados con SPI-2 podían expresarse independientemente del sistema PhoP-PhoQ en las bacterias intracelulares. Por otra parte, el análisis de transcriptómica mostraba la inducción de la expresión de los genes asociados con SPI-1, invI, invJ y sopB, en la estirpe silvestre intracelular. Trabajos recientes sugieren que SPI-1 no sólo estaría involucrada en la entrada de Salmonella en células eucariotas, sino que tendría algún papel durante la patogénesis de la bacteria en su fase intracelular (Brawn et al., 2007; Drecktrah et al., 2005; Giacomodonato et al., 2007; Lawley et al., 2006). Quisimos por tanto validar los resultados obtenidos monitorizando la expresión del gen sopB. Los ensayos de RT-PCR cuantitativa demostraron que la expresión de sopB disminuye a medida que aumenta el tiempo de infección de las células en las bacterias intracelulares con respecto a bacterias en medio LB (Fig. 17). Estos resultados indican una

95

Capítulo 2

discrepancia entre ambas técnicas utilizadas (“microarray”, RT-PCR cuantitativa) para este gen en concreto. Se han propuesto tres señales diferentes que activan el sistema PhoP-PhoQ en el interior de macrófagos: pH ácido, presencia de péptidos antimicrobianos y baja concentración de Mg2+ (Groisman y Mouslim, 2006; Prost y Miller, 2008). En el perfil transcriptómico de S. enterica serovar Typhimurium en el interior de fibroblastos observamos inducción de genes relacionados con la presencia de péptidos antimicrobianos (virK, pagC y phoN) y con la adaptación a ambientes limitantes en magnesio (mgtCB). Sin embargo, no observamos inducción de genes que se conoce que se expresan en ambientes ácidos, como los genes modulados por el regulador transcripcional PmrA (Pérez y Groisman, 2007) y los genes cadBA y cadC (Lee et al., 2007). En la figura 18 se muestra la cuantificación relativa de los niveles de expresión de los genes mgtA, mgtB, mgtC y pagC en bacterias intracelulares mediante la técnica RT-PCR cuantitativa. Como se puede observar los genes mgtB, mgtC y pagC aumentan sus niveles de expresión en la estirpe silvestre intracelular después de cuatro horas de infección, mientras que el gen mgtA presenta valores logarítmicos cercanos a cero (sin cambios en los niveles de expresión) a lo largo del experimento. En el mutante phoP intracelular no se observa inducción de estos genes pues pertenecen al grupo de genes regulados por PhoP (Alix y Blanc-Potard, 2007; Maguire, 2006; Pérez et al., 2008). Estos resultados corroboran la inducción de la expresión de los genes mgtB, mgtC y pagC en bacterias intracelulares durante la infección de fibroblastos. MgtA y MgtB son proteínas transportadoras de magnesio que comparten propiedades fisiológicas y estructurales. Ambas son ATPasas de tipo P reguladas por el sistema PhoPPhoQ que tienen alta afinidad por el magnesio y se inducen después de la invasión de Salmonella en células eucariotas (Maguire, 2006). A pesar de esta similitud, sólo observamos inducción de la expresión del gen mgtB en bacterias intracelulares mediante los experimentos de expresión génica (Fig. 14 y 18). Quisimos comprobar la eficacia de los oligonucleótidos utilizados en la amplificación del ARN mensajero de mgtA en Salmonella intracelular. Para esto aislamos ARN total de la estirpe silvestre y el mutante phoP cultivados en medio N en condiciones de activación (8 μM MgCl2) o represión (10 mM MgCl2) del sistema PhoP-PhoQ (García Vescovi et al., 1996). Posteriormente cuantificamos los niveles de expresión de los genes mgtA, mgtB y mgtC mediante RT-PCR cuantitativa. En la figura 19 se aprecia la inducción de la expresión de estos genes en bacteria crecida en medio N con bajo magnesio en relación a bacteria cultivada en medio N con una concentración de 10 mM de este catión. Este resultado demostraba la validez de los oligonucleótidos utilizados para el gen mgtA.

96

Resultados

Niveles de expresión relativos a bacteria fase exponencial medio LB (log10)

Estirpe silvestre 3 2 1 0 -1 -2 -3

1

3 2 1 0 -1 -2 -3

**

1 3 2 1 0 -1 -2 -3 3 2 1 0 -1 -2 -3

4

1

4

4

8

*

8

8

24

*

24

24

* 1

4

8

24

Mutante phoP 3 2 1 0 -1 -2 -3 3 2 1 0 -1 -2 -3 3 2 1 0 -1 -2 -3 3 2 1 0 -1 -2 -3

ssrB

1

4

8

24

***

**

**

pipB

1

4

8

24

*

*

pipB2

1

4

8

*

1

4

8

24

sopB * 24

Tiempo post-infección (horas)

Figura 17. Cuantificación de los niveles de expresión de genes de la estirpe silvestre (SV5015) y el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium relacionados con SPI-1 y SPI-2 a distintos tiempos de la infección de fibroblastos NRK-49F. Se realizó el aislamiento de ARN y ADN a 1, 4, 8 y 24 horas de infección. Los datos, normalizados con la cantidad de ADN genómico en cada punto, representan el log10 de la expresión relativa en bacterias intracelulares con respecto a bacterias en fase exponencial crecidas en medio LB. Cada valor corresponde al promedio ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Se realizó análisis estadístico de los datos mediante ANOVA y post-prueba Dunnett, comparando cada punto de infección con 1 hora post-infección (p < 0,05). * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.

97

Capítulo 2

Niveles de expresión relativos a bacteria fase exponencial medio LB (log10)

Estirpe silvestre

Mutante phoP

4

4

2

2

0

0

-2

-2

-4

-4

mgtA

-6

-6 1

4

8

24

1

4

4

2

2

0

0

-2

-2

-4

-4

-6

4

8

24

mgtB

-6 1

4

8

24

1

4

4

2

2

0

0

-2

-2

-4

-4

-6

-6 1

4

8

24 4

2

2

0

0

-2

-2

-4

-4

-6

8

24

mgtC

1

4

4

4

8

24

pagC

-6 1

4

8

24

1

4

8

24

Tiempo post-infección (horas)

Figura 18. Cuantificación de los niveles de expresión de genes de la estirpe silvestre (SV5015) y el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium relacionados con el sistema PhoP-PhoQ a distintos tiempos de la infección de fibroblastos NRK-49F. Se realizó el aislamiento de ARN y ADN a 1, 4, 8 y 24 horas de infección. Los datos, normalizados con la cantidad de ADN genómico en cada punto, representan el log10 de la expresión relativa en bacterias intracelulares con respecto a bacterias en fase exponencial crecidas en medio LB. Cada valor corresponde al promedio ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Se realizó análisis estadístico de los datos mediante ANOVA y post-prueba Dunnett, comparando cada punto de infección con 1 hora post-infección (p < 0,05).

98

Niveles de expresión relativos a bacteria en medio N 10 mM Mg 2+ (log10)

Resultados

2,5 2,0

***

*

*

1,5

Estirpe silvestre

1,0

Mutante phoP 0,5 0,0

mgtA

mgtB

mgtC

Figura 19. Cuantificación de los niveles de expresión de los genes mgtA, mgtB y mgtC de la estirpe silvestre (SV5015) y el mutante MD1120 (phoP) de S. enterica serovar Typhimurium en el medio de cultivo N mediante RT-PCR cuantitativa. Se realizó el aislamiento de ARN de bacterias cultivadas en agitación constante en condiciones de activación (8 μM MgCl2) o represión (10 mM MgCl2) del sistema PhoP-PhoQ. Los datos, normalizados con los valores de ARN mensajero de ompA, representan el log10 de la expresión relativa en bacterias cultivadas con 8 μM de MgCl2 con respecto a bacterias cultivadas con 10 mM de MgCl2. Cada valor corresponde al promedio ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Se realizó análisis estadístico de los datos mediante prueba t no pareada de las diferencias entre las medias de la estirpe silvestre y el mutante phoP (p < 0,05). *p < 0,05; ***p < 0,001.

Expresión de las proteínas MgtA, MgtB, MgtC y PagC en bacterias localizadas en el interior de fibroblastos Con el fin de analizar la expresión de las proteínas MgtA, MgtB, MgtC y PagC en bacteria intracelular, se construyeron estirpes isogénicas con la etiqueta 3xFLAG en el extremo 3’ de los genes mgtA, mgtB, mgtC y pagC en su localización respectiva en el cromosoma (Uzzau et al., 2001). Estas variantes fueron introducidas en la estirpe silvestre y en los fondos genéticos phoP, ssrA y phoP ssrA para comprobar el perfil de regulación por el sistema phoP-PhoQ y/o SPI-2. Los inmunoensayos de “Western blot” revelaron que MgtC y PagC se producen en condiciones de bajo magnesio (8 μM) y en el ambiente intracelular (estirpe silvestre y mutante ssrA) a partir de las 2 horas post-infección. Los niveles de PagC son sin embargo menores en el mutante ssrA (Fig. 20). Estos resultados indican que el sistema SsrAB no está involucrado en la regulación de la expresión de MgtC, mientras que podría tener algún efecto sobre la expresión de la proteína PagC. Como era esperable, en el mutante phoP no se detecta producción de MgtC y PagC en el ambiente intracelular ni en bacterias

99

Capítulo 2

cultivadas a bajas concentraciones de magnesio (8 μM). Por otra parte, nos intrigaba el hecho de que no se observara producción de MgtA y MgtB en las bacterias intracelulares, a pesar de los resultados de expresión génica que demostraban la inducción de la expresión del gen mgtB. La detección de las proteínas MgtA y MgtB en medio de cultivo N con 8 μM de magnesio indicaba que estas proteínas etiquetadas se expresan correctamente aunque a niveles inferiores en comparación con MgtC (Fig. 20). La ausencia de detección de MgtB en bacterias intracelulares podría ser por tanto un problema de sensibilidad del método utilizado. Estos experimentos de infección se realizaron inicialmente en placas de cultivo con una superficie de 9,5 cm2, que permite cargar en cada pocillo del gel un máximo de aproximadamente 2x104 bacterias (estirpe silvestre) después de hacer la extracción de proteínas a las 24 horas postinfección. Posteriormente, optimizamos el método de preparación de extractos de proteínas totales, hasta alcanzar cargar aproximadamente 1,10x106 bacterias en cada pocillo del gel (ver materiales y métodos), logrando detectar no sólo la proteína MgtB, sino también la proteína MgtA en la estirpe silvestre (Fig. 21). En resumen, estos resultados demuestran que el serovar Typhimurium produce las proteínas MgtA, MgtB, MgtC y PagC durante la infección de fibroblastos.

Figura 20. Inmunodetección de las proteínas MgtA, MgtB, MgtC y PagC de S. enterica serovar Typhimurium tras la infección de fibroblastos NRK-49F. Se infectaron fibroblastos con las estirpes MD1929 (mgtA::3xFLAG), MD1931 (phoP mgtA::3xFLAG), MD1932 (ssrA mgtA::3xFLAG), MD1935 (phoP ssrA mgtA::3xFLAG), MD1930 (mgtB::3xFLAG), MD1933 (phoP mgtB::3xFLAG), MD1934 (ssrA mgtB::3xFLAG), MD1936 (phoP ssrA mgtB::3xFLAG), MD1942 (mgtC::3xFLAG), MD1951 (phoP mgtC::3xFLAG), MD1952 (ssrA mgtC::3xFLAG), MD1953 (phoP ssrA mgtC::3xFLAG), MD1178 (pagC::3xFLAG), MD1182 (phoP pagC::3xFLAG), MD1190 (ssrA pagC::3xFLAG) y MD1198 (phoP ssrA pagC::3xFLAG). Después de los diferentes tiempos de infección indicados se realizó extracción de proteínas totales de las células infectadas. Además, se prepararon extractos de proteínas totales de bacterias cultivadas durante 18 horas en agitación constante en medio de cultivo N con 10 mM u 8 μM de MgCl2. Las muestras corresponden a la siguiente cantidad de bacterias: ~5x106 (medio N 10 mM y 8 μM de MgCl2), ~2x104 (fibroblastos infectados con la estirpe silvestre y el mutante ssrA, 24 horas p.i.), ~3x105 (fibroblastos infectados con el mutante phoP, 24 horas p.i.) y ~5x104 (fibroblastos infectados con el mutante phoP ssrA, 24 horas p.i.). Las proteínas MgtA (~99 kDa), MgtB (~100 kDa), MgtC (~22 kDa) y PagC (~20 kDa) se detectaron utilizando el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2. Como controles se utilizaron la proteína de membrana externa de Salmonella OmpA (~37 kDa) y la proteína eucariota de la membrana del retículo endoplásmico, calnexina (~90 kDa).

100

Resultados

Estirpe silvestre

Mutante phoP

kDa 127

MgtA (3xFLAG)

127

MgtB (3xFLAG)

30

MgtC (3xFLAG)

17

PagC (3xFLAG)

30 17

OmpA

37 127

Calnexina

85

10 mM 8μM 1h 2h 4h 8h 24h

10 mM 8μM 1h 2h 4h 8h 24h

INTRACELULAR Mg2+ MEDIO N Fibroblastos NRK-49F

INTRACELULAR Mg2+ MEDIO N Fibroblastos NRK-49F

Mutante ssrA

Mutante phoP ssrA

kDa 127

MgtA (3xFLAG)

127

MgtB (3xFLAG)

30

MgtC (3xFLAG)

17

PagC (3xFLAG)

30 17

OmpA

37 127

Calnexina

85

10 mM 8μM 1h 2h 4h 8h 24h

Mg2+ MEDIO N

INTRACELULAR Fibroblastos NRK-49F

101

10 mM 8μM 1h 2h 4h 8h 24h

Mg2+ MEDIO N

INTRACELULAR Fibroblastos NRK-49F

Capítulo 2

MgtA

MgtB

(3xFLAG)

(3xFLAG)

kDa

FLAG M2 OmpA Calnexina 10 mM 8μM 8μM

127

127

37

37

127

127

85

85

24h

10 mM 8μM 8μM

1/10

Mg2+ MEDIO N

kDa

24h

1/10

INTRACELULAR Fibroblastos NRK-49F

Mg2+ MEDIO N

INTRACELULAR Fibroblastos NRK-49F

Figura 21. Inmunodetección de las proteínas MgtA y MgtB de S. enterica serovar Typhimurium tras la infección de fibroblastos NRK-49F. Se infectaron fibroblastos con las estirpes MD1929 (mgtA::3xFLAG) y MD1930 (mgtB::3xFLAG) utilizando placas de cultivo de 500 cm2. Después de 24 horas post-infección se realizó extracción de proteínas totales de las células infectadas según se indica en el apartado de materiales y métodos. Además, se prepararon extractos de proteínas totales de bacterias cultivadas durante 18 horas en agitación constante en medio de cultivo N con 10 mM u 8 μM de MgCl2. Las muestras corresponden a la siguiente cantidad de bacterias: ~5x106 (medio N 10 mM y 8 μM de MgCl2) y 1,10x106 (fibroblastos infectados 24 horas p.i.). Las proteínas MgtA (~99 kDa) y MgtB (~100 kDa) se detectaron utilizando el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2. Como controles se utilizaron la proteína de membrana externa de Salmonella OmpA (~37 kDa) y la proteína eucariota de la membrana del retículo endoplásmico, calnexina (~90 kDa).

102

Resultados

Expresión y secreción de SopB en Salmonella intracelular El análisis de transcriptómica de Salmonella intracelular sugirió que el gen sopB, que codifica una proteína efectora de SPI-1, podría estar expresándose en la estirpe silvestre tras 24 horas de infección (Fig 15). Sin embargo, mediante los experimentos de cuantificación relativa de expresión génica (RT-PCR cuantitativa) observamos que sopB se expresa, tanto en la estirpe silvestre como en el mutante phoP y sólo entre 1 y 4 horas post-infección (Fig. 17). Decidimos entonces evaluar la expresión de este gen a nivel de proteína a diferentes tiempos de infección. Para facilitar la inmunodetección de SopB se construyó una estirpe isogénica conteniendo una etiqueta 3xFLAG en el extremo 3’ del gen sopB (Uzzau et al., 2001). Utilizando la estirpe sopB::3xFLAG comprobamos que la proteína se produce y es secretada por Salmonella después de 1 y 2 horas de infección (Fig. 22). Las imágenes muestran que SopB se localiza próxima a la bacteria, formando pequeños agregados. Este patrón de distribución es similar en la estirpe silvestre y el mutante phoP (Fig. 23). De igual forma, realizamos extractos de proteínas totales de fibroblastos infectados con la estirpe silvestre y los mutantes phoP, ssrA y phoP ssrA que contienen el gen sopB etiquetado en su extremo 3’. Mediante ensayos de inmunodetección por “Western blot”, observamos la presencia de la proteína SopB después de 1, 2 y 4 horas post-infección en las cuatro estirpes utilizadas (Fig. 24). Estos resultados confirman la expresión de esta proteína en Salmonella en el interior del fibroblasto. A su vez sugieren que la expresión de SopB ocurre de manera independiente de los sistemas reguladores PhoP-PhoQ y SsrAB al menos después de 1, 2 y 4 horas de infección de fibroblastos.

103

Capítulo 2

Figura 22. Localización subcelular de SopB durante la infección de fibroblastos NRK-49F con S. enterica serovar Typhimurium. Las células se infectaron con la estirpe MD1180 (sopB::3xFLAG). Después de 1 y 2 horas de infección, las células infectadas se fijaron y se realizó la inmunotinción con un anticuerpo policlonal anti-LPS y con el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2. Como secundario se utilizó un anticuerpo de cabra anti-conejo acoplado al fluorocromo Alexa 488 (verde) y un anticuerpo anti-ratón conjugado al fluorocromo Alexa 594 (rojo). La combinación de las dos imágenes se muestra a la derecha de la figura. Los núcleos de los fibroblastos se tiñeron con DAPI (0,5 μg/ml, azul). Las flechas indican las bacterias que aparecen en los paneles ampliados. Nótese que la mayoría de las bacterias intracelulares no presentan la marca de SopB.

104

Resultados

LPS

FLAG

Combinación

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

1 hora 2 horas

sopB::3xFLAG

1 hora

10 μm

2 horas

105

Capítulo 2

Figura 23. Localización subcelular de SopB durante la infección de fibroblastos NRK-49F con S. enterica serovar Typhimurium. Las células se infectaron con la estirpe MD1185 (phoP sopB::3xFLAG). Después de 1 y 2 horas de infección, las células infectadas se fijaron y se realizó la inmunotinción con un anticuerpo policlonal anti-LPS y con el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2. Como secundario se utilizó un anticuerpo de cabra anti-conejo acoplado al fluorocromo Alexa 488 (verde) y un anticuerpo anti-ratón conjugado al fluorocromo Alexa 594 (rojo). La combinación de las dos imágenes se muestra a la derecha de la figura. Los núcleos de los fibroblastos se tiñeron con DAPI (0,5 μg/ml, azul). Las flechas indican las bacterias que aparecen en los paneles ampliados. Nótese que la mayoría de las bacterias intracelulares no presentan la marca de SopB.

106

Resultados

LPS

FLAG

Combinación

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

1 hora 2 horas

phoP sopB::3xFLAG

1 hora

10 μm

2 horas

107

Resultados

Mutante phoP

Estirpe silvestre

kDa 85

SopB (3xFLAG) OmpA

37 127

Calnexina

85

LB

1h

2h

4h

8h

24h

MEDIO DE INTRACELULAR CULTIVO Fibroblastos NRK-49F

LB

1h

2h

4h

8h

24h

MEDIO DE INTRACELULAR CULTIVO Fibroblastos NRK-49F

Mutante ssrA

Mutante phoP ssrA

kDa 85

SopB (3xFLAG) OmpA

37 127

Calnexina

85

LB

1h

2h

4h

8h

24h

MEDIO DE INTRACELULAR CULTIVO Fibroblastos NRK-49F

LB

1h

2h

4h

8h

24h

MEDIO DE INTRACELULAR CULTIVO Fibroblastos NRK-49F

Figura 24. Inmunodetección de SopB en S. enterica serovar Typhimurium intracelular. Los fibroblastos NRK-49F se infectaron con las estirpes MD1180 (sopB::3xFLAG), MD1185 (phoP sopB::3xFLAG), MD1193 (ssrA sopB::3xFLAG) y MD1923 (phoP ssrA sopB::3xFLAG). A los diferentes tiempos de infección indicados se realizó extracción de proteínas totales de las células infectadas. Como control, se muestra un extracto de bacterias cultivadas sin agitación en medio LB. Las muestras corresponden a la siguiente cantidad de bacterias: ~5x106 (medio LB), ~2x104 (fibroblastos infectados con la estirpe silvestre y el mutante ssrA, 24 horas p.i.), ~3x105 (fibroblastos infectados con el mutante phoP, 24 horas p.i.) y ~5x104 (fibroblastos infectados con el mutante phoP ssrA, 24 horas p.i.). La proteína SopB (~62 kDa) se detectó utilizando el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2. Otros controles incluyen la proteína de membrana externa de Salmonella OmpA (~37 kDa) y la proteína eucariota de la membrana del retículo endoplásmico, calnexina (~90 kDa).

109

Capítulo 2

Contribución de las proteínas efectoras PipB y PipB2 a la supervivencia de Salmonella durante la infección de fibroblastos En los apartados anteriores hemos visto que los genes que codifican las proteínas efectoras de SPI-2, PipB y PipB2, tienen valores de expresión muy altos en Salmonella intracelular (Fig. 16). Estas proteínas han sido asociadas con la formación de las estructuras filamentosas Sifs durante la infección de células epiteliales en cultivo, siendo PipB2 necesaria para la correcta extensión de dichas estructuras (Knodler et al., 2002; Knodler y SteeleMortimer, 2005). Los altos niveles de expresión de pipB y pipB2 durante la infección de fibroblastos contrastan con la ausencia de formación de Sifs en este tipo celular. Por esta razón nos planteamos analizar el comportamiento de mutantes deficientes en estas proteínas en fibroblastos. Los ensayos de proliferación intracelular mostraron que las estirpes que carecen de PipB, PipB2 o ambas proteínas no presentan diferencias en la tasa de crecimiento intracelular en comparación con la estirpe silvestre (Fig. 25A). De la misma forma, la ausencia de estos genes en el mutante phoP no produjo alteraciones en su alta tasa de crecimiento (Fig. 25B). Estos resultados indican que PipB y PipB2 no son proteínas esenciales para el control de la proliferación ni para la supervivencia de la bacteria dentro del fibroblasto.

110

Resultados

A Ipro (ufc 24h/ufc 2h)

2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Estirpe silvestre

B

∆pipB

∆pipB2

∆pipB∆pipB2

Ipro (ufc 24h/ufc 2h)

80 60 40 20 0

* Estirpe silvestre

phoP

phoP ∆pipB

phoP phoP ∆pipB2 ∆pipB∆pipB2

Figura 25. Índice de proliferación (Ipro) de la estirpe silvestre SL1344 y los mutantes MD1954 (ΔpipB), MD1955 (ΔpipB2) y MD1956 (ΔpipBΔpipB2) (A) y de los mutantes SV4056 (phoP), MD1126 (phoPΔpipB), MD1127 (phoPΔpipB2) y MD1128 (phoPΔpipBΔpipB2) (B) de S. enterica serovar Typhimurium en el interior de fibroblastos NRK-49F. Los valores mostrados corresponden a la media y a la desviación estándar de tres experimentos independientes. Se realizó análisis estadístico de los datos mediante ANOVA y post-prueba Dunnett, comparando las medias de los mutantes ΔpipB, ΔpipB2 y ΔpipBΔpipB2 con la de la estirpe silvestre (A) y las medias de la estirpe silvestre y los mutantes phoPΔpipB, phoPΔpipB2 y phoPΔpipBΔpipB2 con la del mutante phoP (B) (p < 0,05). *p < 0,05

111

Capítulo 2

Secreción de PipB, PipB2 y SseJ por Salmonella intracelular tras la infección de fibroblastos Trabajos anteriores han demostrado que proteínas secretadas por el SST3 de SPI-2 adoptan localizaciones concretas en la célula infectada al interaccionar con ligandos específicos (Kuhle y Hensel, 2004). En este sentido, se ha descrito que los efectores PipB, PipB2 y SseJ se localizan en la membrana de la SCV y en los Sifs durante la infección de células epiteliales por Salmonella (Freeman et al., 2003; Knodler et al., 2002; Knodler et al., 2003; Ruiz-Albert et al., 2002). Nuestro objetivo fue por tanto conocer la localización subcelular de estas proteínas durante el proceso de infección de fibroblastos, dada la ausencia de la formación de estas estructuras tubulares en este tipo celular. Se construyeron estirpes isogénicas con una etiqueta (3xFLAG o HA) en el extremo 3’ de los genes pipB, pipB2 y sseJ en el cromosoma (Uzzau et al., 2001). A continuación, realizamos la infección de fibroblastos NRK-49F con estas estirpes y examinamos su localización subcelular mediante microscopía de inmunofluorescencia. Después de 24 horas de infección, observamos la proteína PipB en forma de agregados posiblemente sobre la pared de la estirpe silvestre (Fig. 26A). Las imágenes obtenidas sugieren que estos agregados se localizan en diferentes zonas sobre la mayoría de las bacterias intracelulares, pero siempre concentrada en sitios donde el anticuerpo que reconoce el LPS parece tener menor acceso. La ausencia de marcaje con el anticuerpo anti-FLAG M2 en fibroblastos infectados con la estirpe silvestre sin la etiqueta en PipB descartó que el marcaje fuera inespecífico (Fig. 26B). Al examinar la localización de PipB en el mutante phoP, observamos que la proteína tiene un patrón de distribución diferente (Fig. 27A). Estas imágenes parecen indicar que el mutante phoP intracelular secreta la proteína PipB, la cual se sitúa rodeando la bacteria, probablemente ubicada en la membrana de la vacuola que contiene a Salmonella. Al analizar la distribución de PipB2 en células infectadas con la estirpe silvestre no obtuvimos señal con el marcador anti-HA (Fig. 28). Sin embargo, en los fibroblastos infectados con el mutante phoP observamos una gran cantidad de PipB2 distribuida alrededor de la bacteria (Fig. 29A). El tipo de marcaje obtenido se diferencia en el observado anteriormente para PipB en el mutante phoP. En este caso, PipB2 presenta una señal más definida, rodeando casi en su totalidad a la bacteria, mientras que PipB tiene una señal irregular conformada por pequeños agregados de proteína (Fig. 27A). Además de situarse rodeando la bacteria, PipB2 se localiza en zonas marginales de fibroblastos infectados con el mutante phoP (Fig. 30). Como se observa, PipB2 se sitúa en la periferia del fibroblasto, independientemente de la presencia de bacterias en esta zona. Esta distribución periférica no se observa en el caso de la proteína PipB (Fig. 30).

112

Resultados

Con respecto al efector SseJ, la proteína se detectó en los fibroblastos infectados con la estirpe silvestre en zonas muy próximas a la bacteria sin llegar a rodearla (Fig. 31). En el caso del mutante phoP, se distingue mayor cantidad de SseJ, que se encuentra rodeando la bacteria de manera muy similar a PipB2 (Fig. 32). Los resultados obtenidos en los ensayos de microscopía indican que las proteínas asociadas a SPI-2, PipB, PipB2 y SseJ presentan diferencias en su secreción y localización subcelular en células infectadas por la estirpe silvestre y el mutante phoP de Salmonella.

113

Capítulo 2

Figura 26. Localización de PipB durante la infección de fibroblastos NRK-49F con S. enterica serovar Typhimurium. Las células se infectaron con: (A) la estirpe MD1149 (pipB::3xFLAG) o (B) SL1344 (estirpe silvestre sin etiqueta). Después de 2 y 24 horas de infección, las células infectadas se fijaron y se realizó la inmunotinción con un anticuerpo policlonal anti-LPS y con el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2. Como secundario se utilizó un anticuerpo de cabra anti-conejo acoplado al fluorocromo Alexa 488 (verde) y un anticuerpo anti-ratón conjugado al fluorocromo Alexa 594 (rojo). La combinación de las dos imágenes se muestra a la derecha de la figura. Los núcleos de los fibroblastos se tiñeron con DAPI (0,5 μg/ml, azul). Las flechas indican las bacterias que aparecen en los paneles ampliados.

114

Resultados

A

LPS

FLAG

Combinación

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

24 horas 24 horas

pipB::3xFLAG

2 horas

10 μm

24 horas 24 horas

Estirpe silvestre

B

115

Capítulo 2

Figura 27. Localización de PipB durante la infección de fibroblastos NRK-49F con S. enterica serovar Typhimurium. Las células se infectaron con: (A) la estirpe MD1173 (phoP pipB::3xFLAG) o (B) SV4056 (phoP sin etiqueta). Después de 2 y 24 horas de infección, las células infectadas se fijaron y se realizó la inmunotinción con un anticuerpo policlonal antiLPS y con el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2. Como secundario se utilizó un anticuerpo de cabra anti-conejo acoplado al fluorocromo Alexa 488 (verde) y un anticuerpo anti-ratón conjugado al fluorocromo Alexa 594 (rojo). La combinación de las dos imágenes se muestra a la derecha de la figura. Los núcleos de los fibroblastos se tiñeron con DAPI (0,5 μg/ml, azul). Las flechas indican las bacterias que aparecen en los paneles ampliados.

116

Resultados

A

LPS

FLAG

Combinación

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

24 horas 24 horas

phoP pipB::3xFLAG

2 horas

10 μm

24 horas

B

phoP

24 horas

117

Capítulo 2

Figura 28. Localización de PipB2 durante la infección de fibroblastos NRK-49F con S. enterica serovar Typhimurium. Las células se infectaron con la estirpe MD1150 (pipB2::HA). Después de 2 y 24 horas de infección, las células infectadas se fijaron y se realizó la inmunotinción con un anticuerpo policlonal anti-LPS y con el anticuerpo monoclonal anti-HA. Como secundario se utilizó un anticuerpo de cabra anti-conejo acoplado al fluorocromo Alexa 488 (verde) y un anticuerpo anti-ratón conjugado al fluorocromo Alexa 594 (rojo). La combinación de las dos imágenes se muestra a la derecha de la figura. Los núcleos de los fibroblastos se tiñeron con DAPI (0,5 μg/ml, azul). Las flechas indican las bacterias que aparecen en los paneles ampliados.

118

Resultados

HA

Combinación

2 horas

pipB2::HA

LPS

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

24 horas

10 μm

119

Capítulo 2

Figura 29. Localización de PipB2 durante la infección de fibroblastos NRK-49F con S. enterica serovar Typhimurium. Las células se infectaron con la estirpe MD1174 (phoP pipB2::HA) o SV4056 (phoP sin etiqueta). Después de 2 y 24 horas de infección, las células infectadas se fijaron y se realizó la inmunotinción con un anticuerpo policlonal anti-LPS y con el anticuerpo monoclonal anti-HA. Como secundario se utilizó un anticuerpo de cabra anti-conejo acoplado al fluorocromo Alexa 488 (verde) y un anticuerpo anti-ratón conjugado al fluorocromo Alexa 594 (rojo). La combinación de las dos imágenes se muestra a la derecha de la figura. Los núcleos de los fibroblastos se tiñeron con DAPI (0,5 μg/ml, azul). Las flechas indican las bacterias que aparecen en los paneles ampliados.

120

Resultados

A

LPS

HA

Combinación

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

24 horas 24 horas

phoP pipB2::HA

2 horas

10 μm

24 horas

B phoP

24 horas

121

Capítulo 2

Figura 30. La proteína PipB2 se localiza en zonas periféricas de fibroblastos NRK-49F infectados con S. enterica serovar Typhimurium. Las células se infectaron con: (A) la estirpe MD1173 (phoP pipB::3xFLAG) o (B) MD1174 (phoP pipB2::HA). Después de 24 horas de infección, las células infectadas se fijaron y se realizó la inmunotinción con un anticuerpo policlonal anti-LPS y con los anticuerpos monoclonales anti-HA y anti-FLAG M2. Como secundario se utilizó un anticuerpo de cabra anti-conejo acoplado al fluorocromo Alexa 488 (verde) y un anticuerpo anti-ratón conjugado al fluorocromo Alexa 594 (rojo). La combinación de las dos imágenes se muestra a la derecha de la figura. Los núcleos de los fibroblastos se tiñeron con DAPI (0,5 μg/ml, azul). Las flechas indican la localización de PipB2 en las zonas perifericas del fibroblasto.

122

Resultados

LPS

Combinación

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

B

LPS

HA

Combinación

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

123

24 horas

phoP pipB2::·HA

FLAG

24 horas

phoP pipB::3xFLAG

A

Capítulo 2

Figura 31. Localización de SseJ durante la infección de fibroblastos NRK-49F con S. enterica serovar Typhimurium. Las células se infectaron con: (A) la estirpe MD1152 (sseJ::3xFLAG) o (B) SL1344 (estirpe silvestre sin etiqueta). Después de 2 y 24 horas de infección, las células infectadas se fijaron y se realizó la inmunotinción con un anticuerpo policlonal anti-LPS y con el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2. Como secundario se utilizó un anticuerpo de cabra anti-conejo acoplado al fluorocromo Alexa 488 (verde) y un anticuerpo anti-ratón conjugado al fluorocromo Alexa 594 (rojo). La combinación de las dos imágenes se muestra a la derecha de la figura. Los núcleos de los fibroblastos se tiñeron con DAPI (0,5 μg/ml, azul). Las flechas indican las bacterias que aparecen en los paneles ampliados.

124

Resultados

A

LPS

FLAG

Combinación

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

24 horas

sseJ::3xFLAG

2 horas

10 μm

24 horas 24 horas

Estirpe silvestre

B

125

Capítulo 2

Figura 32. Localización de SseJ durante la infección de fibroblastos NRK-49F con S. enterica serovar Typhimurium. Las células se infectaron con: (A) la estirpe MD1181 (phoP sseJ::3xFLAG) o (B) SV4056 (phoP sin etiqueta). Después de 2 y 24 horas de infección, las células infectadas se fijaron y se realizó la inmunotinción con un anticuerpo policlonal antiLPS y con el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2. Como secundario se utilizó un anticuerpo de cabra anti-conejo acoplado al fluorocromo Alexa 488 (verde) y un anticuerpo anti-ratón conjugado al fluorocromo Alexa 594 (rojo). La combinación de las dos imágenes se muestra a la derecha de la figura. Los núcleos de los fibroblastos se tiñeron con DAPI (0,5 μg/ml, azul). Las flechas indican las bacterias que aparecen en los paneles ampliados.

126

Resultados

A

LPS

FLAG

Combinación

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

10 μm

24 horas

phoP sseJ::3xFLAG

2 horas

10 μm

24 horas

B

phoP

24 horas

127

Resultados

Regulación de la expresión de SPI-2 del serovar Typhimurium en el interior de fibroblastos Como ya se ha comentado, el sistema PhoP-PhoQ se considera esencial para la expresión de los genes asociados a SPI-2 a través de la regulación que ejerce sobre el sistema SsrAB (Bijlsma y Groisman, 2005). Sin embargo, los resultados obtenidos mediante microscopía de inmunofluorescencia, demuestran la expresión y secreción de las proteínas PipB y SseJ en la estirpe silvestre y el mutante phoP durante la infección de fibroblastos. Además, hemos observado la síntesis y secreción de PipB2 en el mutante phoP intracelular. Utilizando las estirpes que contienen estas proteínas etiquetadas, además de una adicional expresando el regulador ssrB::3xFLAG, nos planteamos analizar su síntesis en Salmonella intracelular a diferentes tiempos post-infección. Para ello, se prepararon extractos de proteínas totales de fibroblastos infectados con la estirpe silvestre y los mutantes phoP, ssrA y phoP ssrA que tienen las proteínas PipB, PipB2 y SseJ etiquetadas. Como control de la síntesis de las proteínas etiquetadas analizamos su expresión en el medio mínimo PCN con 0,4 mM de fosfato inorgánico y pH 5,8 donde se induce la producción de estas proteínas (Lober et al., 2006). En la figura 33 se aprecian las proteínas SsrB, PipB, PipB2 y SseJ en la estirpe silvestre intracelular a partir de 4 horas post-infección, manteniéndose constantes los niveles hasta las 24 horas post-infección en este fondo genético. Es necesario destacar que en estos experimentos logramos detectar la producción de la proteína PipB2 en la estirpe silvestre intracelular a diferencia de lo observado en los ensayos de inmunofluorescencia. En el mutante phoP, se distingue la expresión de estas proteínas a partir de 4-8 horas post-infección. A las 24 horas post-infección, se aprecia un aumento en la cantidad de estas proteínas, posiblemente debido al incremento en el número de bacterias intracelulares, tal y como se demuestra mediante la proteína control de carga bacteriana OmpA (Fig. 33). Por el contrario, se aprecia una disminución de la cantidad de las proteínas PipB y PipB2 en el mutante phoP cultivado en medio PCN en comparación a la estirpe silvestre crecida en el mismo medio (Fig. 33). En los mutantes ssrA y phoP ssrA no se observa producción de PipB, PipB2 y SseJ en bacteria intracelular ni en bacteria crecida en medio de cultivo PCN (Fig. 33). En su conjunto, estos resultados demuestran que la expresión de las proteínas asociadas a SPI-2 (PipB, PipB2, SseJ) en el interior de fibroblastos es dependiente de la proteína sensora SsrA. En trabajos anteriores se ha demostrado que la expresión de estas proteínas depende del sistema SsrAB (Knodler et al., 2002; Knodler et al., 2003; Miao y Miller, 2000). Sin embargo, el sistema PhoP-PhoQ no parece esencial para la expresión de dichas proteínas de Salmonella durante la infección de fibroblastos.

129

Capítulo 2

Figura 33. Inmunodetección de las proteínas SsrB, PipB, PipB2 y SseJ en S. enterica serovar Typhimurium intracelular. Los fibroblastos NRK-49F se infectaron con las estirpes MD1177 (ssrB::3xFLAG), MD1184 (phoP ssrB::3xFLAG), MD1149 (pipB::3xFLAG), MD1173 (phoP pipB::3xFLAG), MD1186 (ssrA pipB::3xFLAG), MD1194 (phoP ssrA pipB::3xFLAG), MD1150 (pipB2::HA), MD1174 (phoP pipB2::HA), MD1187 (ssrA pipB2::HA), MD1195 (phoP ssrA pipB2::HA), MD1152 (sseJ::3xFLAG), MD1181 (phoP sseJ::3xFLAG), MD1189 (ssrA sseJ::3xFLAG) y MD1197 (phoP ssrA sseJ::3xFLAG). A los diferentes tiempos de infección indicados se realizó la extracción de proteínas totales de las células infectadas. Como control, se muestran extractos de bacterias cultivadas en medio LB sin agitación y en medio PCN (0,4 mM de fosfato inorgánico pH 5,8) en agitación constante. Las muestras corresponden a la siguiente cantidad de bacterias: ~5x106 (medio LB y PCN), ~2x104 (fibroblastos infectados con la estirpe silvestre y el mutante ssrA, 24 horas p.i.), ~3x105 (fibroblastos infectados con el mutante phoP, 24 horas p.i.) y ~5x104 (fibroblastos infectados con el mutante phoP ssrA, 24 horas p.i.). Las proteínas SsrB (~22 kDa), PipB (~32 kDa) y SseJ (~46 kDa) se detectaron utilizando el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2. La proteína PipB2 (~37 kDa) se detectó mediante un anticuerpo monoclonal anti-HA. Otros controles incluyen la proteína de membrana externa de Salmonella OmpA (~37 kDa) y la proteína eucariota de la membrana del retículo endoplásmico, calnexina (~ 90 kDa).

130

Resultados

Estirpe silvestre

Mutante phoP

SsrB (3xFLAG)

kDa 30 37

PipB (3xFLAG) PipB2 (HA)

37

SseJ (3xFLAG)

37

OmpA

37 127

Calnexina

85

LB PCN 1h 2h 4h 8h 24h

LB PCN 1h 2h 4h 8h 24h

MEDIO DE INTRACELULAR CULTIVO Fibroblastos NRK-49F

MEDIO DE INTRACELULAR CULTIVO Fibroblastos NRK-49F

Mutante ssrA

Mutante phoP ssrA

kDa 37

PipB (3xFLAG) PipB2 (HA)

37

SseJ (3xFLAG)

37

OmpA

37 127

Calnexina

85

LB PCN 1h 2h 4h 8h 24h

LB PCN 1h 2h 4h 8h 24h

MEDIO DE INTRACELULAR CULTIVO Fibroblastos NRK-49F

MEDIO DE INTRACELULAR CULTIVO Fibroblastos NRK-49F

131

Capítulo 2

OmpR es el regulador transcripcional del sistema de dos componentes OmpR-EnvZ. Este sistema controla la expresión de, entre otros, los genes que codifican las porinas OmpC y OmpF cuando se producen cambios de osmolaridad en el ambiente (Taylor et al., 1981). Además, OmpR-EnvZ se requiere para la supervivencia y proliferación de Salmonella en el interior de macrófagos (Lee et al., 2000) y es necesario para la virulencia de la bacteria en ratones (Chatfield et al., 1991; Dorman et al., 1989). Se ha sugerido que OmpR-EnvZ regula el sistema SsrAB, que a su vez activa la expresión de los genes de SPI-2 (Feng et al., 2003; Kim y Falkow, 2004; Lee et al., 2000). Nos planteamos evaluar por tanto el efecto del regulador transcripcional OmpR sobre la expresión de las proteínas asociadas a SPI-2 durante la infección de fibroblastos. Observamos que la ausencia del gen ompR ocasiona una disminución en los niveles de las proteínas SsrB, PipB, PipB2 y SseJ tanto en bacterias crecidas en el medio de cultivo PCN, como en bacterias intracelulares 24 horas postinfección, en comparación a la estirpe silvestre (Fig. 34). A continuación, decidimos analizar la cinética de expresión del regulador SsrB y de la proteína efectora PipB en estirpes carentes del regulador OmpR (Fig. 35). Mientras que las proteínas PipB y SsrB se expresan a partir de 2 horas de infección en la estirpe silvestre, observamos que en los mutantes phoP y ompR, estas proteínas eran detectadas después de 4 y 8 horas post-infección. Además, en la figura 35 se aprecia que la disminución de la expresión de estas proteínas es más evidente en el doble mutante phoP ompR, donde sólo se percibe una leve producción de estas proteínas en bacteria intracelular después de 8 horas de infección. Estos resultados apoyan la idea de un retardo en la expresión del regulador SsrB y de la proteína PipB como consecuencia de la ausencia de los reguladores transcripcionales PhoP y OmpR. Además, la falta de las proteínas PhoP y OmpR ocasiona la disminución de la producción de SsrB y PipB en bacteria intracelular. Conjuntamente, estos datos sugieren que los reguladores PhoP y OmpR podrían modular la activación de la expresión de SPI-2 en la fase temprana de la infección del fibroblasto (2-4 horas post-infección).

132

Resultados

kDa 30

SsrB (3xFLAG)

37

PipB (3xFLAG)

37

PipB2 (HA)

37

SseJ (3xFLAG)

37

OmpA

37

Calnexina

127 85

LB

PCN MEDIO DE CULTIVO

24h INTRACELULAR Fibroblastos NRK-49F

Figura 34. Inmunodetección de las proteínas SsrB, PipB, PipB2 y SseJ en S. enterica serovar Typhimurium intracelular. Los fibroblastos NRK-49F se infectaron con las estirpes MD1177 (ssrB::3xFLAG), MD1946 (phoP ssrB::3xFLAG), MD1940 (ompR ssrB::3xFLAG), MD1950 (phoP ompR ssrB::3xFLAG), MD1149 (pipB::3xFLAG), MD1943 (phoP pipB::3xFLAG), MD1937 (ompR pipB::3xFLAG), MD1947 (phoP ompR pipB::3xFLAG), MD1150 (pipB2::HA), MD1944 (phoP pipB2::HA), MD1938 (ompR pipB2::HA), MD1948 (phoP ompR pipB2::HA), MD1152 (sseJ::3xFLAG), MD1945 (phoP sseJ::3xFLAG), MD1939 (ompR sseJ::3xFLAG) y MD1949 (phoP ompR sseJ::3xFLAG). A las 24 horas post-infección se realizó la extracción de proteínas totales de las células infectadas. Como control, se muestran extractos de bacterias cultivadas en medio LB sin agitación y en medio PCN (0,4 mM de fosfato inorgánico pH 5,8) en agitación constante. Las muestras corresponden a la siguiente cantidad de bacterias: ~5x106 (medio LB y PCN), ~2x104 (fibroblastos infectados con la estirpe silvestre y el mutante ompR, 24 horas p.i.), ~3x105 (fibroblastos infectados con el mutante phoP, 24 horas p.i.) y ~9x104 (fibroblastos infectados con el mutante phoP ompR, 24 horas p.i.). Las proteínas SsrB (~22 kDa), PipB (~32 kDa) y SseJ (~46 kDa) se detectaron utilizando el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2. La proteína PipB2 (~37 kDa) se detectó mediante un anticuerpo monoclonal anti-HA. Otros controles incluyen la proteína de membrana externa de Salmonella OmpA (~37 kDa) y la proteína eucariota de la membrana del retículo endoplásmico, calnexina (~90 kDa).

133

Capítulo 2

Estirpe silvestre

Mutante phoP

kDa

PipB (3xFLAG)

37

SsrB (3xFLAG)

30

OmpA

37 127

Calnexina

85

LB PCN

1h 2h 4h

8h 24h

MEDIO DE INTRACELULAR CULTIVO Fibroblastos NRK-49F

Mutante ompR

LB PCN

1h 2h 4h

8h 24h

MEDIO DE INTRACELULAR CULTIVO Fibroblastos NRK-49F

Mutante phoP ompR

kDa

PipB (3xFLAG)

37

SsrB (3xFLAG)

30

OmpA

37 127

Calnexina

85

LB PCN

1h 2h 4h

8h 24h

MEDIO DE INTRACELULAR CULTIVO Fibroblastos NRK-49F

LB PCN

1h 2h 4h

8h 24h

MEDIO DE INTRACELULAR CULTIVO Fibroblastos NRK-49F

Figura 35. Inmunodetección de las proteínas SsrB y PipB en S. enterica serovar Typhimurium intracelular. Los fibroblastos NRK-49F se infectaron con las estirpes MD1177 (ssrB::3xFLAG), MD1946 (phoP ssrB::3xFLAG), MD1940 (ompR ssrB::3xFLAG), MD1950 (phoP ompR ssrB::3xFLAG), MD1149 (pipB::3xFLAG), MD1943 (phoP pipB::3xFLAG), MD1937 (ompR pipB::3xFLAG) y MD1947 (phoP ompR pipB::3xFLAG). A los diferentes tiempos de infección indicados se realizó extracción de proteínas totales de las células infectadas. Como control, se muestran extractos de bacterias cultivadas en medio LB sin agitación y en medio PCN (0,4 mM de fosfato inorgánico pH 5,8) en agitación constante. Las muestras corresponden a la siguiente cantidad de bacterias: ~5x106 (medio LB y PCN), ~2x104 (fibroblastos infectados con la estirpe silvestre y el mutante ompR, 24 horas p.i.), ~3x105 (fibroblastos infectados con el mutante phoP, 24 horas p.i.) y ~9x104 (fibroblastos infectados con el mutante phoP ompR, 24 horas p.i.). Las proteínas SsrB (~22 kDa) y PipB (~32 kDa) se detectaron utilizando el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2. Otros controles incluyen la proteína de membrana externa de Salmonella OmpA (~37 kDa) y la proteína eucariota de la membrana del retículo endoplásmico, calnexina (~90 kDa).

134

Resultados

Las figuras 33, 34 y 35 muestran que los niveles de la proteína control OmpA en los mutantes phoP ssrA y phoP ompR intracelulares son similares a los que presenta la estirpe silvestre intracelular, a pesar de no expresar correctamente los genes asociados a SPI-2. Esta aparente capacidad para proliferar intracelularmente de manera similar a la estirpe silvestre, se examinó mediante el cálculo del índice de proliferación intracelular. Estos ensayos mostraron que los mutantes phoP ssrA y phoP ompR presentan índices de proliferación superiores al de la estirpe silvestre, siendo significativa solamente la diferencia con el mutante phoP ompR (Fig. 36). Interesantemente, los mutantes ssrA y ompR tienen índices de proliferación similares a la estirpe silvestre, lo que sugiere que la ausencia del regulador transcripcional OmpR o de la proteína sensora SsrA no afecta a la supervivencia de la bacteria en el interior de fibroblastos.

Ipro (ufc 24h/ufc 2h)

80

60

** *

40

20

0 Estirpe phoP silvestre

ssrA phoP ssrA ompR phoP ompR

Figura 36. Índice de proliferación (Ipro) de la estirpe silvestre SL1344 y los mutantes SV4056 (phoP), SV4237 (ssrA), SV4241 (phoP ssrA), SV4235 (ompR) y SV4236 (phoP ompR) de S. enterica serovar Typhimurium en el interior de la línea de fibroblastos NRK49F. Los valores mostrados corresponden a la media y a la desviación estándar de tres experimentos independientes. Se realizó análisis estadístico de los datos mediante ANOVA y post-prueba Dunnett, comparando las medias de los mutantes phoP, ssrA, ompR, phoP ssrA y phoP ompR con la de la estirpe silvestre (p < 0,05). *p < 0,05 **p < 0,01

Los datos anteriores sobre la proliferación de los diferentes mutantes en el interior de fibroblastos proporcionan información “global”. Así, el cálculo del índice de proliferación intracelular o la inmunodetección de proteínas mediante “Western blot” no diferencian si el incremento de la proliferación bacteriana ocurre en todas las células infectadas por igual o por el contrario, es un fenómeno que se produce sólo en un grupo de células. Con el fin de establecer la proporción de células eucariotas que contienen las diferentes cantidades de bacteria intracelular, determinamos el número de bacterias en el interior de células

135

Capítulo 2

individuales a las 24 horas post-infección (Fig. 37). La mayoría de las células infectadas con la estirpe silvestre (92%) presentan entre 1 y 10 bacterias, mientras un pequeño porcentaje de células contienen más de 10 bacterias en su interior (Fig. 37A). Esta distribución en la proporción de bacterias intracelulares es similar en el caso de las células infectadas con los mutantes ssrA y ompR (Fig. 37B y C). Por el contrario, en fibroblastos infectados con el mutante phoP, el 65% de las células infectadas albergan más de 30 bacterias en su interior (Fig. 37D), de acuerdo con el sobrecrecimiento descrito para este mutante (Cano et al., 2001). En el caso de fibroblastos infectados con los mutantes phoP ssrA y phoP ompR se observa un comportamiento intermedio, ya que el porcentaje de células infectadas que contienen entre 1 y 10 bacterias disminuye con respecto a la estirpe silvestre, mientras que aumenta la cantidad de células que presentan más de 10 bacterias en su interior (Fig. 37E y F). Estos resultados sugieren que los dobles mutantes phoP ssrA y phoP ompR proliferan en el interior de fibroblastos tras 24 horas de infección en mayor medida que la estirpe silvestre, coincidiendo con los índices de proliferación intracelular obtenidos (Fig. 36).

136

Resultados

A 100

100

80

80

60

60

40

40

20

20

0

Porcentaje de células infectadas

D

Estirpe silvestre

1-10

B

11-30

0

>30

100

80

80

60

60

40

40

20

20

1-10

C

11-30

>30

0

100

80

80

60

60

40

40

20

20

1-10

11-30

0

>30

11-30

>30

phoP ssrA

1-10

F

ompR

100

0

1-10

E

ssrA

100

0

phoP

11-30

>30

phoP ompR

1-10

11-30

>30

Nº bacterias/célula Figura 37. Distribución de bacterias intracelulares en el interior de fibroblastos NRK-49F. Las células se infectaron con la estirpe silvestre SL1344 y los mutantes SV4056 (phoP), SV4237 (ssrA), SV4241 (phoP ssrA), SV4235 (ompR) y SV4236 (phoP ompR) de S. enterica serovar Typhimurium. Después de 24 horas de infección se realizó inmunotinción de las células infectadas un anticuerpo policlonal anti-LPS. Como secundario se utilizó un anticuerpo de cabra anti-conejo acoplado al fluorocromo Alexa 488 (verde). Los núcleos de los fibroblastos se tiñeron con DAPI (0,5 μg/ml, azul). Mediante observación microscópica se estimó el número de bacterias intracelulares en un número mínimo de 200 células infectadas con cada estirpe.

137

DISCUSIÓN

Discusión

En el transcurso de la infección, S. enterica serovar Typhimurium interacciona con enterocitos, células M, neutrófilos, macrófagos y células dendríticas (Santos y Baumler, 2004; Yrlid et al., 2001). Estudios recientes también demuestran la capacidad de este patógeno para infectar linfocitos T y B (Geddes et al., 2007). De forma mayoritaria, la virulencia de Salmonella ha sido estudiada en modelos in vitro basados en líneas de células epiteliales y macrófagos. A pesar de la ubicuidad de los fibroblastos en tejidos, estas células han sido rara vez usadas como modelo para estudiar la interacción de Salmonella con la célula hospedadora. Una posible razón puede ser la ausencia de pruebas que demuestren la infección de fibroblastos por Salmonella in vivo (Santos y Baumler, 2004). Trabajos recientes han demostrado no obstante que S. enterica serovar Typhimurium infecta células negativas para marcadores fagocíticos en la lámina propia del intestino de ratones (Boyle et al., 2007; Tierrez y García-del Portillo, 2005). Curiosamente, la infección de fibroblastos por el serovar Typhimurium resulta en una población homogénea con escaso número de bacterias intracelulares, fenómeno que se asemeja a lo observado in vivo. En nuestra opinión, esta similitud confiere relevancia al fibroblasto como un modelo de estudio de la interacción de Salmonella con células eucariotas. En este trabajo de Tesis quisimos estudiar el intercambio de señales existentes entre S. enterica serovar Typhimurium y el fibroblasto durante el proceso de infección. Para ello, analizamos en primer lugar los cambios de expresión génica de fibroblastos en respuesta a la infección por Salmonella. En la información obtenida en este estudio destaca la inducción de genes relacionados con respuesta inmune innata. Los datos que presentamos constituyen meramente una descripción del cambio transcripcional que experimentan los genes de los fibroblastos infectados. Simultáneamente, examinamos el patrón de expresión génica de Salmonella en el interior de fibroblastos. Mediante este estudio creemos que se ha obtenido información novedosa sobre el estilo de vida intracelular de Salmonella. En este caso, profundizamos en los datos obtenidos en el análisis de transcriptómica, lo que nos ha permitido esclarecer algunos aspectos de la regulación de importantes funciones de virulencia de la bacteria durante la infección de fibroblastos. La respuesta del fibroblasto a la infección por Salmonella Los resultados obtenidos del análisis de transcriptómica de fibroblastos cultivados in vitro e infectados con la estirpe silvestre y el mutante phoP de Salmonella, indican que la mayor proporción de genes que aumentan sus niveles de expresión están relacionados con respuesta inmune innata e inflamación. Dentro de este grupo se encuentran genes que codifican las quimioquinas CINC-1, CIN-2α, CINC-2β, CINC-3, CXCL10, CCL2, CCL20 y CCL22, la molécula de adhesión ICAM-1, y las proteínas RIP-2 y MMP-3 (Fig. 4 y 5). Por

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otra parte, de los 151 genes que disminuyen sus niveles de expresión en fibroblastos infectados con la estirpe silvestre, aproximadamente el 40% son de función desconocida y constituyen un grupo interesante de posibles funciones del fibroblasto que son moduladas en respuesta a la infección por Salmonella. Dentro de este grupo encontramos genes relacionados con el citoesqueleto de actina y el tráfico de membranas que disminuyen sus niveles de expresión en respuesta a la infección. A pesar de que no logramos confirmar estos cambios de expresión en 5 genes de este grupo mediante RT-PCR cuantitativa, sin duda pensamos que en este conjunto de genes podría haber información relevante del proceso de infección que seguiremos estudiando. La inducción de genes involucrados en respuesta inmune innata ha sido documentada anteriormente en otros tipos celulares infectados con Salmonella. En el patrón transcripcional global de células epiteliales y macrófagos infectados con este patógeno predomina la inducción de genes de respuesta pro-inflamatoria que codifican quimioquinas, citoquinas y moléculas de adhesión (Detweiler et al., 2001; Eckmann et al., 2000; Rosenberger et al., 2000). En uno de estos trabajos se demostró que la infección de macrófagos con la estirpe silvestre o el mutante phoP conduce a una respuesta inflamatoria similar (Detweiler et al., 2001). Estas observaciones coincidirían con los resultados que hemos obtenido en fibroblastos. Curiosamente, distintos estudios realizados in vivo demuestran que en respuesta a la infección de ratones, ratas y cerdos por Salmonella, los genes que más se inducen en tejidos como las placas de Peyer y los linfonódulos mesentéricos están involucrados en el reclutamiento de células del sistema inmunológico al sitio de infección (Handley y Miller, 2007; Rodenburg et al., 2007a; Rodenburg et al., 2007b; Wang et al., 2007). Es interesante destacar que en el estudio llevado a cabo por Handley y Miller se observa además la inducción de varios genes que codifican metaloproteinasas de matriz (MMP) en placas de Peyer de ratones infectados. En particular, los autores sugieren que la MMP-3 podría estar relacionada con la producción o liberación de citoquinas inflamatorias en respuesta a la infección por Salmonella, ya que los niveles de estas citoquinas disminuyen en el bazo y el suero de ratones mmp-3-/- (Handley y Miller, 2007). La respuesta del hospedador ante la infección está generalmente mediada por el reconocimiento de patrones moleculares conservados como el LPS, la flagelina o el peptidoglicano. Este reconocimiento puede ocurrir en la superficie de la célula y en compartimientos vesiculares mediante receptores de tipo Toll (TLRs), y también en el citoplasma de la célula infectada por miembros de la familia de receptores de tipo NOD (NLRs) (Kufer y Sansonetti, 2007). Después que el patógeno es detectado por estos receptores, se inicia una cascada de señalización que resulta en la activación de factores de

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transcripción como NF-κβ, un regulador clave en la generación de la respuesta proinflamatoria, accionando la expresión de genes que codifican citoquinas, quimioquinas, moléculas de adhesión e inhibidores de apoptosis (Bonizzi y Karin, 2004). De hecho, Jenner y Young, mediante la revisión de 32 estudios de transcriptómica que abarcan más de 77 interacciones patógeno-hospedador diferentes, definieron un grupo de 511 genes que muestran un patrón de expresión común entre los diversos tipos celulares infectados (Jenner y Young, 2005). Entre ellos se encuentran genes asociados a respuesta inmune, particularmente aquellos que codifican citoquinas y quimiocinas. Los autores sugieren que este grupo de genes representa un programa transcripcional común mediante el cual se induce la respuesta inflamatoria. Estas alteraciones podrían ser dominantes sobre la respuesta específica a factores de virulencia de la bacteria, ya que es frecuentemente la única observada cuando se comparan estirpes virulentas y no virulentas (Coombes et al., 2004). Los resultados del presente trabajo con fibroblastos infectados in vitro con Salmonella están de acuerdo con otros estudios que demuestran cómo cultivos primarios de fibroblastos tratados con antígenos bacterianos como el LPS, inician la secreción de citoquinas proinflamatorias y la expresión de moléculas de adhesión (Chakravortty y Kumar, 1999; Kumagai et al., 2005; Mahanonda et al., 2007; Pang et al., 1994; Perfetto et al., 2003). En su conjunto, estos resultados evidencian que los fibroblastos, tradicionalmente catalogados como células estructurales, son capaces de liberar mediadores pro-inflamatorios, pudiendo modular el comportamiento y función de las células del sistema inmunológico (Coelho et al., 2005; Smith et al., 1997). La capacidad de los fibroblastos para expresar quimioquinas en respuesta a la infección in vitro con Salmonella plantea la posibilidad de que este tipo celular pueda estar involucrado en el reclutamiento de células del sistema inmunológico in vivo. De hecho, un trabajo reciente ha propuesto que durante la infección con Mycobacterium tuberculosis, los fibroblastos ubicados en la periferia de los granulomas son los mayores productores de la quimioquina CXCL8 (O'Kane et al., 2007). Por otra parte, después de la infección de ratones con S. enterica serovar Typhimurium, se produce la migración de neutrófilos, monocitos y células dendríticas a los tejidos linfoides intestinales (Rydstrom y Wick, 2007; Sundquist y Wick, 2005). Como se ha comentado anteriormente, datos previos de nuestro laboratorio sugieren que fibroblastos de la lámina propia intestinal de ratones podrían ser diana de Salmonella (Tierrez y García-del Portillo, 2005). Estos hechos nos permiten sugerir que los fibroblastos situados en la lámina propia del intestino (Adegboyega et al., 2002) podrían potencialmente dirigir el reclutamiento de neutrófilos, células dendríticas y monocitos mediante la liberación de quimioquinas como CINCs, CCL20 y CCL2. Este modelo requiere

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no obstante de experimentos adicionales que analicen en detalle las poblaciones celulares que contienen la bacteria en esta región subepitelial. Estilo de vida de Salmonella en el interior de la vacuola del fibroblasto Las bacterias patógenas, al igual que cualquier otro organismo, regulan de forma precisa la expresión de genes que utilizan al encontrarse con ambientes cambiantes. Dicha expresión debe ser controlada por reguladores específicos que coordinan la expresión de factores de virulencia en tiempo y espacio apropiados. La tecnología de “microarrays” es un método eficaz para estudiar de manera simultánea estos mecanismos de regulación. Así, se ha utilizado para analizar la expresión génica de patógenos bacterianos como Shigella flexneri, Listeria monocytogenes, M. tuberculosis, Staphylococcus aureus y S. enterica durante la infección de células hospedadoras (Chatterjee et al., 2006; Eriksson et al., 2003; Faucher et al., 2006; Garzoni et al., 2007; Hautefort et al., 2007; Joseph et al., 2006; Lucchini et al., 2005; Schnappinger et al., 2003; Tailleux et al., 2008). Nuestro trabajo realizado en fibroblastos comprende, a nuestro conocimiento, el primer análisis de transcriptómica de S. enterica serovar Typhimurium en ausencia de crecimiento de esta bacteria en el interior de células eucariotas. El propósito de este estudio fue examinar la interacción Salmonella-célula eucariota en una situación más acorde con lo observado en infecciones in vivo (Geddes et al., 2007; Grant et al., 2008; Salcedo et al., 2001). Tal como se expone a continuación, los resultados obtenidos difieren sustancialmente de lo descrito anteriormente mediante abordajes de transcriptómica en macrófagos (Eriksson et al., 2003; Faucher et al., 2006) y células epiteliales en cultivo (Hautefort et al., 2007). A pesar de la pronunciada diferencia en la tasa de crecimiento durante la infección de fibroblastos, la estirpe silvestre y el mutante phoP experimentan cambios en la expresión de 101 genes de manera similar en el interior de este tipo celular (Tablas 6 y 7). Estos genes podrían reflejar la respuesta de la bacteria ante condiciones comunes del ambiente intravacuolar del fibroblasto. Dentro de este grupo encontramos genes relacionados con funciones y necesidades energéticas, metabólicas, de nutrición y con mecanismos de supervivencia y virulencia que podría utilizar Salmonella dentro del fibroblasto. Entre los grupos de genes que muestran patrones de expresión similares en la estirpe silvestre y el mutante phoP intracelular, se encuentran la disminución de la expresión de genes relacionados con el flagelo y quimiotaxis (Fig. 13, tabla A8). La expresión de la maquinaria flagelar es un proceso complejo que requiere una gran demanda de energía. Además, la producción del flagelo durante la infección puede estimular la respuesta inmune

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innata del hospedador (Franchi et al., 2006; Miao et al., 2006; Molofsky et al., 2006). En consecuencia, patógenos intracelulares como Bordetella brochiseptica, L. monocytogenes y S. enterica serovar Typhi reprimen la producción del flagelo poco después de la infección (Akerley et al., 1995; Grundling et al., 2004; Winter et al., 2008). Nuestros resultados sugieren que la inhibición de la síntesis del flagelo de Salmonella en el interior del fibroblasto podría favorecer el aprovechamiento de energía por la bacteria y evitar su reconocimiento mediante receptores del sistema inmunológico. Durante la infección de macrófagos en cultivo, Salmonella reduce la expresión de los genes relacionados con motilidad (Eriksson et al., 2003). Sin embargo, en el interior de células epiteliales HeLa se induce la expresión de genes involucrados con la biosíntesis de la maquinaria flagelar (Hautefort et al., 2007). Estas diferencias reflejan una vez más que las interacciones de Salmonella con la célula hospedadora son muy variables y dependen en gran medida del tipo celular. Se ha propuesto que el serovar Typhimurium podría utilizar derivados ácidos de azúcares y glucosa como fuentes de carbono en el interior de macrófagos y células epiteliales (Eriksson et al., 2003; Hautefort et al., 2007). Nuestros datos en fibroblastos indican la represión generalizada de la expresión de los genes relacionados con el catabolismo de azúcares (glicólisis, ruta de las pentosas fosfato y la vía Entner-Doudoroff), lo que sugiere que Salmonella podría usar fuentes de carbono alternativas. Diversos trabajos de transcriptómica han sugerido que durante el crecimiento en el interior del fagosoma de macrófagos, M. tuberculosis utiliza ácidos grasos como fuente de carbono. Tal conclusión se ha deducido de la inducción de la expresión de genes involucrados en la β-oxidación de los ácidos grasos y en el ciclo del glioxilato (Rachman et al., 2006; Rohde et al., 2007; Schnappinger et al., 2003; Tailleux et al., 2008). Además, se ha demostrado que la enzima clave del ciclo del glioxilato, isocitrato liasa, es importante para la supervivencia y persistencia de esta bacteria en los pulmones de ratones infectados (McKinney et al., 2000; Muñoz-Elías y McKinney, 2005). Igualmente, hay un aumento en la expresión de esta enzima en S. enterica serovar Typhi durante la infección de macrófagos (Faucher et al., 2006). En este sentido, hemos observado la inducción en Salmonella intracelular de la expresión de los genes yfcY, yfcX e ydiD y acs, relacionados con la utilización de ácidos grasos y acetato, respectivamente (Campbell et al., 2003; Cozzone, 1998; Morgan-Kiss y Cronan, 2004) (Fig. 12, tabla A7). De igual forma, los genes que codifican las enzimas del ciclo del glioxilato, isocitrato liasa (aceA) y malato sintasa (aceB), muestran valores de inducción en Salmonella intracelular con respecto a la bacteria en la fase exponencial de crecimiento (Fig. 12, tabla A7). Estos resultados indican que tanto la estirpe silvestre como el mutante phoP podrían utilizar ácidos grasos y acetato como fuentes de carbono durante la infección de fibroblastos. Similar al caso de M. tuberculosis, un trabajo reciente ha demostrado que AceA es importante para el

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mantenimiento del estado de persistencia del serovar Typhimurium durante la infección crónica de ratones Nramp1+/+, mientras que no es necesaria durante la fase aguda de la infección (Fang et al., 2005). Este trabajo indica que la utilización de los ácidos grasos y acetato como fuentes de carbono puede ser una adaptación metabólica importante en infecciones persistentes. Igualmente, un mutante de Salmonella incapaz de utilizar los ácidos grasos es menos virulento durante la infección de ratones (Utley et al., 1998). El hecho de que los genes relacionados con estas rutas se expresen en Salmonella en el interior de fibroblastos resalta la importancia de este tipo celular como modelo de infección, donde Salmonella muestra mecanismos y adaptaciones similares a las observadas en modelos animales. Los genes relacionados con respiración presentan igualmente un cambio en sus niveles de expresión. Así, los genes que codifican componentes involucrados en la respiración aeróbica (operones nuo y cyo) disminuyen sus niveles de expresión, mientras que los genes fdnI, narZ, nirD y torC, que codifican proteínas involucradas en la respiración anaeróbica, se inducen. El patrón de expresión de estos genes sugiere que Salmonella posiblemente se exponga a un ambiente de hipoxia en el interior de la vacuola donde se encuentra. Igualmente, los genes que codifican las subunidades de la ATP sintasa (operón atp) se muestran fuertemente reprimidos en relación a las bacterias en fase exponencial de crecimiento en medio LB. Estos datos podrían reflejar la diferente demanda de energía de la bacteria cuando crece en medio de cultivo o en el interior de la vacuola donde se hospeda. Se conoce muy poco acerca del metabolismo energético de Salmonella durante el proceso de infección. Por una parte, se ha establecido que en el interior de la vacuola de macrófagos y células epiteliales infectadas, Salmonella induce la expresión de los genes involucrados en la generación de ATP y con respiración aeróbica (Eriksson et al., 2003; Hautefort et al., 2007). Sin embargo, otro estudio sobre la expresión de enzimas del serovar Typhimurium en el bazo de ratones BALB/c infectados, muestra que la bacteria utiliza aceptores de electrones de respiración aeróbica y anaeróbica (Becker et al., 2006). Es evidente que existe gran disparidad entre estos resultados, que pueden ser reflejo de variaciones experimentales como la cepa de Salmonella, el tiempo y el modelo de infección utilizados entre estos estudios. A pesar de las diferencias observadas entre los resultados de este trabajo con otros modelos de infección de Salmonella, nuestros datos coinciden con la reducción de la síntesis de ATP y el uso de aceptores de electrones alternativos al oxígeno descrito en M. tuberculosis, tanto durante la infección crónica de ratones (Shi et al., 2005), como en macrófagos en cultivo (Schnappinger et al., 2003; Tailleux et al., 2008). Se ha determinado que la vacuola donde reside Salmonella tras la infección de células epiteliales contiene bajas concentraciones de hierro y magnesio (García-del Portillo et al.,

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1992). En este sentido nuestro estudio de transcriptómica en fibroblastos señala que el ambiente intravacuolar tendría cantidades escasas de magnesio, manganeso, hierro y fosfato, pues hay una notable inducción de los genes mntH, sitABCD, mgtB, iroBCDEN y pstSCAB (Fig. 14). Se ha demostrado que los genes que codifican transportadores de manganeso, mntH y sitABCD, se inducen en Salmonella en el interior de macrófagos Nramp1+/+ (Zaharik et al., 2004), siendo además importantes para la virulencia de la bacteria durante la infección de ratones Nramp1+/+ (Janakiraman y Slauch, 2000; Zaharik et al., 2004). Curiosamente, en relación a la captación de hierro, se inducen genes relacionados con la síntesis (iroB), secreción (iroC, iroE) y utilización (iroD, iroN) del sideróforo salmoquelina (Crouch et al., 2008; Fischbach et al., 2006) (Fig. 14, tabla A9). Recientemente se ha demostrado que el sideróforo salmoquelina es de crucial importancia para la virulencia de Salmonella durante la infección de ratones Nramp1+/+, mientras que la enterobactina tendría una contribución menor (Crouch et al., 2008). De manera similar, en el interior de macrófagos y células epiteliales, Salmonella también activa sistemas de captación de hierro, manganeso, magnesio y fosfato (Eriksson et al., 2003; Hautefort et al., 2007; Shi et al., 2006). Una estrategia similar es aparentemente usada por M. tuberculosis, S. aureus y S. flexneri durante la infección de células eucariotas, donde se inducen los transportadores de hierro, magnesio o fosfato (Garzoni et al., 2007; Lucchini et al., 2005; Schnappinger et al., 2003; Timm et al., 2003). El hecho de que otros patógenos intracelulares induzcan los sistemas de captación de hierro, magnesio o fosfato refuerza la teoría de que el ambiente intravacuolar de células eucariotas infectadas es pobre en estos iones. Los genes de virulencia localizados en las islas de patogenicidad tienen un papel determinante en la patogénesis de S. enterica (Hensel, 2004). SPI-1 es esencial para la invasión de células no fagocíticas mediante la secreción de proteínas efectoras a través del SST3 que codifica (Ellermeier y Slauch, 2007). Entre estas proteínas se encuentra SopB, una fosfatidilinositol fosfatasa involucrada en la reorganización del citoesqueleto de actina de la célula hospedadora durante la entrada de la bacteria, y en la formación del fagosoma contribuyendo con la maduración de la SCV (Ly y Casanova, 2007). Mediante el análisis de los cambios de expresión del genoma de Salmonella durante la infección de fibroblastos, observamos que los genes invJ, invI y sopB aumentan sus niveles de expresión sólo en la estirpe silvestre intracelular (Fig. 15). Trabajos recientes han sugerido que SPI-1 podría ser importante en la fase intracelular de la infección (Brawn et al., 2007; Drecktrah et al., 2005) y para la virulencia de la bacteria en ratones varios días después de la infección (Giacomodonato et al., 2007; Lawley et al., 2006), por lo que pensamos que SPI-1 podría tener una función relevante durante la infección en fibroblastos. Sin embargo, experimentos posteriores demostraron que sopB no se induce en bacterias intracelulares tras 24 horas de

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infección (Fig. 17 y 24). No obstante, observamos que la proteína SopB se produce después de 1, 2 y 4 horas de infección (Fig. 22, 23, 24). Aunque se ha demostrado que el sistema PhoP-PhoQ es un regulador negativo de la expresión de los genes asociados con SPI-1 (Bajaj et al., 1996), nuestros experimentos indican que los sistemas PhoP-PhoQ y SsrAB no influyen negativamente en la expresión de SopB, al menos entre 1 y 4 horas post-infección (Fig. 24). El patrón de distribución de SopB en la membrana de la SCV observado mediante inmunofluorescencia (Fig. 22 y 23), es similar al observado durante la infección de células epiteliales HeLa con el serovar Typhimurium (Marcus et al., 2002). Sin embargo, estos autores detectan mediante “Western blot” la producción y secreción de SopB en bacterias intracelulares después de 8 horas de infección (Marcus et al., 2002). Esta diferencia posiblemente se deba a la mayor cantidad de bacterias intracelulares que alberga la línea de células epiteliales HeLa, además del hecho de que SopB está codificado en un plásmido multicopia, en contraposición a nuestra versión etiquetada en el cromosoma. Nuestros resultados nos permiten sugerir que después de la internalización en el fibroblasto, la bacteria sintetiza y secreta SopB, la cual es enviada a la membrana de la SCV. Estos datos indican que el SST3 de SPI-1 sigue activo en Salmonella en el interior de fibroblastos, al menos tras 4 horas de infección. Factores de virulencia de Salmonella con expresión ligada a la ausencia de crecimiento en la vacuola del fibroblasto La comparación de los patrones de expresión génica de la estirpe silvestre y el mutante phoP intracelular con respecto al de la estirpe silvestre en fase estacionaria (Fig. 11C), definió un grupo de 138 genes cuyos niveles de expresión sólo cambian en la estirpe silvestre en el interior de fibroblastos (Tablas 8 y 9). Dada la naturaleza del mutante utilizado (phoP), al menos parte de estos genes corresponden, como era esperable, a funciones reguladas por el sistema PhoP-PhoQ. Tal es el caso de los genes pagC, phoN y mgtCB, que se inducen sólo en la estirpe silvestre intracelular. La ausencia de expresión de estos genes en el mutante phoP nos permite considerar como óptimos los datos de transcriptómica obtenidos. Aproximadamente el 48% de los genes que se expresan de forma diferencial únicamente en la estirpe silvestre intracelular carecen de función conocida (Tablas 8 y 9). Este resultado sugiere que podrían existir funciones aún no caracterizadas de Salmonella, relacionados con la supervivencia y el control del crecimiento en el interior de fibroblastos que podrían estar reguladas por el sistema PhoP-PhoQ. De igual forma, en los estudios de transcriptómica del serovar Typhimurium durante la infección de macrófagos y células epiteliales en cultivo, un alto porcentaje de los genes diferencialmente expresados también carecen de función conocida (44 y 30% respectivamente) (Eriksson et al., 2003; Hautefort et

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al., 2007). Estos datos indican que hay funciones inéditas de Salmonella que se expresan en ambientes intracelulares y que podrían tener un papel importante en virulencia. Dentro del grupo de genes que presentan cambios de expresión únicamente en la estirpe silvestre intracelular, aparecen genes relacionados con la virulencia y persistencia de Salmonella (Tabla 8). Tal es el caso de 12 genes del plásmido de virulencia pSLT, dentro de los cuales están spvC y mig-5, descritos como necesarios para la infección sistémica y como factores inducidos dentro de macrófagos, respectivamente (Mazurkiewicz et al., 2008; Rychlik et al., 2006; Valdivia y Falkow, 1997). De igual forma, el análisis del patrón de expresión génica global del serovar Typhimurium en el interior de macrófagos reveló el aumento en la expresión de 20 genes del plásmido de virulencia, entre ellos spvC (Eriksson et al., 2003). Además, observamos que los genes relacionados con fimbrias, stbB y lpfA, se inducen sólo en la estirpe silvestre intracelular. Recientemenete se ha demostrado que los operones stb y lpf son importantes para la persistencia del serovar Typhimurium en el intestino de ratones infectados (Weening et al., 2005). Es preciso señalar que existe un grupo de genes que se expresan diferencialmente tanto en la estirpe silvestre y el mutante phoP intracelular, como en la estirpe silvestre que ha alcanzado la fase estacionaria en cultivos in vitro, en relación a bacterias creciendo en fase exponencial en medio LB (Fig. 11C). La fase estacionaria es un estado que alcanza la bacteria en condiciones de limitación de nutrientes, choque osmótico o alta densidad celular, lo que culmina con una parada del crecimiento (Lazazzera, 2000). Entre los genes con cambios de expresión similar encontramos la inducción de aquellos relacionados con el uso de los ácidos grasos y acetato como fuente de carbono y transporte de manganeso, lo que sugiere que Salmonella podría encontrar señales comunes en estos tres ambientes y responder de forma similar en consecuencia. Por otra parte, observamos la represión de genes asociados con metabolismo energético, respiración aeróbica y el flagelo. Estos datos indicarían que los cambios transcripcionales de la bacteria durante la infección de fibroblastos y en la fase estacionaria de crecimiento in vitro, estarían dirigidos al máximo aprovechamiento de energía, como se ha comentado anteriormente. Nuestros datos establecen que el ambiente intravacuolar del fibroblasto podría ser diferente al que Salmonella encuentra en el interior de macrófagos y células epiteliales (Eriksson et al., 2003; Hautefort et al., 2007). Así, nos atrevemos a defender variaciones sustanciales en los requerimientos nutricionales y energéticos de Salmonella. Por otro lado, somos conscientes que muchos de los resultados comentados hasta ahora no están validados por otras aproximaciones experimentales, por lo que deben ser interpretados con cautela. Sin embargo, la similitud de estos cambios transcripcionales de Salmonella en el interior de

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fibroblastos con aquellos que experimenta M. tuberculosis durante la infección de macrófagos (Rachman et al., 2006; Rohde et al., 2007; Schnappinger et al., 2003; Tailleux et al., 2008) o ratones (McKinney et al., 2000; Muñoz-Elías y McKinney, 2005; Shi et al., 2005), apoya la interpretación dada a nuestros resultados. El regulón PhoP-PhoQ de Salmonella durante la infección de fibroblastos El fibroblasto es un tipo celular donde se expresan péptidos antimicrobianos en respuesta al tratamiento con peptidoglicano (Rodríguez-Martínez et al., 2006). En los resultados de transcriptómica de Salmonella durante la infección de fibroblastos se produce un aumento en los niveles de expresión de los genes virK, ydeI, pagC y phoN, relacionados con la resistencia y exposición a péptidos antimicrobianos (Bader et al., 2003; Detweiler et al., 2003; Erickson y Detweiler, 2006). A pesar de que se ha demostrado que el gen virK está regulado por PhoP (Detweiler et al., 2003; Navarre et al., 2005), en el interior de fibroblastos observamos la inducción de este gen en el mutante phoP (M = 1,94) (Tabla A12), lo que sugiere una regulación distinta de virK en el ambiente intravacuolar del fibroblasto. Observamos además el aumento de la expresión del gen pagC sólo en la estirpe silvestre mediante cuantificación por RT-PCR cuantitativa entre 1 y 4 horas post-infección (Fig. 18), y a nivel de proteína en bacterias intracelulares, donde se detecta la producción de PagC a partir de 2 horas de infección. Estos resultados confirman que la expresión de PagC en las bacterias en el interior de fibroblastos depende del sistema PhoP-PhoQ, lo que concuerda con lo descrito en otros tipos celulares (Miller et al., 1989; Navarre et al., 2005). Por otro lado, no observamos inducción de los genes pagP, pagL, lpxO, ugd, pmrC y pmrHFIJKLM responsables de la modificación del lípido A del LPS (Gunn, 2008; Miller et al., 2005), ni de genes como yejABEF y mig-14, importantes en la resistencia a péptidos catiónicos antimicrobianos (Brodsky et al., 2005; Eswarappa et al., 2008). Aunque no tenemos una explicación a esta observación se podría especular con una situación de estrés particular dentro del fibroblasto diferente a la sugerida para otros tipos celulares (Eswarappa et al., 2008). Con respecto a PagC, aunque no se conoce con certeza su función durante la infección de células hospedadoras, parece ser requerida para el establecimiento de infecciones persistentes en ratones (Lawley et al., 2006). Por otra parte, en la estirpe silvestre intracelular, se induce el operón mgtCB localizado en SPI-3 (Fig. 15). Como ya se ha mencionado, el gen mgtB, junto con mgtA, codifica una ATPasa de tipo P regulada por el sistema PhoP-PhoQ que media el transporte de magnesio en Salmonella (Maguire, 2006). Debido a que MgtB y MgtA comparten propiedades estructurales y fisiológicas, nos sorprendió observar cambios en la expresión de mgtB solamente (Fig. 14 y 18). Después de optimizar el método de extracción de proteínas

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totales de fibroblastos infectados, observamos la producción de MgtB y MgtA en bacteria intracelular tras 24 horas de infección (Fig. 21). Este resultado apoya la teoría anteriormente mencionada de que la vacuola es un ambiente limitante en magnesio que Salmonella es capaz de percibir a través del sistema PhoP-PhoQ. Los resultados obtenidos sugieren que la presencia de péptidos antimicrobianos y la escasez de magnesio podrían ser señales de activación del sistema PhoP-PhoQ de Salmonella en el interior de la vacuola. En la actualidad no existe un consenso sobre las señales que percibe la proteína sensora PhoQ de Salmonella en el interior del fagosoma de macrófagos infectados. Se ha establecido que concentraciones micromolares de magnesio activan el sistema PhoP-PhoQ, mientras que concentraciones milimolares impiden esta activación mediante la unión del catión al dominio periplásmico de PhoQ (Chamnongpol et al., 2003; García Vescovi et al., 1996). Estos estudios se han realizado en condiciones in vitro basados en medios de cultivo de composición definida. Se desconoce si el fagosoma del macrófago contiene o no un ambiente pobre en magnesio, y actualmente hay opiniones enfrentadas sobre este tema. Por un lado, la medición directa de la concentración de Mg2+ en macrófagos durante la fase temprana de la infección indica una concentración de este catión dentro del rango milimolar (Martín-Orozco et al., 2006). Además, la ausencia de alguno de los transportadores de magnesio, MgtA y MgtB, no afecta a la virulencia de la bacteria durante la infección de ratones (Blanc-Potard y Groisman, 1997). Por esto, se han propuesto otras señales como los péptidos antimicrobianos y el pH ácido como responsables de la activación del sistema PhoP-PhoQ en el fagosoma de macrófagos infectados, mientras que la función de los cationes Mg2+ y Ca2+ sería la de mantener PhoQ es un estado inactivo (Prost y Miller, 2008). Sin embargo, no se ha determinado la concentración de magnesio en el fagosoma durante fases más tardías de la infección (5-6 horas post-infección), donde aún hay activación de PhoP (García-del Portillo et al., 1992). Por lo tanto sería importante, pero técnicamente difícil, determinar los cambios en la concentración de magnesio después de varias horas post-infección (Groisman y Mouslim, 2006). Por otra parte, no se ha comprobado aún el efecto sobre la virulencia de Salmonella de la ausencia simultánea de MgtA y MgtB, pues al tener características fisiológicas y estructurales similares podrían tener funciones redundantes y complementar una proteína la ausencia de la otra (Maguire, 2006). En el caso de la infección de fibroblastos, hemos obtenido evidencias que nos sugieren que la bacteria se expone a un ambiente con cantidades limitantes de magnesio (Fig. 21). A pesar de que se ha cuestionado la función de MgtA y MgtB como transportadores de este ión (Maguire, 2006), ambas proteínas se inducen en bacterias cultivadas en medios in vitro con concentraciones micromolares de magnesio (Tao et al., 1995 y Fig. 19, 20 y 21). Por

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Discusión

otra parte, hemos comprobado que las bacterias intracelulares inician la síntesis de MgtC tras 2 horas de infección (Fig. 20). Aunque de función desconocida, MgtC es importante para la virulencia de Salmonella y para la supervivencia en medios de cultivos con bajas concentraciones de magnesio y durante la infección de macrófagos (Blanc-Potard y Groisman, 1997; Lawley et al., 2006). Se ha demostrado que MgtC no es un transportador de magnesio (Moncrief y Maguire, 1998). Otros autores sugieren que podría modular la actividad de la ATPasa de tipo P de la célula eucariota afectando así la homeostasis iónica de la célula hospedadora (Gunzel et al., 2006). De esta manera, MgtC no estaría directamente ligada con la captación de Mg2+, pero podría estar relacionada con los efectos colaterales que conlleva su escasez. Regulación de SPI-2 en Salmonella dentro de la vacuola del fibroblasto SPI-2 es necesaria para la supervivencia y virulencia de Salmonella en células eucariotas en cultivo y durante la infección de ratones (Chan et al., 2005; Cirillo et al., 1998; Hensel et al., 1998; Ochman et al., 1996). En consecuencia, los genes de SPI-2 y aquellos que codifican proteínas efectoras secretadas por el SST3 de SPI-2 son frecuentemente identificados como los genes con los mayores niveles de expresión durante la infección in vitro de células epiteliales y macrófagos en cultivo (Eriksson et al., 2003; Faucher et al., 2006; Hautefort et al., 2007). De igual forma, se ha determinado que los genes asociados a SPI-2 son importantes para el establecimiento de infecciones persistentes de Salmonella en ratones Nramp1+/+ (Lawley et al., 2006). En este sentido, observamos como los genes localizados en SPI-2, así como aquellos que codifican proteínas efectoras del SST3 de SPI-2, aumentan sus valores de expresión tanto en la estirpe silvestre como en el mutante phoP intracelular en comparación con bacterias cultivadas en medio LB (Fig. 15 y 16). Cuando analizamos el patrón de expresión de los genes de las proteínas efectoras, observamos que pipB y pipB2 muestran los valores más altos de inducción (Fig. 16). No se ha determinado la función de PipB, sin embargo se ha sugerido que PipB2 podría estar relacionada con el posicionamiento de la SCV en una región yuxtanuclear próxima al MTOC y al aparato de Golgi (Henry et al., 2006), y con la correcta extensión de los Sifs en células epiteliales in vitro (Knodler y Steele-Mortimer, 2005). A pesar de los altos niveles de expresión de estos genes en Salmonella en el interior de fibroblastos, no se observa la formación de estas estructuras tubulares. Con el fin de comprender la función de PipB y PipB2 durante la infección de fibroblastos, analizamos el efecto que podría tener su ausencia en la supervivencia y proliferación de Salmonella intracelular. Mediante el cálculo del índice de proliferación intracelular, demostramos que la deleción de PipB, PipB2 o ambas proteínas no tiene ningún efecto aparente sobre la supervivencia de la bacteria (Fig. 25). Este resultado coincide con el

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Discusión

observado en el interior de células epiteliales y macrófagos, donde PipB y PipB2 no influyen directamente en la tasa de crecimiento intracelular (Knodler et al., 2002; Knodler et al., 2003). Resulta necesario destacar que la ausencia de otros efectores de SPI-2, como SifB y SseJ, no afecta o afecta levemente a la supervivencia intracelular o a la virulencia de Salmonella en ratones (Freeman et al., 2003; Ruiz-Albert et al., 2002). Esto sugiere que algunos efectores de SPI-2 podrían tener funciones redundantes como se ha sugerido en el caso de los efectores de SPI-1 (Zhou y Galán, 2001). El empleo de cepas de Salmonella que expresan versiones etiquetadas de PipB, PipB2 y SseJ en el cromosoma nos permitió examinar su distribución en el interior de los fibroblastos. Nuestros datos indican que la estirpe silvestre intracelular secreta PipB, la cual aparentemente permanece en forma de agregados en diferentes zonas muy cerca de la superficie de la bacteria después de 24 horas de infección (Fig. 26A). Curiosamente, en las zonas donde se detecta la proteína PipB-FLAG el anticuerpo que reconoce el LPS parece tener menor acceso, lo que nos sugiere que PipB podría localizarse sobre la superficie de la bacteria. Este patrón de distribución difiere considerablemente de lo descrito durante la infección de células epiteliales y macrófagos in vitro, donde PipB se localiza en la membrana de la SCV y a lo largo de los Sifs (Knodler et al., 2002). Sin embargo, se asemeja a la distribución de SseJ-HA sobre bacterias intracelulares en el interior de células epiteliales a 4 horas post-infección (Freeman et al., 2003). Esta localización de PipB es distinta en fibroblastos infectados con el mutante phoP, donde parece estar localizada en la membrana de la SCV (Fig. 27A). Estos resultados claramente indican un patrón de localización de PipB diferente entre estas dos estirpes. Por otro lado, en el caso de PipB2-HA, sólo pudimos detectar la proteína en los fibroblastos infectados con el mutante phoP 24 horas post-infección (Fig. 29). Los ensayos de “Western blot” revelaron que los niveles de expresión de PipB2 son similares a PipB en bacteria intracelular, lo que sugiere que la cantidad secretada de PipB2 por la bacteria es inferior. Esto podría explicar su difícil detección mediante inmunofluorescencia en fibroblastos infectados con la estirpe silvestre. Mediante estos experimentos podemos apreciar que el patrón de distribución de PipB2 difiere al de PipB en fibroblastos infectados con el mutante phoP. Una de las diferencias más evidentes es la localización de PipB2 en las zonas periféricas del fibroblasto (Fig. 30). Durante la infección de células epiteliales HeLa, PipB y PipB2 tienen distinta distribución después de ser secretadas. Ambas proteínas se sitúan en la membrana de la SCV y Sifs, pero PipB2 también se localiza en las regiones periféricas de la célula (Knodler et al., 2003). Además, estas dos proteínas parecen tener diferentes funciones en patogénesis. Mientras que PipB es necesaria para la colonización del ciego en gallinas (Morgan et al., 2004), PipB2 es importante durante la virulencia de la bacteria en ratones (Knodler et al., 2003). De esta manera, la diferencia

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Discusión

entre estas dos proteínas en la contribución a la patogénesis de Salmonella y en el patrón de localización en fibroblastos infectados sugiere que PipB y PipB2 tengan funciones distintas, tal y como se ha demostrado durante la infección de células epiteliales (Knodler y SteeleMortimer, 2005). Como en fibroblastos la SCV no permanece exclusivamente en la región yuxtanuclear y no hay formación de Sifs, son necesarios experimentos adicionales para clarificar la función de estas proteínas en el interior de fibroblastos infectados. De igual forma, en células epiteliales y macrófagos infectados con Salmonella se ha demostrado que la proteína SseJ se localiza en la membrana de la SCV y en los Sifs (Freeman et al., 2003; Ruiz-Albert et al., 2002). Nuestros resultados sugieren que SseJ es secretada por la bacteria y permanece en la membrana de la SCV en fibroblastos infectados (Fig. 31A y 32A). Aunque el patrón de distribución de SseJ es similar entre fibroblastos infectados con la estirpe silvestre y con el mutante phoP, en éstos últimos se observa mayor cantidad de secreción de la proteína, posiblemente debido al mayor número de bacterias intracelulares. Se ha propuesto recientemente que SseJ está involucrada en el mantenimiento de la integridad de la membrana de la SCV junto con otra proteína efectora de SPI-2, SifA, debido a su capacidad de esterificar y disminuir los niveles de colesterol en la membrana de la SCV (Nawabi et al., 2008; Ohlson et al., 2005). La ubicación similar de SseJ en la membrana de la SCV en fibroblastos podría indicar una función de SseJ conservada en distintos tipos celulares. Otro aspecto que nos interesó analizar fue el circuito de regulación que controla la expresión de los genes de SPI-2, conocido sólo parcialmente y caracterizado mayoritariamente en bacterias cultivadas en medios de laboratorio. Mientras que algunos autores sostienen que el sistema de dos componentes PhoP-PhoQ modula la inducción de la expresión de los genes de SPI-2 (Bijlsma y Groisman, 2005; Deiwick et al., 1999), otros apuntan al sistema OmpR-EnvZ como responsable de la regulación de la expresión de los genes relacionados con esta isla de patogenicidad (Feng et al., 2003; Feng et al., 2004; Garmendia et al., 2003; Kim y Falkow, 2004; Lee et al., 2000; Lober et al., 2006). En particular, Bijlsma y Groisman sostienen que PhoP se une a la región promotora del gen ssrB, siendo esencial para su expresión. En consecuencia, el sistema PhoP-PhoQ regula la expresión de los genes asociados a SPI-2 de Salmonella en el interior de macrófagos (Bijlsma y Groisman, 2005). Mediante los experimentos de expresión génica de Salmonella en el interior de fibroblastos hemos visto que los genes del SST3 de SPI-2 y genes que codifican proteínas efectoras aumentan sus niveles de expresión tanto en la estirpe silvestre como en el mutante phoP tras 24 horas de infección (Fig. 15, 16 y 17). Mediante ensayos de inmunofluorescencia, comprobamos también que las dos estirpes (silvestre y mutante phoP) secretan las proteínas PipB, PipB2 y SseJ en la fase intracelular de la infección (Fig. 26, 27,

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Discusión

29, 31 y 32). A nuestro entender, estos resultados prueban que el sistema de dos componentes PhoP-PhoQ no es absolutamente esencial para la activación de genes relacionados con SPI-2 en bacterias que residen dentro del fibroblasto. Este resultado difiere del modelo de regulación de SPI-2 propuesto para Salmonella en el interior de macrófagos (Bijlsma y Groisman, 2005). Debido a que los experimentos comentados anteriormente se realizaron únicamente en fibroblastos infectados tras 24 horas, realizamos cinéticas de expresión de las proteínas efectoras PipB, PipB2 y SseJ, así como del regulador transcripcional de SPI-2, SsrB, en Salmonella intracelular a diferentes tiempos post-infección (Fig. 33). Estos resultados indican que las proteínas PipB, PipB2 y SseJ se empiezan a sintetizar entre 2 y 4 horas post-infección, siendo la proteína SsrA aparentemente esencial para su expresión. Trabajos anteriores han demostrado que la expresión de SPI-2 depende del sistema SsrAB durante la infección por Salmonella en otros tipos celulares (Feng et al., 2003; Garmendia et al., 2003; Miao et al., 2002; Walthers et al., 2007). De igual forma, observamos la expresión de estas proteínas en el mutante phoP en medio PCN y en bacterias intracelulares, pero a partir de 4-8 horas postinfección, es decir con un ligero retraso en comparación a la estirpe silvestre (Fig. 33 y 35). Estos resultados indican que el sistema PhoP-PhoQ parece esencial para la producción de estas proteínas asociadas a SPI-2 durante los tiempos tempranos de la infección (2-4 horas), sin embargo, la síntesis de estas proteínas a partir de las 4-8 horas de infección parece no depender del sistema PhoP-PhoQ. Considerando los resultados obtenidos en el mutante phoP, nos interesamos en caracterizar el posible papel del sistema OmpR-EnvZ en el control de la expresión de SPI-2 en fibroblastos, ya que anteriormente se ha sugerido que este sistema está involucrado en la regulación de la expresión de los genes asociados con SPI-2 (Feng et al., 2003; Kim y Falkow, 2004; Lee et al., 2000). Nuestros resultados demostraron que en ausencia de OmpR se produce un descenso en los niveles de las proteínas SsrB, PipB, PipB2 y SseJ en bacterias cultivadas en medio PCN y en bacteria intracelular 24 horas post-infección (Fig. 34). Estos resultados indican que OmpR participa en la correcta expresión de estas proteínas en las bacterias en el interior de fibroblastos, coincidiendo con lo propuesto por trabajos anteriores (Feng et al., 2003; Feng et al., 2004; Garmendia et al., 2003; Kim y Falkow, 2004; Lee et al., 2000; Lober et al., 2006). Cuando analizamos la cinética de expresión de las proteínas SsrB y PipB en estirpes carentes de OmpR o PhoP, observamos que no sólo disminuye la cantidad de estas proteínas en las bacterias intracelulares, sino que nuevamente se aprecia un retraso en la expresión de las mismas en comparación a la estirpe silvestre, siendo más evidente en el doble mutante phoP ompR (Fig. 35). Este “retardo” en la expresión de proteínas asociadas a SPI-2

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Discusión

en el mutante ompR es similar al observado por Lee et al. durante la infección de macrófagos (Lee et al., 2000). A pesar que OmpR y PhoP modulan la expresión de genes asociados a SPI-2, el mecanismo de regulación podría diferir y en consecuencia, también los efectos de la carencia de estos reguladores en bacterias intracelulares. Mediante el cálculo del índice de proliferación intracelular, determinamos que los mutantes phoP, ssrA, ompR, phoP ssrA y phoP ompR tienen diferentes tasas de crecimiento en el interior de fibroblastos. Mientras que los mutantes ssrA y ompR mantienen un estado de ausencia de crecimiento similar al de la estirpe silvestre, los mutantes phoP ssrA y phoP ompR presentan un fenotipo de proliferación intermedio entre el de la estirpe silvestre y el mutante phoP. De estos resultados se infiere que el regulador PhoP está directamente ligado al control del crecimiento intracelular, mientras que OmpR no tendría efecto alguno, a pesar de la alteración en la expresión de los genes de SPI-2 en las estirpes que carecen de alguno de estos dos reguladores. El hecho de que en el mutante ssrA observemos un índice de proliferación intracelular similar al de la estirpe silvestre sugiere que este sensor no es necesario para la supervivencia de la bacteria en el interior del fibroblasto. No obstante, hemos comprobado que en ausencia de SsrA no hay detección de las proteínas PipB, PipB2 y SseJ en las bacterias intracelulares (Fig. 33). Estos resultados podrían indicar que durante la infección de fibroblastos, la activación de SPI-2 no sea esencial para la supervivencia de la bacteria. Sin embargo, la estirpe silvestre expresa SsrB, PipB, PipB2 y SseJ pocas horas después de infectar fibroblastos (Fig. 33 y 35), lo que indica que Salmonella está utilizando estas proteínas. Además, mutantes que carecen de la proteína SsaC, un componente del aparato de secreción de SPI-2, presentan un índice de proliferación menor que la estirpe silvestre, lo que indica que un SST3 no funcional causa un defecto en la viabilidad de la bacteria intracelular (Cano et al., 2001). Estos hechos señalan que durante la infección de fibroblastos, Salmonella activa la expresión de SPI-2 siendo necesaria la secreción de proteínas efectoras a través del SST3 para la supervivencia de la bacteria. Por lo tanto, podemos decir que posiblemente haya una expresión residual de SPI-2 en un mutante ssrA. La ausencia de detección de la producción de PipB, PipB2 y SseJ en este mutante puede deberse a una limitación en la sensibilidad del inmunoensayo. Es preciso señalar que únicamente hemos examinado la expresión de estas tres proteínas, por lo que desconocemos qué ocurre con las proteínas estructurales, chaperonas y el resto de proteínas efectoras de SPI-2. Otra posible explicación es que la expresión del SST3 de SPI-2 es independiente del sensor SsrA y sea mediada por la activación de SsrB directamente por otras proteínas reguladoras como OmpR y PhoP (Bijlsma y Groisman, 2005; Feng et al., 2003). De hecho se ha demostrado que SsrB activa la

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Discusión

transcripción de genes como ssaB, sseA, ssaG y ssaM en ausencia de SsrA (Walthers et al., 2007). La proteína OmpR es necesaria para la correcta expresión de las proteínas SsrB, PipB, PipB2 y SseJ en Salmonella en el interior de fibroblastos. Sin embargo, no podemos elaborar conclusiones con respecto al papel de la proteína sensora EnvZ en la fosforilación de OmpR dentro de la regulación de SPI-2. Se ha demostrado que EnvZ no es absolutamente necesaria para la inducción de los genes ompC y ompF (Sato et al., 2000). Además, en cuanto a la activación de SPI-2 dependiente de OmpR, algunos autores sugieren que EnvZ es necesaria (Feng et al., 2003; Kim y Falkow, 2004), mientras que otros descartan que sea esencial (Lober et al., 2006). Por lo tanto, son precisos estudios adicionales para clarificar el papel de EnvZ en la regulación de la expresión de SPI-2 dependiente de OmpR. Por otra parte, datos obtenidos en el laboratorio mostraron que durante la infección de fibroblastos NRK-49F por Salmonella, la estructura del antígeno O del LPS difiere. Mientras que en bacteria crecida en medio LB el patrón de cadenas del antígeno O sigue una distribución bimodal, en la estirpe silvestre intracelular es unimodal siendo las cadenas cortas las mayoritarias (Tesis Doctoral M. Martínez Moya, 1999). Se ha demostrado que la expresión del gen wzzB, que determina la longitud de la cadena del antígeno O (Raetz y Whitfield, 2002), está regulada por los sistema PhoP-PhoQ y PmrA-PmrB (Delgado et al., 2006). En nuestros datos de transcriptómica no observamos cambios significativos de expresión en los genes relacionados con las modificaciones del lípido A y el antígeno O en Salmonella intracelular. En vista de que estos resultados no han sido validados por técnicas alternativas, no podemos descartar que durante la infección de fibroblastos se produzcan modificaciones de la estructura del LPS de la bacteria mediante el sistema PhoP-PhoQ. Estos cambios pueden tener consecuencias biológicas en la respuesta y en el tipo de rutas de señalización en el fibroblasto infectado, pudiendo estar relacionadas con el control de la proliferación de Salmonella por parte de la célula hospedadora. Los resultados obtenidos sugieren un modelo del circuito de regulación de los genes asociados a SPI-2 durante la infección de fibroblastos por Salmonella (Fig. 38). Durante la fase temprana de la infección la correcta expresión de los genes asociados a SPI-2 depende al menos de OmpR y PhoP. En ausencia de uno u otro regulador, la bacteria es capaz de activar SPI-2, pero después de 4-8 horas de infección. En estas condiciones, la activación de SPI-2 podría estar mediada por la acción del sistema SsrAB. Habría también que considerar la posible participación de otras proteínas reguladoras de la expresión de SPI-2, como SlyA y Fis (Croinin et al., 2006; Kelly et al., 2004; Lim et al., 2006; Linehan et al., 2005; Navarre et al., 2005; Okada et al., 2007) (Fig. 38). Sin embargo, los experimentos de transcriptómica de

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Discusión

Salmonella intracelular no muestran un aumento en la expresión de los genes que codifican estas proteínas (Tabla A12). La ausencia de la proteína PhoP podría causar, entre otros efectos, un descontrol en la regulación de la expresión de los genes de SPI-2 en la primera fase de la infección, ocasionando el aumento de la producción de proteínas efectoras de SPI-2. Este desequilibrio en la cantidad, y quizás también, en el tipo de efectores que se producen conduciría a una modulación anormal de la SCV que podría ser perjudicial para el control del crecimiento de la bacteria. De hecho, datos obtenidos en nuestro laboratorio demuestran que el aumento de la expresión de proteínas efectoras de SPI-2 concretas, como SseJ, desde un plásmido, incrementa la tasa de crecimiento de la estirpe silvestre intracelular (Alonso y García-del Portillo, datos no publicados). En fibroblastos es posible que el sistema PhoPPhoQ regule la expresión de SPI-2 a través del sistema SsrAB, ya que se ha demostrado que PhoP es capaz de unirse a la región promotora del gen ssrB (Bijlsma y Groisman, 2005). Un factor determinante de la decisión de proliferar o no sería por tanto la regulación llevada a cabo únicamente por el sistema PhoP-PhoQ en respuesta a señales intracelulares específicas poco después de la internalización de la bacteria (Fig. 38).

Figura 38. Modelo propuesto para la regulación de SPI-2 durante la infección de fibroblastos por Salmonella. (1) Una vez que la estirpe silvestre se encuentra en el interior de fibroblastos, y transcurridas 1-2 horas, se activan los sistemas de dos componentes PhoP-PhoQ y EnvZ-OmpR. Estos reguladores son necesarios para la correcta expresión de SPI-2 a horas tempranas de la infección, a través del sistema SsrAB. Como resultado, se ensambla el SST3 y se secretan proteínas efectoras al citoplasma del fibroblasto, un proceso que se inicia a las 2-4 horas postinfección. Estas proteínas podrían estar involucradas en la manipulación del tráfico de vesículas de la célula hospedadora, asegurando el suministro de nutrientes y la evasión de actividades bactericidas. De esta manera se establece y mantiene un compartimiento especializado, la SCV, que permite la supervivencia de la bacteria. Después de 24 horas de infección, la expresión de los genes de SPI-2 podría estar regulada por la acción de PhoP-PhoQ y EnvZ-OmpR, además de por otras proteínas reguladoras como SlyA y Fis. La ausencia de las proteínas OmpR y PhoP causa un retraso en la activación de SPI-2. (2) La falta de OmpR, origina una disminución en los niveles de proteínas relacionadas con SPI-2 después de 8 y 24 horas de infección. (3) Por otro lado, la ausencia de PhoP, produce un descontrol en la activación de SPI2 que ocasiona un retraso en la expresión de SPI-2 y un aumento en la producción de efectores. Este desbalance conducirá eventualmente a la proliferación descontrolada de la bacteria intracelular.

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Discusión

1

2

3

ESTIRPE SILVESTRE

MUTANTE ompR

PhoP-PhoQ OmpR-EnvZ

SsrAB

SCV

MUTANTE phoP

PhoP-PhoQ

OmpR-EnvZ

1-2 h SCV

SsrAB

SCV

SsrAB

PhoP-PhoQ OmpR-EnvZ (?) SlyA Fis

2-4 h

SsrAB

SST3 PROTEÍNAS EFECTORAS

(?) PhoP-PhoQ (?) SlyA Fis SsrAB

OmpR-EnvZ (?) (?) SlyA Fis

4-8 h SsrAB

PROLIFERACIÓN INTRACELULAR

(?) PhoP-PhoQ OmpR-EnvZ (?) (?)SlyA Fis SsrAB

(?) PhoP-PhoQ (?) SlyA Fis SsrAB

OmpR-EnvZ (?)

24 h

(?) SlyA Fis SsrAB

SPI-2

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Discusión

Globalmente, los resultados obtenidos indican que en cuanto a la activación y expresión de SPI-2 en Salmonella en el interior de fibroblastos, los reguladores transcripcionales PhoP y OmpR tienen un papel fundamental en las fases tempranas de la infección, sin ser esenciales. Esta regulación influye en los niveles de producción de las proteínas asociadas a SPI-2 después de 24 horas de infección (Fig. 38). Es preciso destacar que estas conclusiones se basan en los niveles de expresión de las proteínas SsrB, PipB, PipB2 y SseJ solamente. De igual modo en estudios realizados en Salmonella durante la infección de macrófagos, los autores concluyen que después de 6 horas de infección la expresión de los genes srfH, srfJ y srfK, pertenecientes al regulón SsrB, está modulada por las proteínas PhoP y OmpR (Worley et al., 2000). En referencia al control de la proliferación de Salmonella en el interior de fibroblastos, parece ser competencia del sistema PhoP-PhoQ. Pueden existir funciones aún no descritas dentro del regulón PhoP que respondan a señales específicas del ambiente intracelular. Quizás, el estudio de los 78 genes que se inducen únicamente en la estirpe silvestre intracelular proporcione en un futuro próximo nuevas claves que permitan conocer en mayor medida cómo Salmonella controla el crecimiento en el interior de fibroblastos.

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CONCLUSIONES

Conclusiones

Las conclusiones del trabajo presentado en esta Tesis Doctoral se resumen a continuación:

Primera. La infección in vitro de fibroblastos por Salmonella enterica serovar Typhimurium genera el aumento generalizado de la expresión de genes relacionados con la respuesta inmune innata de la célula hospedadora. Esta respuesta a nivel de transcripción es similar en fibroblastos infectados con la estirpe silvestre y el mutante phoP. Segunda. El análisis de transcriptómica de S. enterica serovar Typhimurium ha revelado un grupo de 138 genes que cambian sus niveles de expresión únicamente en la bacteria silvestre en el interior de fibroblastos después de 24 horas de infección. Aproximadamente el 48% de estos genes son de función desconocida. Tercera. Los datos de transcriptómica indican que tras la infección de fibroblastos, S. enterica serovar Typhimurium reprime genes relacionados con el flagelo y la quimiotaxis independientemente de la tasa de crecimiento intracelular. Cuarta. Los datos de expresión génica de S. enterica serovar Typhimurium intracelular son consistentes con un ambiente intravacuolar de hipoxia y escasos niveles de magnesio, fosfato, hierro y manganeso. Asimismo, ácidos grasos y acetato pueden ser utilizados como fuente de carbono. Quinta. Después de la internalización en el fibroblasto, el sistema de secreción de tipo 3 codificado en la isla de patogenicidad 1 de Salmonella sigue activo tras 4 horas de infección. Sexta. El sistema de dos componentes PhoP-PhoQ se activa aproximadamente 2 horas después de la entrada de la bacteria en el fibroblasto. Las señales de activación de este sistema podrían ser la presencia de péptidos antimicrobianos y la baja concentración de magnesio en el ambiente intravacuolar del fibroblasto. Séptima. Las proteínas PipB y PipB2 muestran un patrón de localización subcelular en fibroblastos infectados con S. enterica serovar Typhimurium que difiere a lo descrito en otros tipos celulares como macrófagos y células epiteliales. Octava. Los reguladores transcripcionales PhoP y OmpR son responsables de la correcta expresión de los genes asociados con la isla de patogenicidad 2 de Salmonella durante las primeras horas de la infección en fibroblastos.

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182

ANEXO I Tabla de estirpes, plásmidos y oligonucleótidos

Anexo I

Tabla A1. Estirpes de Salmonella enterica serovar Typhimurium usadas en este trabajo Todas las estirpes son derivados isogénicos de la estirpe SL1344 con excepción de 14028s, SV5015 y MD1120. Estirpe

Genotipo

Referencia

SL1344

hisG46, rpsL, estirpe silvestre

14028s

estirpe silvestre

SV5015

SL1344 His+

J. Casadesús

MD1120

SV5015 phoP7953::Tn10

Este trabajo

MD1126

phoP7953::Tn10 ΔpipB

Este trabajo

MD1127

phoP7953::Tn10 ΔpipB2

Este trabajo

MD1128

phoP7953::Tn10 ΔpipBΔpipB2

Este trabajo

MD1149

pipB::3xFLAG

Este trabajo

MD1150

pipB2::HA

Este trabajo

MD1152

sseJ::3xFLAG

Este trabajo

MD1173

pipB::3xFLAG phoP7953::Tn10

Este trabajo

MD1174

pipB2::HA phoP7953::Tn10

Este trabajo

MD1177

ssrB::3xFLAG

Este trabajo

MD1178

pagC::3xFLAG

Este trabajo

MD1180

sopB::3xFLAG

Este trabajo

MD1181

sseJ::3xFLAG phoP7953::Tn10

Este trabajo

MD1182

pagC::3xFLAG phoP7953::Tn10

Este trabajo

MD1184

ssrB::3xFLAG phoP7953::Tn10

Este trabajo

MD1185

sopB::3xFLAG phoP7953::Tn10

Este trabajo

MD1186

pipB::3xFLAG ssrA5799::MudJ

Este trabajo

MD1187

pipB2::HA ssrA5799::MudJ

Este trabajo

MD1189

sseJ::3xFLAG ssrA5799::MudJ

Este trabajo

MD1190

pagC::3xFLAG ssrA5799::MudJ

Este trabajo

(Hoiseth y Stocker, 1981) (Fields et al., 1986)

185

Anexo I

MD1193

sopB::3xFLAG ssrA5799::MudJ

Este trabajo

MD1194

pipB::3xFLAG phoP7953::Tn10 ssrA5799::MudJ

Este trabajo

MD1195

pipB2::HA phoP7953::Tn10 ssrA5799::MudJ

Este trabajo

MD1197

sseJ::3xFLAG phoP7953::Tn10 ssrA5799::MudJ

Este trabajo

MD1198

pagC::3xFLAG phoP7953::Tn10 ssrA5799::MudJ

Este trabajo

MD1923

sopB::3xFLAG phoP7953::Tn10 ssrA5799::MudJ

Este trabajo

MD1929

mgtA::3xFLAG

Este trabajo

MD1930

mgtB::3xFLAG

Este trabajo

MD1931

mgtA::3xFLAG phoP7953::Tn10

Este trabajo

MD1932

mgtA::3xFLAG ssrA5799::MudJ

Este trabajo

MD1933

mgtB::3xFLAG phoP7953::Tn10

Este trabajo

MD1934

mgtB::3xFLAG ssrA5799::MudJ

Este trabajo

MD1935

mgtA::3xFLAG phoP7953::Tn10 ssrA5799::MudJ

Este trabajo

MD1936

mgtB::3xFLAG phoP7953::Tn10 ssrA5799::MudJ

Este trabajo

MD1937

pipB::3xFLAG ompR1009::Tn10

Este trabajo

MD1938

pipB2::HA ompR1009::Tn10

Este trabajo

MD1939

sseJ::3xFLAG ompR1009::Tn10

Este trabajo

MD1940

ssrB::3xFLAG ompR1009::Tn10

Este trabajo

MD1942

mgtC::3xFLAG

Este trabajo

MD1943

pipB::3xFLAG phoP5170::MudJ

Este trabajo

MD1944

pipB2::HA phoP5170::MudJ

Este trabajo

MD1945

sseJ::3xFLAG phoP5170::MudJ

Este trabajo

MD1946

ssrB::3xFLAG phoP5170::MudJ

Este trabajo

MD1947

pipB::3xFLAG phoP5170::MudJ ompR1009::Tn10

Este trabajo

MD1948

pipB2::HA phoP5170::MudJ ompR1009::Tn10

Este trabajo

MD1949

sseJ::3xFLAG phoP5170::MudJ ompR1009::Tn10

Este trabajo

MD1950

ssrB::3xFLAG phoP5170::MudJ ompR1009::Tn10

Este trabajo

186

Anexo I

MD1951

mgtC::3xFLAG phoP7953::Tn10

Este trabajo

MD1952

mgtC::3xFLAG ssrA5799::MudJ

Este trabajo

MD1953

mgtC::3xFLAG phoP7953::Tn10 ssrA5799::MudJ

Este trabajo

MD1954

ΔpipB

MD1955

ΔpipB2

MD1956

ΔpipBΔpipB2

SV4056

phoP7953::Tn10

SV4235

ompR1009::Tn10

SV4236

ompR1009::Tn10 phoP5170::MudJ

SV4237

ssrA5799::MudJ

SV4241

ssrA5799::MudJ phoP7953::Tn10

EG5170

phoP5170::MudJ

(Knodler et al., 2002) (Knodler et al., 2003) (Knodler et al., 2003) (Garcia-Del Portillo et al., 1999) (Cano et al., 2001) (Cano et al., 2001) (Cano et al., 2001) (Cano et al., 2001) E. A. Groisman

Tabla A2. Plásmidos utilizados Plásmido pKD46 pCP20 pSU315 pSUB11

Referencia γ, β, exo, Amp +

R

R

(Datsenko y Wanner, 2000) R

FLP , Amp , Cm

(Cherepanov y Wackernagel, 1995)

R

secuencia HA, Kn

secuencia 3xFLAG, Kn

(Uzzau et al., 2001) R

(Uzzau et al., 2001)

Tabla A3. Oligonucleótidos utilizados en los análisis de PCR cuantitativa Nombre

Secuencia (5’→3’)

CAP1-D

TGGCTCTGGCTGCGAAAC

CAP1-R

GGCGGCATCATTCATCTCTT

ILK-D

GCAGGGACTTCAATGAGGAATG

ILK-R

CGGAAGCACGTTAGGATGAGA

187

Anexo I

Ret3-D

TGTGCGGTGCATGATCTGAT

Ret3-R

TGCCAAAGACAAACCCAGTCT

RPS2-D

CAAGGAGTGGATCCCCGTTA

RPS2-R

CCTCCAAGGACTTGATCTTCATG

Tm3-D

AGGAAGCAAAGCACATTGCA

Tm3-R

CAACTTACGAGCCACCTCTTCA

CCL20-D

AGCTTGTGACATTAATGCTATCAT

CCL20-R

TATGATGCAATATGAATCAACTTC

CINC1-D

AGAACATCCAGAGTTTGAAGGTGAT

CINC1-R

GTGGCTATGACTTCGGTTTGG

CINC2β-D

TCCAGCTGAGCTGGGAAAAG

CINC2β-R

GATCGCTGCTCTGCTTCTGA

CINC3-D

CTGCGCCCAGACAGAAGTC

CINC3-R

GGGCTTCAGGGTTGAGACAA

ICAM1-D

GACCACGGAGCCAATTTCTC

ICAM1-R

CGTGGGCTTCACACTTCAC

RIP2-D

CCAGCTCGTGCTCCTTGACT

RIP2-R

TTGTGGGCGCTCTGAAACTT

MMP3-D

TCCCCACAGACATCCATAGCTT

MMP3-R

AACGGCAGCGTCAATGTGT

βACTINA- D

TTCAACACCCCAGCCATGT

βACTINA-R

GTGGTACGACCAGAGGCATACA

OMPA-D

TGTAAGCGTCAGAACCGATACG

OMPA-R

GAGCAACCTGGATCCGAAAG

MGTA-D

GACTCTCTGGCGCGTTTTTG

MGTA-R

TCACCTCGGCAGCGTTTAA

MGTB-D

TTGCGCCGCGACATC

MGTB-R

GCCCATGATTGTCAGTTCCAA

MGTC-D

TGTTGGGCGCGCTGAT

MGTC-R

GCGTAATCCCGCCATACGT

PAGC-D

ACAGGCTTCCGGGTCTGTT

PAGC-R

GTACTTCACCTCAAACTTGTCATGGT

PIPB-D

ATGTCAACGGGTGTACTATATGTCTGT

PIPB-R

TGACCATGGGATCCGTATTTTC

PIPB2-D

TCCGCTTGCCTCTTTTGAAA

PIPB2-R

GGGAGAGAAAATTCGCATCTGA

188

Anexo I

SOPB-D

GGCAAAGAGGGAACGATGGT

SOPB-R

CCGGCTGGGTCAACGAT

SSRB-D

GGGAAGCTATCCTGGCTGAAT

SSRB-R

GCGCAAAGTAAGCAGTTGATGA

  Tabla A4. Oligonucleótidos utilizados para el etiquetado de genes cromosómicos  Nombre pipBFlag-1 pipBFlag-2 pipB2HA-1 pipB2HA-2 sseJFlag-1 sseJFlag-2 sopBFlag-1 sopBFlag-2 mgtAFlag-1 mgtAFlag-2 mgtBFlag-1 mgtBFlag-2 mgtCFlag-1 mgtCFlag-2 pagCFlag-1 pagCFlag-2

Secuencia (5’→3’) GATTACAATGATAGAACTCTTTTCCCCCATCCG ATATTTGACTACAAAGACCATGACGG TTTAATAAAACAAGGGGGCCTCTGTTTGAATAC TTCTTGTCATATGAATATCCTCCTTAG ACAAACACTCTTTAACGAATTTTATAGTGAAAA TATT TATCCGTATGATGTTCCTGAT TATTCAGTAGCAGATTGTTATTCTTACATTGCTT TTATTTCATATGAATATCCTCCTTAG AATGTTAGAAAGTTTTATAGCTCATCATTATTC CACTGAAGACTACAAAGACCATGACGG CCACCGGCACTATGATATTGAGCTGTGTTTTGC TCAAGGCCATATGAATATCCTCCTTAG TTGGCAGTCAGTAAAAGGCATTTCTTCATTAAT CACATCTGACTACAAAGACCATGACGG TAAACGATTTAATAGACTTTCCATATAGTTACC TCAAGACCATATGAATATCCTCCTTAG GTTGGTGAAAGGGTTTTACAGCAGACGTTATGG CTGGCAGGACTACAAAGACCATGACGG TCGGGGATTAAGCACGCTGGCGAATCCCCGAC GAAAGTGTCATATGAATATCCTCCTTAG CATGAAGCGCTTTTATATCAAACGCTTTGGCCA GTGGTTTGACTACAAAGACCATGACGG TATCGGGTGAGCGATTCATCTGGGCGATCCTCA AACATTACATATGAATATCCTCCTTAG CGATAATATCACCGCAATTCACTGGAGCATTGA TAGTCAAGACTACAAAGACCATGACGG TTATACGCCTGGCGTAATGTTGCAATTGAATAA AAAACTACATATGAATATCCTCCTTAG AAAAATAAACGGCTTCAACGTCGGGGTTGGAT ACCGTTTCGACTACAAAGACCATGACGG GGCGGTGCGGAAGGCGAACCTTCCGCATAGCT TATGCTTTCATATGAATATCCTCCTTAG

Plásmido molde pSUB11 3xFLAG, KnR pSU315 HA, KnR pSUB11 3xFLAG, KnR pSUB11 3xFLAG, KnR pSUB11 3xFLAG, KnR pSUB11 3xFLAG, KnR pSUB11 3xFLAG, KnR pSUB11 3xFLAG, KnR

BIBLIOGRAFÍA Cano, D.A., Martínez-Moya, M., Pucciarelli, M.G., Groisman, E.A., Casadesús, J., García-Del Portillo, F. (2001) Salmonella enterica serovar Typhimurium response involved in attenuation of pathogen intracellular proliferation. Infect Immun 69: 6463-6474. Cherepanov, P.P. y Wackernagel, W. (1995) Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158: 9-14.

189

Anexo I

Datsenko, K.A. y Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 6640-6645. Fields, P.I., Swanson, R.V., Haidaris, C.G., Heffron, F. (1986) Mutants of Salmonella typhimurium that cannot survive within the macrophage are avirulent. Proc Natl Acad Sci U S A 83: 5189-5193. García-Del Portillo, F., Pucciarelli, M.G., Casadesús, J. (1999) DNA adenine methylase mutants of Salmonella typhimurium show defects in protein secretion, cell invasion, and M cell cytotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 11578-11583. Hoiseth, S.K. y Stocker, B.A. (1981) Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines. Nature 291: 238-239. Knodler, L.A., Celli, J., Hardt, W.D., Vallance, B.A., Yip, C., Finlay, B.B. (2002) Salmonella effectors within a single pathogenicity island are differentially expressed and translocated by separate type III secretion systems. Mol Microbiol 43: 1089-1103. Knodler, L.A., Vallance, B.A., Hensel, M., Jackel, D., Finlay, B.B., Steele-Mortimer, O. (2003) Salmonella type III effectors PipB and PipB2 are targeted to detergent-resistant microdomains on internal host cell membranes. Mol Microbiol 49: 685-704. Uzzau, S., Figueroa-Bossi, N., Rubino, S., Bossi, L. (2001) Epitope tagging of chromosomal genes in Salmonella. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 15264-15269.

190

ANEXO II Datos obtenidos en los análisis de transcriptómica

Anexo II

A continuación se presentan diferentes tablas que contienen parte de los datos obtenidos en los análisis de transcriptómica realizados en esta Tesis doctoral. En las tablas donde se presentan los valores de expresión de genes de S. enterica (A6A11) las condiciones experimentales A, B y C corresponden a:

A: Estirpe silvestre intracelular 24 h p.i. relativo a bacterias cultivadas en medio LB en la fase exponencial de crecimiento

B: Mutante phoP intracelular 24 h p.i. relativo a bacterias cultivadas en medio LB en la fase exponencial de crecimiento

C: Estirpe silvestre cultivada en medio LB en la fase estacionaria relativo a bacterias cultivadas en medio LB en la fase exponencial de crecimiento En estas últimas tablas sólo se muestran los valores M. La información completa de cada gen se encuentra en los archivos incluidos en el CD adjunto.

193

Anexo II

Tabla A5. Genes diferencialmente expresados (M < -1,5 valor p < 0,05) en fibroblastos NRK49F infectados con la estirpe silvestre de Salmonella enterica serovar Typhimurium en relación a fibroblastos sin infectar (6 horas p.i.) Nombre del gen Descripción M valor p ENSRNOG00000000301

ENSRNOG00000000301

-1,52

0,00003

ENSRNOG00000000493

U1 small nuclear ribonucleoprotein 1C (predicted)

-1,64

0,00085

ENSRNOG00000000996

actin related protein 2/3 complex, subunit 1A

-1,58

0,00026

ENSRNOG00000001030

REGULATORY PROTEIN TSC-22

-1,66

0,00040

ENSRNOG00000001129

F-box only protein 21 (predicted)

-1,55

0,00100

ENSRNOG00000001339

26S PROTEASOME NON-ATPASE REGULATORY SUBUNIT 9

-1,55

0,00029

ENSRNOG00000001709

-1,51

0,00011

-1,83

0,00194

ENSRNOG00000001795

CLATHRIN COAT ASSEMBLY PROTEIN AP50 proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 2 (predicted) ENSRNOG00000001795

-1,76

0,00005

ENSRNOG00000002467

PHOSPHOGLYCERATE KINASE, TESTIS SPECIFIC

-1,89

0,00002

ENSRNOG00000002966

-2,42

0,00122

-1,91

0,00334

-1,50

0,00007

ENSRNOG00000003123

similar to gamma actin-like protein C-TERMINAL PDZ DOMAIN LIGAND OF NEURONAL NITRIC OXIDE SYNTHASE ATP-BINDING CASSETTE, SUB-FAMILY C (CFTR/MRP), MEMBER 1 replication protein A1 (predicted)

-1,57

0,01212

ENSRNOG00000003131

ENSRNOG00000003131

-1,61

0,00137

ENSRNOG00000003147

SEQUESTOSOME 1

-1,62

0,00002

ENSRNOG00000003163

succinate dehydrogenase complex, subunit C

-1,56

0,00112

ENSRNOG00000004002

PHOSPHOGLYCERATE MUTASE 1

-1,54

0,00003

ENSRNOG00000004012

similar to Elongation factor 1-alpha 1 (EF-1-alpha-1)

-2,76

0,00001

ENSRNOG00000004255

UPSTREAM TRANSCRIPTION FACTOR 1

-1,56

0,00008

ENSRNOG00000005290

14-3-3 PROTEIN EPSILON

-1,75

0,00598

ENSRNOG00000005355

-1,61

0,00772

-1,96

0,00045

-1,98

0,00007

-2,06

0,00009

ENSRNOG00000006683

NICASTRIN GROWTH ARREST AND DNA-DAMAGE-INDUCIBLE PROTEIN GADD45 ALPHA eukaryotic translation initiation factor 3 subunit 7 VOLTAGE-DEPENDENT ANION-SELECTIVE CHANNEL PROTEIN 1 UBIQUITIN-PROTEIN LIGASE NEDD-4

-1,52

0,00021

ENSRNOG00000006694

CAVEOLIN-1

-1,65

0,00501

ENSRNOG00000006756

MELANOMA-ASSOCIATED ANTIGEN D1

-1,59

0,01269

ENSRNOG00000006955

ENSRNOG00000006955

-1,50

0,00338

ENSRNOG00000007133

plexin B2 (predicted)

-1,74

0,00016

ENSRNOG00000007930

-2,60

0,00031

-1,67

0,00027

ENSRNOG00000008252

ribosomal protein S2 tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein Kazal type serine protease inhibitor 4

-2,24

0,00019

ENSRNOG00000008259

ENSRNOG00000008259

-1,94

0,00040

ENSRNOG00000008301

ENSRNOG00000008301

-1,72

0,00033

ENSRNOG00000008994

actin related protein 2/3 complex, subunit 4 (predicted)

-1,79

0,00124

ENSRNOG00000001719

ENSRNOG00000002985 ENSRNOG00000003074

ENSRNOG00000005615 ENSRNOG00000005804 ENSRNOG00000006375

ENSRNOG00000008195

195

Anexo II

ENSRNOG00000009222

Eph receptor A2 (predicted)

-1,95

0,00009

ENSRNOG00000009225

coatomer protein complex, subunit zeta 2 (predicted)

-1,57

0,00033

ENSRNOG00000009439

eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2

-1,69

0,00056

ENSRNOG00000009455

CYTOCHROME P450 2J3

-1,86

0,00013

ENSRNOG00000009484

ENSRNOG00000009484

-1,56

0,00029

ENSRNOG00000009563

ENSRNOG00000009563

-2,21

0,00024

ENSRNOG00000009751

glutathione peroxidase 7 (predicted)

-1,73

0,00017

ENSRNOG00000009779

KERATIN, TYPE II CYTOSKELETAL 8

-1,97

0,00007

ENSRNOG00000010184

ENSRNOG00000010184

-1,90

0,00008

ENSRNOG00000010195

actin, gamma, cytoplasmic (predicted)

-1,50

0,00222

ENSRNOG00000010237

similar to CDNA sequence BC019977 (predicted)

-1,58

0,00006

ENSRNOG00000011572

KINESIN LIGHT CHAIN 1

-1,54

0,00520

ENSRNOG00000011796

complement component 1, r subcomponent (predicted)

-1,58

0,00016

ENSRNOG00000012026

26S PROTEASE REGULATORY SUBUNIT 7

-1,57

0,00048

ENSRNOG00000012247

RAS-RELATED PROTEIN RAB-7

-1,54

0,00016

ENSRNOG00000012913

TRANSLATION INITIATION FACTOR 4A

-1,73

0,00004

ENSRNOG00000013492

ADENYLYL CYCLASE-ASSOCIATED PROTEIN 1

-1,76

0,00015

ENSRNOG00000013502

-1,53

0,00007

-2,05

0,00001

ENSRNOG00000014133

ENSRNOG00000013502 proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 13 (predicted) ENSRNOG00000014133

-1,83

0,00002

ENSRNOG00000014140

ENSRNOG00000014140

-1,64

0,00001

ENSRNOG00000014179

40S RIBOSOMAL PROTEIN S2

-2,72

0,00008

ENSRNOG00000014193

DNA LIGASE I

-2,39

0,00010

ENSRNOG00000014577

ADP-RIBOSYLATION FACTOR 1

-1,67

0,01019

ENSRNOG00000015277

small EDRK-rich factor 2 (predicted)

-1,93

0,00190

ENSRNOG00000015283

ENSRNOG00000015283

-1,72

0,00027

ENSRNOG00000015409

ubiquitin specific protease 5 (isopeptidase T) (predicted)

-1,81

0,00007

ENSRNOG00000015496

TROPOMYOSIN ALPHA 4 CHAIN

-1,60

0,00517

ENSRNOG00000015857

protective protein for beta-galactosidase (predicted)

-1,88

0,00004

ENSRNOG00000015865

CLATHRIN COAT ASSEMBLY PROTEIN AP17

-1,56

0,00002

ENSRNOG00000015941

FK506 binding protein 10 (predicted)

-2,18

0,00031

ENSRNOG00000016019

-1,63

0,00019

-1,97

0,00002

ENSRNOG00000016478

NA,K-ATPASE ALPHA-1 SUBUNIT serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade B, member 6b (predicted) eukaryotic translation initiation factor 5A (predicted)

-1,79

0,00001

ENSRNOG00000016664

ENSRNOG00000016664

-1,63

0,00052

ENSRNOG00000016831

47 KDA HEAT SHOCK PROTEIN PRECURSOR

-1,71

0,00015

ENSRNOG00000017042

LIPOPROTEIN-BINDING PROTEIN

-2,26

0,00000

ENSRNOG00000017073

carbonic anhydrase 9 (predicted)

-1,63

0,00025

ENSRNOG00000017284

similar to Protein CGI-117 (Protein HSPC111) (predicted)

-1,71

0,00065

ENSRNOG00000017352

Dullard homolog (Xenopus laevis) (predicted)

-1,56

0,00002

ENSRNOG00000017441

Tropomyosin alpha-3 chain

-2,10

0,00011

ENSRNOG00000017510

LACTADHERIN PRECURSOR

-1,74

0,00005

ENSRNOG00000017586

similar to U1 snRNP-specific protein C

-1,53

0,00013

ENSRNOG00000014109

ENSRNOG00000016420

196

Anexo II

ENSRNOG00000017708

ENSRNOG00000017708

-1,62

0,00018

ENSRNOG00000017758

similar to NICE-3

-1,85

0,00002

ENSRNOG00000018255

cleft lip and palate associated transmembrane protein 1 (predicted)

-1,58

0,00056

ENSRNOG00000018993

INTEGRIN-LINKED KINASE

-1,68

0,00063

ENSRNOG00000019250

ENSRNOG00000019250

-1,69

0,00824

ENSRNOG00000019312

ENSRNOG00000019312

-2,00

0,00007

ENSRNOG00000019318

SYNAPTOTAGMIN III (SYTIII)

-2,20

0,00001

ENSRNOG00000019392

ENSRNOG00000019392

-1,51

0,02005

ENSRNOG00000020192

ENSRNOG00000020192

-1,95

0,00023

ENSRNOG00000020205

AGRIN PRECURSOR

-1,80

0,00003

ENSRNOG00000020206

CATHEPSIN D PRECURSOR

-1,75

0,00022

ENSRNOG00000020266

ELONGATION FACTOR-2

-1,69

0,00008

ENSRNOG00000020287

-1,75

0,00005

-1,52

0,00251

ENSRNOG00000020658

SYNAPTOTAGMIN XV proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 8 (predicted) ENSRNOG00000020658

-1,57

0,00039

ENSRNOG00000020660

COFILIN, NON-MUSCLE ISOFORM

-1,67

0,00069

ENSRNOG00000020788

similar to tangerin

-1,58

0,00073

ENSRNOG00000020843

FERRITIN LIGHT CHAIN

-1,69

0,00017

ENSRNOG00000020844

ENSRNOG00000020844

-2,38

0,00000

ENSRNOG00000020849

hematopoietic cell signal transducer

-1,53

0,00171

ENSRNOG00000020918

G1/S-SPECIFIC CYCLIN D1

-1,75

0,00001

ENSRNOG00000020937

NUCLEOLAR TRANSCRIPTION FACTOR 1

-1,73

0,00001

ENSRNOG00000021164

STRESS-INDUCED-PHOSPHOPROTEIN 1

-1,57

0,00049

ENSRNOG00000021202

RETICULON 3

-1,52

0,00005

ENSRNOG00000021697

ENSRNOG00000021697

-1,71

0,00004

ENSRNOG00000022638

ENSRNOG00000022638

-1,83

0,00005

ENSRNOG00000022927

similar to Ab2-162

-2,01

0,00158

ENSRNOG00000022932

similar to serine hydolase like protein, isoforms Serhl-2

-1,78

0,00177

ENSRNOG00000023001

ENSRNOG00000023001

-1,85

0,00001

ENSRNOG00000023125

ENSRNOG00000023125

-1,84

0,00036

ENSRNOG00000023168

ENSRNOG00000023168

-2,00

0,00046

ENSRNOG00000023177

similar to RIKEN cDNA 9530027K23 (predicted)

-2,02

0,00187

ENSRNOG00000023308

FERRITIN LIGHT CHAIN

-2,26

0,00410

ENSRNOG00000023547

similar to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

-1,86

0,00002

ENSRNOG00000024081

PYRUVATE KINASE, M2 ISOZYME

-1,77

0,00019

ENSRNOG00000024179

ENSRNOG00000024179

-3,22

0,00013

ENSRNOG00000024183

coagulation factor VIII

-2,71

0,00000

ENSRNOG00000024193

ENSRNOG00000024193

-2,75

0,00000

ENSRNOG00000024388

ENSRNOG00000024388

-1,79

0,00016

ENSRNOG00000024447

ENSRNOG00000024447

-1,58

0,00190

ENSRNOG00000024550

ENSRNOG00000024550

-1,66

0,00213

ENSRNOG00000024569

GTPase, IMAP family member

-1,50

0,00077

ENSRNOG00000024816

ENSRNOG00000024816

-1,88

0,00002

ENSRNOG00000020576

197

Anexo II

ENSRNOG00000024822

ceroid-lipofuscinosis, neuronal 6 (predicted)

-1,57

0,00005

ENSRNOG00000024872

-1,83

0,00035

-1,53

0,00160

ENSRNOG00000025020

ENSRNOG00000024872 PROCOLLAGEN C-PROTEINASE ENHANCER PROTEIN PRECURSOR ENSRNOG00000025020

-2,00

0,00056

ENSRNOG00000025053

low density lipoprotein receptor-related protein 1 (predicted)

-1,56

0,00024

ENSRNOG00000025066

ENSRNOG00000025066

-1,56

0,01824

ENSRNOG00000025114

CCAAT/ENHANCER BINDING PROTEIN BETA

-1,51

0,00046

ENSRNOG00000025188

BRAIN ACID SOLUBLE PROTEIN 1

-1,80

0,00042

ENSRNOG00000025592

sarcoma amplified sequence (predicted)

-1,58

0,00015

ENSRNOG00000025686

ENSRNOG00000025686

-1,53

0,00153

ENSRNOG00000026144

RIBOSOMAL PROTEIN S2

-2,70

0,00020

ENSRNOG00000026152

ENSRNOG00000026152

-2,50

0,00002

ENSRNOG00000026300

ENSRNOG00000026300

-1,50

0,00003

ENSRNOG00000026410

similar to Alpha enolase

-1,70

0,03047

ENSRNOG00000026788

ENSRNOG00000026788

-1,92

0,00015

ENSRNOG00000026790

similar to karyopherin (importin) alpha 2

-1,68

0,00611

ENSRNOG00000026812

PROTEIN DISULFIDE ISOMERASE A6 PRECURSOR

-2,65

0,00001

ENSRNOG00000026928

similar to Phosphoglycerate kinase, testis specific

-2,07

0,00014

ENSRNOG00000027116

ENSRNOG00000027116

-1,93

0,00014

ENSRNOG00000027135

ENSRNOG00000027135

-1,52

0,00151

ENSRNOG00000027137

-1,85

0,00652

-2,50

0,00009

ENSRNOG00000027546

ENSRNOG00000027137 ubiquitin-conjugating enzyme E2M (UBC12 homolog, yeast) (predicted) ENSRNOG00000027546

-2,12

0,00004

ENSRNOG00000027662

similar to 40S ribosomal protein S2

-2,75

0,00019

ENSRNOG00000027829

-1,53

0,01591

-1,72

0,00017

ENSRNOG00000028474

ENSRNOG00000027829 proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3 (predicted) ENSRNOG00000028474

-1,79

0,00642

ENSRNOG00000028564

ENSRNOG00000028564

-1,85

0,00005

ENSRNOG00000025001

ENSRNOG00000027514

ENSRNOG00000028103

ENSRNOG00000028592 -1,57 0,00314 Los nombres de los genes tomados de la base de datos del genoma de Rattus norvegicus (www.ensembl.org). ENSRNOG00000028592

 

198

Anexo II

Tabla A6. Genes diferencialmente expresados en la estirpe silvestre de Salmonella enterica serovar Typhimurium en el interior de fibroblastos (24 horas p.i.) y en medio LB en la fase estacionaria de crecimiento Nombre del gen Genes inducidos M > 2 valor p < 0,1 STM0294,1N STM0295 STM0763,s STM0908 STM1006 STM1049 STM1240 STM1251 STM1284 STM1313 STM1329 STM1510 STM1535 STM1568 STM1577 STM1690 STM1731 STM1786 STM1868 STM1869 STM1883 STM2138 STM2160 STM2393 STM2475 STM2611,S STM2861 STM2893 STM2903 STM2943 STM3052 STM3083 STM3133 STM3289 STM2990 STM3774 STM4014 STM4418 PSLT037 PSLT047 PSLT073 PSLT101 PSLT107 CNB1344-0014 CNB1344-0163 CNB1344-0219 CNB1344-0247 CNB1344-0249 CNB1344-0259 CNB1344-0268

STM0294,1N STM0295 STM0763,s STM0908 STM1006 STM1049 envF STM1251 yeaH celB STM1329 ydfH STM1535 fdnI narZ pspA STM1731 STM1786 mig-3 STM1869 purT STM2138 yehV yfdC STM2475 STM2611,S sitA invI STM2903 STM2943 STM3052 STM3083 STM3133 metY metW STM3774 STM4014 STM4418 spvD PSLT047 traM traG PSLT107 S4402A_sRNA S5176A_ORF S4649A_ORF S4452A_ORF S4414A_ORF S0111A_ORF S0102A_ORF

CNB1344-0284 CNB1344-0346 CNB1344-0359 CNB1344-0360 CNB1344-0395 CNB1344-0397 CNB1344-0423 CNB1344-0452 CNB1344-0489 CNB1344-0528 CNB1344-0581 CNB1344-0614 CNB1344-0724 CNB1344-0745 CNB1344-0787

S0088A_ORF S0029A_ORF S0017A_ORF S0016A_ORF S3971A_ORF S3963A_ORF S3718A_ORF S3442A_ORF S2978A_ORF S2893A_ORF S2136A_ORF S2540A_ORF S1623A_ORF S1447A_ORF S1107A_ORF

Genes reprimidos M < -2 valor p < 0,1 STM0043 STM0124 STM0152 STM0153 STM0154 STM0166 STM0224 STM0225 STM0226 STM0230 STM0231 STM0406 STM0485 STM0486 STM0647 STM0678 STM0695 STM0737 STM0749 STM0957 STM1000 STM1170 STM1174 STM1175 STM1177 STM1181 STM1183 STM1190 STM1193 STM1195 STM1197 STM1334,c STM1377 STM1572

199

rpsT murF aceE aceF lpdA speE yaeT hlpA lpxD rnhB dnaE yajC ybaB recR rlpB leuW ybfE sucB pal cydD asnS mviN flgB flgC flgE flgI flgK yceD fabH fabG fabF infC lpp nmpC

Anexo II

STM1774 STM1777 STM1779 STM1846 STM1905 STM1916 STM1917 STM1921 STM1922 STM1958 STM1959 STM1961 STM1962 STM1969 STM1970 STM1971 STM1974 STM1975 STM1976 STM1977 STM1978 STM2082 STM2087 STM2090 STM2094 STM2206 STM2267 STM2317 STM2318 STM2319 STM2322 STM2323,S STM2324 STM2325 STM2326 STM2327 STM2328 STM2337 STM2370 STM2489 STM2520 STM2525 STM2537 STM2673 STM2770 STM2771 STM2822 STM2823 STM2824 STM2927

sirC hemA ipk proQ yecO cheY cheB cheA motB fliB fliC fliS fliT fliF fliG fliH fliK fliL fliM fliN fliO rfbP rfbV rfbH rfbC fruF ompC nuoM nuoL nuoK nuoH nuoG nuoF nuoE nuoC nuoB nuoA ackA pdxB dapA yfgL yfgB yfhJ rplS fljA fljB STM2822 STM2823 STM2824 surE

STM2970 STM3087 STM3093 STM3209 STM3283 STM3346 STM3384 STM3385 STM3414 STM3417 STM3420 STM3422 STM3426 STM3428 STM3429 STM3429 STM3430 STM3430 STM3431 STM3482 STM3486 STM3487 STM3656 STM3702 STM3709 STM3718 STM3723 STM3727 STM3728 STM3742 STM3836 STM3867 STM3868 STM3869 STM3870 STM3871 STM3872 STM3914 STM3923 STM4144 STM4146 STM4148 STM4149 STM4150 STM4151 STM4153 STM4170 STM4334 STM4388 STM4391

200

sdaC yqgB endA rpsU rpsO yhcM yhdG fis rplQ rpsK secY rpmD rpsH rplE rplX rplX rplN rplN rpsQ gph aroB aroK glyQ grxC kbl rfaI rfaQ rpmG rpmB spoT recF atpA atpH atpF atpE atpB atpI rhlB rffH glyT tuf nusG rplK rplA rplJ rpoB hupA efp sgaE rpsF

Anexo II

STM4393 rpsR STM4394 rplI STM4477 pepA STM4493 STM4493 STM4498 STM4498 CNB1344-0021 S3804A_sRNA CNB1344-0037 S1572A_sRNA CNB1344-0043 S0751A_ORF CNB1344-0047 S0287A_ORF CNB1344-0051 S0336A_ORF CNB1344-0090 S0266A_ORF CNB1344-0094 S0268A_ORF CNB1344-0096 S0260A_ORF CNB1344-0097 S0259A_ORF CNB1344-0215 S4684A_ORF CNB1344-0216 S4683A_ORF CNB1344-0392 S3991A_ORF CNB1344-0408 S3872A_ORF CNB1344-0444 S3597A_ORF CNB1344-0541 S2852A_ORF CNB1344-0598 S2634A_ORF CNB1344-0615 S2531A_ORF CNB1344-0623 S2459A_ORF CNB1344-0705 S1701A_ORF CNB1344-0706 S1696A_ORF Los nombres de los genes tomados de la base de datos del genoma de la estirpe LT2 (McClelland et al., 2001).

 

201

Anexo II

Tabla A7. Niveles de expresión de genes de Salmonella enterica serovar Typhimurium relacionados con el metabolismo del carbono A B C A B C Nombre del gen M M M Nombre del gen M M M STM4078 yneB -0,38 0,99 -0,61 Glicólisis STM1290 STM1290 STM1326 STM1326 STM1378 STM1378 STM1888 STM1888 STM2141 STM2141 STM2403 STM2403 STM2952 STM2952 STM3068 STM3068 STM3069 STM3069 STM3704 STM3704 STM3780 STM3780 STM4022 STM4022 STM4062 STM4062 STM4078 STM4078 STM4081 STM4081 STM4221 STM4221 STM4585 STM4585

gapA gapA pfkB pfkB pykF pykF pykA pykA fbaB fbaB glk glk eno eno fba fba pgk pgk pmgI pmgI STM3780 STM3780 yihT yihT pfkA pfkA yneB yneB tpiA tpiA pgi pgi gpmB gpmB

-0,48 -1,99 -0,06 -0,37 -2,48 -3,38 -0,76 -0,96 0,41 2,24 -0,82 -1,04 -0,16 -1,08 -1,63 -2,34 -2,01 -4,20 -0,13 -0,62 0,14 1,56 -0,83 0,17 0,28 -0,87 -0,38 0,34 -1,98 -3,12 -3,54 -4,34 -1,73 -1,71

-0,99 -0,57 2,05 2,76 -0,83 -0,47 -0,77 -0,49 4,05 3,48 -0,17 -0,28 -1,08 -0,82 -0,14 -0,45 -1,42 -1,10 -1,51 -1,59 0,16 0,06 0,19 -0,71 0,56 0,09 0,99 0,81 0,07 0,61 -0,43 -0,12 -0,67 -0,87

-0,63 0,24 0,46 -0,58 0,58 -0,55 -2,05 -2,38 -0,13 -0,62 -2,01 -4,20

-0,40 -0,23 0,38 -0,92 1,29 1,12 -1,08 -0,58 -1,51 -1,59 -1,42 -1,10

Gluconeogénesis STM2472 STM2472 STM3500 STM3500 STM1349 STM1349 STM4415 STM4415 STM3704 STM3704 STM3069 STM3069

maeB maeB pckA pckA pps pps fbp fbp pmgI pmgI pgk pgk

-1,60 STM4078 yneB 0,34 -1,69 STM4022 yihT -0,83 2,69 STM4022 yihT 0,17 2,92 STM3780 STM3780 0,14 -1,50 STM3780 STM3780 1,56 -0,98 STM3068 fba -2,34 -1,33 STM3068 fba -1,63 -0,42 STM2952 eno -0,16 3,74 STM2952 eno -1,08 4,63 STM4585 gpmB -1,73 1,34 STM4585 gpmB -1,71 -0,02 STM1290 gapA -0,48 -0,84 STM1290 gapA -1,99 -0,40 STM4081 tpiA -1,98 -1,31 STM4081 tpiA -3,12 -0,98 STM4221 pgi -3,54 0,31 STM4221 pgi -4,34 -1,97 Ruta pentosas fosfato -1,15 STM1886 zwf 1,05 -1,36 STM1886 zwf -0,72 -0,59 STM2081 gnd 0,12 1,43 STM2081 gnd -1,83 0,31 STM3483 rpe -1,62 -0,16 STM3483 rpe -1,94 -0,27 STM3063 rpiA -0,87 0,62 STM3063 rpiA -0,97 -0,61 STM2474 tktB -0,09 0,61 STM2474 tktB -0,43 -1,24 STM3076 tktA -1,29 -1,48 STM3076 tktA -1,48 -1,44 STM0007 talB -1,64 -3,04 STM0007 talB -0,64 -1,14 Ruta Entner-Doudoroff -1,17 STM0169 gcd -0,12 STM0169 gcd 0,53 -1,50 STM3542 gntK -0,88 0,00 STM3542 gntK -0,24 -1,40 STM1885 edd -0,01 -0,84 STM1885 edd -1,01 0,05 STM1884 eda 0,61 1,06 STM1884 eda -0,69 -2,41 Ciclo de los ácidos tricarboxílicos -1,73 STM0730 gltA 1,99 -1,15 STM0730 gltA -1,37 -1,36 STM1712 acnA 0,41 0,31 STM1712 acnA -0,16 -1,97 STM0158 acnB -1,19

202

0,81 0,19 -0,71 0,16 0,06 -0,14 -0,45 -1,08 -0,82 -0,67 -0,87 -0,99 -0,57 0,07 0,61 -0,43 -0,12

0,61 0,31 -0,16 -0,59 1,43 -1,31 -0,98 -0,84 -0,40 -1,14 -1,17 -1,60 -1,69 -1,24 -1,48 -1,44 -3,04

-0,20 -0,01 -0,81 -0,41 -1,08 -1,51 -0,41 0,09 1,00 0,89 -0,65 -0,51 0,14 0,17

-1,12 -0,09 -0,49 -0,83 -1,56 -0,94 -0,45 -0,30 1,32 1,65 -1,91 -1,22 -0,88 -0,38

1,14 1,13 -1,76 -2,18 -0,19 0,12 -0,05 0,47

-0,05 0,20 -1,60 -0,85 -2,30 -2,02 -2,22 -1,43

1,00 -0,44 1,84 0,13 0,18 0,44 -0,07 1,25 -0,38 -1,07

Anexo II

STM0158 STM1238 STM1238 STM0736 STM0736 STM0737 STM0737 STM0738 STM0738 STM0739 STM0739 STM0732 STM0732 STM0733 STM0733 STM0734 STM0734 STM0735 STM0735 STM1468 STM1468 STM3359 STM3359 STM4300 STM4300 STM1469 STM1469

acnB icdA icdA sucA sucA sucB sucB sucC sucC sucD sucD sdhC sdhC sdhD sdhD sdhA sdhA sdhB sdhB fumA fumA mdh mdh fumB fumB fumC fumC

-1,10 1,09 0,32 -1,41 -3,84 -2,43 -3,85 -0,58 -0,78 0,35 -0,94 -2,28 -2,86 -2,00 -2,46 -2,56 -3,13 -0,82 -2,07 -1,58 -1,94 -0,87 -2,60 0,80 -0,36 0,47 0,83

-0,29 1,98 2,11 -1,74 -1,59 -0,22 -0,12 0,83 1,00 0,79 0,32 -1,02 -1,23 -2,02 -1,52 -1,92 -2,92 -1,86 -1,38 -0,28 0,03 1,17 1,09 -0,10 0,55 0,76 0,99

-0,77 0,01 0,30 -2,83 -3,84 -2,69 -2,96 -1,32 -1,51 -1,04 -0,52 -0,82 -1,47 -1,89 -1,60 -1,53 -2,09 -2,25 -1,71 -0,90 -0,84 -1,78 -1,27 -0,42 0,19 1,80 1,40

3,02 1,25 1,00 0,43 2,40 1,77 1,32 -1,56

2,01 4,98 1,96 4,65 1,33 1,98 1,11 2,64 -0,43 0,12 -0,90 1,10 -1,73 -0,30 -1,62 -0,57

STM3982 STM1350 STM1350 STM2388 STM2388 STM2389 STM2389

fadA ydiD ydiD yfcX yfcX yfcY yfcY

-0,78 2,88 0,29 1,14 -0,60 2,71 1,64

0,77 0,43 1,04 -0,22 1,54 0,44 2,69 0,35 2,83 0,98 -0,58 -0,13 -2,15 0,35

2,47 1,05 -0,97 -0,23 -4,41 -3,85 -1,40 -1,09

3,42 3,37 0,99 1,30 -2,23 -1,97 -0,49 -1,45

Utilización del acetato STM4275 STM4275 STM0935 STM0935 STM2337 STM2337 STM2338 STM2338

acs acs poxB poxB ackA ackA pta pta

1,73 2,26 1,89 2,00 -3,47 -3,44 -2,14 -1,66

Ciclo del glioxilato STM4183 STM4183 STM4184 STM4184 STM4185 STM4185 STM4187 STM4187

aceB aceB aceA aceA aceK aceK iclR iclR

β-oxidación de los ácidos grasos STM2391 fadL -2,09 -0,97 -0,99 STM2391 fadL -0,60 -0,69 1,24 STM1805 fadR 1,41 1,29 -0,07 STM1805 fadR -1,11 0,96 0,73 STM1818 fadD 0,66 0,06 0,68 STM1818 fadD 0,09 0,06 1,43 STM0857 STM0857 1,37 -0,12 -0,17 STM0857 STM0857 1,32 0,34 2,42 STM3983 fadB 0,53 1,08 -0,33 STM3983 fadB -0,48 1,09 0,64 STM3982 fadA 0,27 1,54 0,61 Los nombres de los genes tomados de la base de datos del genoma de la estirpe LT2 (McClelland et al., 2001).

 

203

Anexo II

Tabla A8. Niveles de expresión de genes de Salmonella enterica serovar Typhimurium relacionados con fimbrias, flagelo y quimiotaxis A B C A B C Nombre del gen Fimbrias STM0021 STM0021 STM0022 STM0022 STM0023 STM0023 STM0024 STM0024 STM0025 STM0025 STM0026 STM0026 STM0027 STM0027 STM0142 STM0142 STM0143 STM0143 STM0144 STM0144 STM0175 STM0175 STM0176 STM0176 STM0177 STM0177 STM0195 STM0195 STM0196 STM0196 STM0197 STM0197 STM0300 STM0300 STM0301 STM0301 STM0336 STM0336 STM0338 STM0338 STM0339 STM0339 STM0340 STM0340 STM0543 STM0543 STM0544

bcfA bcfA bcfB bcfB bcfC bcfC bcfD bcfD bcfE bcfE bcfF bcfF bcfG bcfG hofC hofC hofB hofB ppdD ppdD stiC stiC stiB stiB stiA stiA stfA stfA stfC stfC stfD stfD safB safB safC safC stbE stbE stbC stbC stbB stbB stbA stbA fimA fimA fimI

M 0,38 -0,29 0,78 0,14 0,32 -0,37 2,37 0,15 -0,36 -0,76 -0,40 -1,55 0,39 -0,14 -0,96 -1,69 2,08 -0,17 0,53 0,46 1,16 -0,03 0,57 0,17 -0,52 -0,96 1,85 0,71 0,11 -0,02 2,21 -0,45 1,78 0,31 0,99 0,46 0,81 0,33 2,21 1,25 4,72 2,29 -0,20 -0,31 2,19 1,48 1,09

M -0,29 -0,95 -0,60 -0,43 -0,64 -1,97 -0,13 -0,36 -0,52 -0,98 0,43 -1,06 0,18 0,61 -0,95 -0,26 -1,50 0,37 -0,80 0,02 0,89 -0,64 1,13 -0,81 -0,79 -1,21 0,79 0,31 -0,83 -1,23 1,33 0,63 1,05 0,51 0,07 1,85 1,49 -0,90 1,06 1,18 -0,84 0,32 1,29 0,87 1,32 0,76 -0,01

M -0,02 -0,05 -0,07 1,07 -0,53 0,54 -1,08 0,21 -0,72 -0,62 0,02 -0,40 -0,24 0,33 -0,95 -1,68 -0,91 -0,58 -1,27 -0,38 0,59 0,03 1,73 0,16 -0,33 -0,20 -0,32 -0,40 -0,90 -0,14 -0,89 0,66 0,17 1,70 0,83 -0,55 -1,07 -0,06 -0,31 1,22 2,87 1,58 2,26 2,59 -0,50 -0,12 0,70

Nombre del gen STM0544 STM0545 STM0545 STM0546 STM0546 STM0547 STM0547 STM0548 STM0548 STM1139 STM1139 STM1140 STM1140 STM1141 STM1141 STM1142 STM1142 STM1143 STM1143 STM1144 STM1144 STM1145 STM1145 STM2149 STM2149 STM2150 STM2150 STM2151 STM2151 STM2152 STM2152 STM3027 STM3027 STM3028 STM3028 STM3029,S STM3029,S STM3636 STM3636 STM3637 STM3637 STM3638 STM3638 STM3639 STM3639 STM3640 STM3640 STM4572

204

fimI fimC fimC fimD fimD fimH fimH fimF fimF csgG csgG csgF csgF csgE csgE csgD csgD csgB csgB csgA csgA csgC csgC stcD stcD stcC stcC stcB stcB stcA stcA stdC stdC stdB stdB stdA stdA lpfE lpfE lpfD lpfD lpfC lpfC lpfB lpfB lpfA lpfA stjB

M

M

M

-0,13 0,33 -0,20 0,57 0,13 0,77 -0,57 3,11 2,93 0,96 1,85 1,55 3,16 1,79 3,14 -0,67 1,79 0,20 0,65 -1,04 1,30 0,32 1,13 0,60 0,60 -0,51 1,34 0,20 0,27 0,13 1,13 0,05 -0,27 1,90 0,58 2,65 1,15 2,07 0,11 0,06 -0,85 1,16 -0,22 1,94 -0,60 2,16 2,10 1,17

-0,37 0,10 -1,36 0,00 -1,40 0,08 -0,69 1,97 -1,37 -1,01 -0,88 0,85 0,71 3,41 2,48 0,77 -0,84 -0,13 0,04 0,51 0,09 -0,04 0,14 0,85 0,66 0,01 0,23 0,65 -0,59 -0,22 -0,08 -0,33 -0,39 -0,02 0,62 0,39 0,02 -0,22 -0,47 -0,63 -0,98 -0,83 0,04 0,01 -0,15 0,18 0,19 -0,18

0,76 0,00 -0,73 -0,58 -1,02 -0,08 -0,33 6,37 0,81 0,63 0,62 1,14 3,66 3,75 4,46 2,59 1,49 0,73 1,03 -0,54 1,21 0,10 0,39 0,18 0,25 -1,54 0,54 0,32 0,79 -0,16 1,07 -0,53 -0,48 -0,26 -0,01 0,55 1,87 -0,40 0,84 0,09 -0,65 -0,79 -0,16 0,79 2,78 1,49 1,50 1,49

Anexo II

STM4572 STM4573 STM4573 STM4591 STM4591 STM4592 STM4592 STM4593 STM4593 STM4594 STM4594 STM4595 STM4595 PSLT013 PSLT013 PSLT016 PSLT016 PSLT017 PSLT017 PSLT018 PSLT018 PSLT019 PSLT019

stjB stjC stjC sthE sthE sthD sthD sthB sthB sthA sthA STM4595 STM4595 pefI pefI pefD pefD pefC pefC pefA pefA pefB pefB

1,09 0,00 -0,49 2,12 0,47 0,45 -0,60 0,68 0,19 1,38 -0,57 1,09 -0,51 0,77 3,00 1,74 2,29 0,40 1,00 0,35 1,93 0,32 1,01

-1,16 0,24 -0,72 -0,71 0,16 0,32 -0,39 0,44 0,28 -1,15 -0,39 0,05 -0,46 1,84 1,69 -1,33 -1,62 0,68 0,52 0,72 0,46 -0,69 -1,56

1,27 1,88 -0,43 0,83 1,01 1,06 0,58 0,38 0,21 4,55 4,63 -1,13 -0,72 -0,63 -0,06 -0,61 -0,05 -0,10 0,24 -1,15 -0,06 -0,95 0,93

flgN flgN flgM flgM flgA flgA flgB flgB flgC flgC flgD flgD flgE flgE flgF flgF flgG flgG flgH flgH flgI flgI flgJ flgJ

-1,22 -1,55 -0,62 -1,48 -2,66 -3,72 -3,20 -3,88 -2,10 -3,48 -1,61 -3,15 -2,30 -3,55 -0,70 -2,31 -0,86 -1,90 0,37 0,17 -2,80 -3,64 -0,91 -1,12

-2,84 -2,50 -2,99 -2,79 -2,74 -2,86 -3,10 -3,05 -3,07 -3,18 -2,90 -2,95 -4,13 -3,38 -3,15 -3,00 -2,76 -2,83 -3,51 -3,84 -3,17 -2,84 -1,94 -2,83

-2,38 -2,56 -1,04 -0,81 -1,47 -1,46 -4,68 -4,41 -5,88 -4,15 -3,43 -3,20 -3,20 -3,52 -2,61 -1,95 -2,80 -2,44 -2,39 -2,14 -3,69 -4,10 -0,48 -0,29

STM1183 STM1183 STM1184 STM1184 STM1913 STM1913 STM1914 STM1914 STM1922 STM1922 STM1923 STM1923 STM1959 STM1959 STM1960 STM1960 STM1961 STM1961 STM1962 STM1962 STM1968 STM1968 STM1969 STM1969 STM1970 STM1970 STM1971 STM1971 STM1972 STM1972 STM1973 STM1973 STM1974 STM1974 STM1975 STM1975 STM1976 STM1976 STM1977 STM1977 STM1978 STM1978 STM1979 STM1979 STM1980 STM1980 STM1981 STM1981

Flagelo STM1171 STM1171 STM1172 STM1172 STM1173 STM1173 STM1174 STM1174 STM1175 STM1175 STM1176 STM1176 STM1177 STM1177 STM1178 STM1178 STM1179 STM1179 STM1180 STM1180 STM1181 STM1181 STM1182 STM1182

205

flgK flgK flgL flgL flhA flhA flhB flhB motB motB motA motA fliC fliC fliD fliD fliS fliS fliT fliT fliE fliE fliF fliF fliG fliG fliH fliH fliI fliI fliJ fliJ fliK fliK fliL fliL fliM fliM fliN fliN fliO fliO fliP fliP fliQ fliQ fliR fliR

-3,25 -3,26 -1,39 -2,45 -0,40 -1,83 -0,35 -2,35 -2,58 -2,77 -0,42 -1,72 -3,82 -4,90 0,78 -1,25 -2,74 -3,64 -2,57 -2,66 -0,65 -0,79 -2,24 -3,40 -3,03 -3,89 -3,13 -4,84 -1,37 -2,85 0,03 -1,76 -2,33 -2,84 -2,31 -2,53 -2,85 -3,97 -2,77 -3,07 -2,02 -3,02 0,30 -0,32 -1,34 -1,64 -0,78 -1,53

-3,75 -3,20 -2,22 -2,21 -1,75 -2,20 -3,89 -2,92 -2,97 -3,71 -2,43 -2,92 -4,95 -4,95 -3,82 -4,48 -3,06 -3,06 -3,21 -3,38 -2,16 -2,59 -4,07 -4,73 -4,05 -4,79 -4,41 -5,40 -2,37 -3,61 -2,67 -2,65 -2,88 -3,13 -2,99 -3,63 -2,62 -3,20 -3,70 -3,40 -2,74 -3,50 -1,51 -1,79 -1,85 -1,98 -0,76 -1,18

-4,52 -3,69 -3,05 -2,03 -0,85 -1,55 -3,06 -1,06 -4,39 -4,72 -2,03 -1,11 -5,78 -5,44 -3,44 -5,31 -3,59 -4,30 -4,19 -2,44 -2,20 -1,96 -4,11 -4,31 -3,52 -4,56 -5,34 -4,45 -2,20 -2,37 -0,80 -0,20 -2,40 -3,07 -2,90 -2,39 -2,79 -4,28 -2,70 -3,70 -2,83 -3,18 -1,41 -0,90 -1,46 -2,98 -1,23 -0,96

Anexo II

STM2314 STM2314 STM2597 STM2597 STM2771 STM2771 STM3138 STM3138 STM3152 STM3152 STM3216 STM3216 STM3217 STM3217 STM4533 STM4533

STM2314 STM2314 STM2597 STM2597 fljB fljB STM3138 STM3138 STM3152 STM3152 STM3216 STM3216 aer aer tsr tsr

-0,81 -1,30 1,00 0,47 -3,21 -4,11 0,90 -0,30 -1,82 -2,36 2,27 -1,83 -1,60 -1,67 -1,18 -2,14

-2,90 -2,41 -0,93 -1,07 -4,47 -4,86 -0,19 -0,24 -2,51 -3,02 -1,91 -2,36 -3,33 -4,38 -3,64 -4,08

-1,14 -1,23 -0,68 -0,40 -4,62 -4,73 -0,92 -0,19 -1,71 -1,99 -0,39 -0,18 -2,03 -2,61 -3,48 -3,17

Quimiotaxis STM1915 cheZ -1,08 -3,58 -3,18 STM1915 cheZ -3,21 -3,98 -2,82 STM1916 cheY -3,66 -5,08 -5,28 STM1916 cheY -5,49 -4,53 -4,42 STM1917 cheB -3,90 -5,07 -5,74 STM1917 cheB -4,75 -5,48 -5,02 STM1918 cheR -1,09 -4,12 -3,12 STM1918 cheR -2,14 -4,72 -3,02 STM1919 cheM -1,73 -4,48 -3,08 STM1919 cheM -3,22 -3,45 -3,75 STM1920 cheW -1,67 -1,45 -1,69 STM1920 cheW -1,93 -3,32 -3,19 STM1921 cheA -3,19 -4,08 -3,61 STM1921 cheA -3,61 -3,89 -4,12 Los nombres de los genes tomados de la base de datos del genoma de la estirpe LT2 (McClelland et al., 2001).

 

206

Anexo II

Tabla A9. Niveles de expresión de genes de Salmonella enterica serovar Typhimurium relacionados con el transporte de iones inorgánicos A B C A B C Nombre del gen Potasio STM3880 STM3880 STM3409 STM3409 STM3986 STM3986 STM0706 STM0706 STM0705 STM0705 STM0704 STM0704 STM0703 STM0703 STM0702 STM0702

M

M

M

kup kup trkA trkA trkH trkH kdpA kdpA kdpB kdpB kdpC kdpC kdpD kdpD kdpE kdpE

0,41 -1,14 -1,03 -1,65 0,16 -1,27 -0,34 -0,35 -0,48 -0,85 0,65 -0,05 1,32 -1,49 2,91 1,66

-3,30 -2,96 -1,31 -0,80 -0,23 -0,19 -1,62 -1,42 0,03 -0,62 0,42 -0,02 -0,39 -0,12 -0,32 -0,14

-1,63 -1,48 -1,59 -1,05 0,94 0,49 0,32 -0,91 -1,32 -1,08 -1,14 -0,80 -1,09 0,19 0,00 0,57

mgtB mgtB mgtA mgtA corA corA

2,49 1,77 -0,58 -0,88 0,95 0,28

-1,02 -0,34 -0,74 -0,45 -0,13 0,10

-1,39 0,63 -1,20 -0,90 -1,07 0,60

Magnesio STM3763 STM3763 STM4456 STM4456 STM3952 STM3952

Hierro

Nombre del gen STM0598 STM0598 STM2773 STM2773 STM2774 STM2774 STM2775 STM2775 STM2776 STM2776 STM2777 STM2777 STM3505 STM3505 STM3506 STM3506 STM4550 STM4550 STM0191 STM0191 STM0192 STM0192 STM0193 STM0193 STM0194 STM0194

entA entA iroB iroB iroC iroC iroD iroD iroE iroE iroN iroN feoA feoA feoB feoB fhuF fhuF fhuA fhuA fhuC fhuC fhuD fhuD fhuB fhuB

M

M

M

0,10 -1,66 1,55 -0,15 0,33 -0,22 1,38 0,51 3,05 0,50 3,83 2,54 -0,45 -0,64 -2,20 -0,03 -0,31 0,66 -2,24 -2,60 -1,32 -0,20 -1,37 -0,86 -1,69 -0,65

1,18 1,50 4,74 5,20 4,53 4,30 3,90 3,83 6,36 6,33 5,52 5,56 -0,31 -0,15 -0,45 -0,46 0,86 0,74 -0,27 -0,50 -0,59 -0,86 -1,42 -1,20 -1,38 -1,38

-1,89 -0,70 -1,03 -0,54 0,27 1,02 -1,05 0,32 1,58 4,11 0,34 0,64 -2,14 -2,61 -3,10 -0,98 -0,88 -0,51 -0,93 -1,33 -2,05 -1,09 -3,33 -1,58 -0,38 -1,41

STM0585 fepA 1,02 2,68 -0,07 STM0585 fepA 0,18 2,47 0,69 STM0586 fes 0,55 1,73 -0,16 Manganeso STM0586 fes -0,20 1,92 -1,27 STM2861 sitA 3,27 7,26 6,83 STM0589 fepE 2,34 -0,66 -1,13 STM2861 sitA 2,76 6,79 7,38 STM0589 fepE -0,80 0,09 -0,33 STM2862 sitB 2,24 5,27 5,46 STM0590 fepC -0,68 -0,25 -1,22 STM2862 sitB 0,68 5,77 6,40 STM0590 fepC -1,03 -0,58 -0,07 STM2863 sitC 1,86 4,67 1,88 STM0591 fepG -1,34 -1,34 -2,28 STM2863 sitC 1,17 4,72 2,41 STM0591 fepG -1,52 -1,26 -1,85 STM2864 sitD 1,47 4,51 3,70 STM0592 fepD 0,02 -1,11 -0,71 STM2864 sitD 0,25 4,46 4,34 STM0592 fepD -0,80 -1,60 0,05 STM2408 mntH 0,49 2,10 0,91 STM0594 fepB -1,33 -0,11 -0,56 STM2408 mntH 0,10 2,15 1,08 STM0594 fepB -1,46 -0,22 -1,15 Fosfato STM0588 entF -0,14 1,67 -1,49 STM3853 phoU -0,05 0,14 -1,88 STM0588 entF -1,87 1,55 -0,75 STM3853 phoU -0,18 -0,10 -1,66 STM0596 entE -0,30 0,97 -1,28 STM3854 pstB 2,97 0,84 -0,58 STM0596 entE -1,25 0,81 -1,40 STM3854 pstB 1,82 0,87 1,76 STM0584 entD -0,26 -0,26 0,96 STM3855 pstA -0,13 1,13 1,62 STM0584 entD -1,18 -1,01 -1,64 STM3855 pstA -1,50 0,36 0,55 STM0595 entC -1,02 -0,20 -0,98 STM3856 pstC 1,00 0,60 -1,68 STM0595 entC -1,94 0,33 -2,07 STM3856 pstC -0,46 0,63 -0,48 STM0597 entB 0,84 1,41 0,90 STM3857 pstS 2,21 2,85 0,13 STM0597 entB -0,54 1,31 0,74 STM3857 pstS 1,85 2,98 0,63 Los nombres de los genes tomados de la base de datos del genoma de la estirpe LT2 (McClelland et al., 2001)

207

Anexo II

Tabla A10. Niveles de expresión de genes de Salmonella enterica serovar Typhimurium relacionados con las islas de patogenicidad A B C A B C Nombre del gen SPI-1 STM2859 STM2859 STM2860 STM2860 STM2861 STM2861 STM2862 STM2862 STM2863 STM2863 STM2864 STM2864 STM2865 STM2865 STM2866 STM2866 STM2867 STM2867 STM2868 STM2868 STM2869 STM2869 STM2870 STM2870 STM2871 STM2871 STM2872 STM2872 STM2873 STM2873 STM2874 STM2874 STM2875 STM2875 STM2876 STM2876 STM2877 STM2877 STM2878 STM2878 STM2879 STM2879 STM2881 STM2881 STM2882 STM2882 STM2883

fhlA fhlA ygbA ygbA sitA sitA sitB sitB sitC sitC sitD sitD avrA avrA sprB sprB hilC hilC orgC orgC orgB orgB orgA orgA prgK prgK prgJ prgJ prgI prgI prgH prgH hilD hilD hilA hilA iagB iagB sptP sptP sicP sicP iacP iacP sipA sipA sipD

M -0,07 2,49 0,73 1,89 2,76 3,27 0,68 2,24 1,17 1,86 0,25 1,47 2,80 2,80 0,79 0,51 0,89 0,68 0,17 -0,05 -0,80 -0,91 0,54 -0,09 -0,07 -0,13 -0,78 -1,69 -0,28 -0,87 1,31 1,27 1,66 -0,11 0,97 0,17 1,80 1,11 1,54 0,43 -1,46 -1,55 -0,85 -0,88 0,57 -0,87 0,45

M 2,96 3,12 4,16 3,44 7,26 6,79 5,27 5,77 4,67 4,72 4,51 4,46 2,23 2,66 1,02 1,06 0,27 -0,25 -0,44 -0,52 -0,39 -0,54 -0,69 -0,30 0,04 0,20 -0,21 -0,38 0,24 -0,17 -0,38 -1,04 -0,59 0,50 0,12 0,03 0,72 0,22 0,09 0,19 -0,49 -0,33 -0,22 -0,51 -0,33 -0,08 0,13

M 2,11 3,14 3,40 3,89 6,83 7,38 5,46 6,40 1,88 2,41 3,70 4,34 1,87 2,21 0,29 0,72 0,54 -0,16 -0,82 -0,19 -0,43 -0,73 -1,37 -0,51 0,13 -0,36 -0,01 -1,13 -2,26 -1,33 0,18 1,14 -0,12 1,29 -0,37 1,20 1,45 1,60 -1,51 -0,20 -2,10 -2,30 -0,88 -1,31 -1,50 -0,06 0,44

Nombre del gen STM2883 STM2884 STM2884 STM2885 STM2885 STM2886 STM2886 STM2887 STM2887 STM2888 STM2888 STM2889 STM2889 STM2890 STM2890 STM2891 STM2891 STM2892 STM2892 STM2893 STM2893 STM2894 STM2894 STM2895 STM2895 STM2896 STM2896 STM2897 STM2897 STM2898 STM2898 STM2899 STM2899 STM2900 STM2900

M

M

M

sipD sipC sipC sipB sipB sicA sicA spaS spaS spaR spaR spaQ spaQ spaP spaP spaO spaO invJ invJ invI invI invC invC invB invB invA invA invE invE invG invG invF invF invH invH

-0,51 0,54 -0,87 0,58 -0,46 1,39 1,03 1,21 0,44 -0,04 -0,37 -0,64 -0,87 -1,20 -1,86 -0,12 -1,13 3,34 2,85 3,22 2,95 1,56 1,03 0,33 0,01 1,71 0,38 0,54 -0,61 2,54 -0,65 -0,20 -0,32 1,37 1,35

-0,30 -0,68 0,42 -0,25 -0,22 0,20 -0,17 -0,16 -0,19 1,44 1,45 -0,12 -1,96 -0,25 -1,60 -0,28 -1,26 -0,12 0,13 0,20 -0,43 -0,48 -0,81 -0,84 -0,34 -0,11 -0,98 0,83 -1,40 -0,06 -0,37 0,19 0,18 -0,05 0,09

-0,14 -0,23 0,13 -2,60 -0,46 1,07 2,10 -0,15 1,18 2,52 2,67 -0,28 -0,10 -0,12 -0,65 -0,45 0,60 1,59 1,97 2,68 3,46 0,22 -0,16 -0,90 -0,17 0,13 1,04 -0,31 -1,57 0,20 1,19 0,52 0,25 -0,78 0,92

orf48 orf48 orf32 orf32 orf245 orf245 orf408 orf408 ttrA ttrA ttrC ttrC

0,20 -0,91 -0,41 -0,79 1,94 1,83 -0,90 -0,90 0,45 -0,35 0,25 0,05

-0,52 -1,37 -1,21 0,09 -0,49 -0,14 -0,52 0,64 -1,54 -1,36 0,30 -0,55

-0,13 -0,84 1,03 -0,72 3,90 1,58 -0,40 0,32 -0,93 -0,52 1,10 0,19

SPI-2 STM1379 STM1379 STM1380 STM1380 STM1381 STM1381 STM1382 STM1382 STM1383 STM1383 STM1384 STM1384

208

Anexo II

STM1385 ttrB STM1385 ttrB STM1386 ttrS STM1386 ttrS STM1387 ttrR STM1387 ttrR STM1388 orf70 STM1388 orf70 STM1389 orf319 STM1389 orf319 STM1390 orf242 STM1390 orf242 STM1391 ssrB STM1391 ssrB STM1392 ssrA STM1392 ssrA STM1394 ssaC STM1394 ssaC STM1395 ssaD STM1395 ssaD STM1396 ssaE STM1396 ssaE STM1398 sseB STM1398 sseB STM1399 sscA STM1399 sscA STM1400 sseC STM1400 sseC STM1401 sseD STM1401 sseD STM1402 sseE STM1402 sseE STM1403 sscB STM1403 sscB STM1404 sseF STM1404 sseF STM1405 sseG STM1405 sseG STM1406 ssaG STM1406 ssaG STM1407 ssaH STM1407 ssaH STM1408 ssaI STM1408 ssaI STM1409 ssaJ STM1409 ssaJ STM1410 STM1410 STM1410 STM1410

0,19 -0,78 0,69 -0,41 0,14 -0,68 -0,67 -1,36 -0,30 -1,62 1,02 0,03 1,14 1,13 2,72 1,15 1,47 0,86 1,26 1,19 1,47 0,66 2,92 2,89 4,21 3,16 2,48 1,21 2,47 1,98 3,51 2,39 2,46 1,68 1,36 -0,34 1,31 -0,02 2,33 1,44 1,52 0,81 2,70 1,58 2,82 1,40 1,65 0,91

-0,33 -1,26 0,00 -1,27 0,79 1,03 0,61 0,24 0,80 0,89 1,60 1,16 3,15 3,76 1,90 1,31 5,69 5,86 6,25 7,17 7,15 6,48 9,16 8,63 9,45 8,99 6,94 7,51 6,25 7,06 7,54 6,56 5,56 5,64 3,70 3,60 3,41 3,76 6,29 6,49 7,19 7,53 8,44 7,85 7,34 7,63 5,98 6,04

1,14 0,06 0,37 -0,31 1,07 1,84 0,06 0,67 1,77 2,03 0,45 1,98 0,33 -0,12 1,00 2,90 0,98 1,57 0,84 0,12 1,04 0,85 -0,12 -1,04 1,49 2,61 -0,48 1,64 0,13 1,24 0,83 1,48 0,37 1,07 -0,78 0,88 0,08 0,88 0,21 1,05 -0,93 -0,27 -0,80 1,09 0,18 1,35 1,22 -0,53

STM1411 STM1411 STM1412 STM1412 STM1413 STM1413 STM1414 STM1414 STM1415 STM1415 STM1416 STM1416 STM1417 STM1417 STM1418 STM1418 STM1419 STM1419 STM1421 STM1421 STM1422 STM1422

ssaK ssaK ssaL ssaL ssaM ssaM ssaV ssaV ssaN ssaN ssaO ssaO ssaP ssaP ssaQ ssaQ ssaR ssaR ssaT ssaT ssaU ssaU

1,63 -0,33 2,57 1,16 1,04 0,67 2,86 -0,22 1,35 -0,47 -0,37 -0,40 0,13 -0,74 0,92 -0,15 3,01 2,59 0,68 0,60 -0,90 -1,39

6,06 6,84 7,55 7,48 5,82 6,11 4,84 5,74 5,30 6,13 5,54 5,76 4,15 4,33 5,16 5,18 5,31 5,57 3,92 4,22 1,70 1,67

0,71 1,35 -0,55 -0,14 2,04 1,98 -1,00 0,10 -1,14 0,45 0,60 0,78 -0,19 -1,57 -0,98 0,84 0,95 1,39 0,79 0,60 -0,55 0,11

0,23 -0,01 -0,74 -1,14 1,63 0,23 1,03 -0,59 1,40 0,28 1,22 -0,35 1,42 -0,13 1,77 0,09 1,49 -0,48 2,49 1,77 5,18 4,25

-0,07 -0,60 0,06 -0,43 0,18 0,39 -0,86 -1,38 -0,06 -0,43 -0,46 0,68 -0,25 -0,16 1,80 2,00 1,12 2,05 -1,02 -0,34 0,33 -0,27

-0,04 1,16 1,23 0,29 0,19 0,61 -0,43 0,17 1,14 -0,54 -0,51 0,47 0,74 0,24 -0,32 0,94 -0,51 0,09 -1,39 0,63 -0,67 0,68

0,24 -0,31

-1,36 -1,61

-1,24 -0,30

SPI-3 STM3753 sugR STM3753 sugR STM3754 STM3754 STM3754 STM3754 STM3755 rhuM STM3755 rhuM STM3756 rmbA STM3756 rmbA STM3757 misL STM3757 misL STM3758 fidL STM3758 fidL STM3759,S marT STM3759,S marT STM3761 slsA STM3761 slsA STM3762 cigR STM3762 cigR STM3763 mgtB STM3763 mgtB STM3764 mgtC STM3764 mgtC

SPI-4 STM4258 STM4258

209

STM4258 STM4258

Anexo II

STM4259 STM4259 STM4260 STM4260 STM4261 STM4261 STM4262 STM4262

STM4259 STM4259 STM4260 STM4260 STM4261 STM4261 STM4262 STM4262

0,27 -0,32 0,44 -0,71 -0,16 -0,50 2,65 1,39

-1,03 -1,25 -0,99 -1,85 -0,27 0,38 0,49 0,47

-0,72 -0,89 -0,74 -0,14 -0,45 -0,23 -1,20 -0,36

SPI-5 STM1087 pipA 0,75 3,44 1,34 STM1087 pipA 0,09 3,33 1,27 STM1088 pipB 2,57 8,57 0,09 STM1088 pipB 2,24 8,12 1,40 STM1090 pipC -0,62 -0,22 -1,12 STM1090 pipC -0,79 0,17 -0,39 STM1091 sopB 2,79 -0,62 -0,76 STM1091 sopB 2,50 -0,88 0,88 STM1094 pipD 2,06 -0,27 -0,05 STM1094 pipD 0,20 -0,77 0,87 STM1095 copS -0,28 -0,08 0,49 STM1095 copS 1,00 -0,42 0,06 STM1096 copR 0,41 0,76 0,74 STM1096 copR 1,63 0,73 1,13 Los nombres de los genes tomados de la base de datos del genoma de la estirpe LT2 (McClelland et al., 2001).

 

210

Anexo II

Tabla A11. Niveles de expresión de los genes de Salmonella enterica serovar Typhimurium que codifican proteínas efectoras de SPI-2 A B C Nombre del gen

M

M

M

STM0800 slrP 0,14 0,75 0,56 STM0800 slrP 1,17 0,29 0,94 STM0972 sopD2 -0,34 4,60 0,92 STM0972 sopD2 0,30 4,87 0,80 STM1051 sseI 0,91 5,43 2,24 STM1051 sseI 0,08 5,94 1,66 STM1088 pipB 2,57 8,57 0,09 STM1088 pipB 2,24 8,12 1,40 STM1224 sifA -1,19 3,57 -0,20 STM1224 sifA -1,02 4,02 0,48 STM1583 steA 0,93 0,53 0,11 STM1583 steA 1,80 -0,61 1,73 STM1602 sifB 0,59 4,90 0,72 STM1602 sifB 1,66 4,58 1,26 STM1631 sseJ 0,48 6,60 0,64 STM1631 sseJ 2,31 6,36 1,91 STM1698 steC -0,50 5,77 -1,55 STM1698 steC 1,01 6,34 -0,15 STM2137 sseK2 2,29 3,62 1,76 STM2137 sseK2 0,61 3,85 1,50 STM2241 sspH2 0,08 4,67 -1,31 STM2241 sspH2 1,41 4,62 0,26 STM2287 sseL -0,10 4,87 1,35 STM2287 sseL -0,87 5,52 0,33 STM2584 gogB 0,64 1,33 1,44 STM2584 gogB 1,72 0,96 0,96 STM2780 pipB2 1,82 10,64 -0,19 STM2780 pipB2 2,93 9,87 1,65 STM4157 sseK1 -0,52 -0,71 -0,94 STM4157 sseK1 -0,12 -0,33 -0,28 Los nombres de los genes tomados de la base de datos del genoma de la estirpe LT2 (McClelland et al., 2001)

  BIBLIOGRAFÍA McClelland, M., Sanderson, K.E., Spieth, J., Clifton, S.W., Latreille, P., Courtney, L., Porwollik, S., Ali, J., Dante, M., Du, F., Hou, S., Layman, D., Leonard, S., Nguyen, C., Scott, K., Holmes, A., Grewal, N., Mulvaney, E., Ryan, E., Sun, H., Florea, L., Miller, W., Stoneking, T., Nhan, M., Waterston, R., Wilson, R.K. (2001) Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2. Nature 413: 852-856.

211

ANEXO III Artículo publicado con parte de los trabajos de investigación presentados en esta Tesis doctoral

Anexo III

A continuación se adjunta el artículo publicado con parte de los trabajos de investigación presentados en esta Tesis doctoral. Se especifica el índice de impacto (IF) según el ISI Web of KnowledgeTM e ISSN de la revista.

García-del Portillo, F., Núñez-Hernández, C., Eisman, B., Ramos-Vivas, J. (2008) Growth control in the Salmonella-containing vacuole. Curr Opin Microbiol 11: 46-52. IF=7,654. ISSN 1369-5274

215

Available online at www.sciencedirect.com

Growth control in the Salmonella-containing vacuole Francisco Garcı´a-del Portillo, Cristina Nu´n˜ez-Herna´ndez, Blanca Eisman and Jose´ Ramos-Vivas Salmonella enterica is an intracellular bacterial pathogen that inhabits membrane-bound vacuoles of eukaryotic cells. Coined as the ‘Salmonella-containing vacuole’ (SCV), this compartment has been studied for two decades as a replicative niche. Recent findings reveal, however, marked differences in the lifestyle of bacteria enclosed in the SCV of varied host cell types. In fibroblasts, the emerging view supports a model of bacteria facing in the SCV a ‘to grow’ or ‘not to grow’ dilemma, which is solved by entering in a dormancy-like state. Finetuning of host cell defense/survival routes, drastic metabolic shift down, adaptation to hypoxia conditions, and attenuation of own virulence systems emerge as strategies used by Salmonella to intentionally reduce the growth rate inside the SCV. Addresses Departamento de Biotecnologı´a Microbiana, Centro Nacional de Biotecnologı´a, Consejo Superior de Investigaciones Cientı´ficas (CSIC), Darwin 3, 28049 Madrid, Spain Corresponding author: Garcı´a-del Portillo, Francisco ([email protected])

Current Opinion in Microbiology 2008, 11:46–52 This review comes from a themed issue on Bacteria Edited by Thomas Meyer and Ilan Rosenshine Available online 20th February 2008 1369-5274/$ – see front matter # 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved. DOI 10.1016/j.mib.2008.01.001

Introduction Pathogens replicate and propagate in susceptible hosts. In most cases, extensive replication is, however, not required to ensure dissemination. In fact, many successful pathogens displaying high infection rates prevent overt damage and coexist with the host for long-lasting (even life-long) periods. Bacterial pathogens with such ability include Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, and Salmonella enterica [1–3]. Host defenses, intricate strategies developed by the pathogen, or a combination of both, ultimately impact the capacity of the pathogen to proliferate in host tissues. How pathogens attenuate their replication rate in host tissues is still poorly understood, though some mechanistic details start to emerge. For example, hypoxia and nitric oxide (NO) production by the host predispose M. tuberculosis for entering a nonreCurrent Opinion in Microbiology 2008, 11:46–52

plicative dormant state in lung granulomas. Two bacterial kinase proteins, DevS and DevT, act as hypoxia and redox sensors to activate a cognate response regulator, DevR, which ultimately reprograms gene expression to initiate dormancy [4,5]. S. enterica has necessarily evolved mechanisms to restrain growth in the host. This pathogen causes gastroenteritis and systemic diseases in humans and animals but is often associated with asymptomatic infections. At the cellular level, S. enterica lives within membrane-bound vacuoles and causes acute and long-lasting infections by surviving and replicating preferentially in macrophages [6,7]. Other cells targeted during the infection are epithelial, dendritic, and fibroblast-like cells. To establish a chronic infection, different genes are used by the pathogen at defined stages [8]. In this complex scenario, temporal and spatial modeling of the Salmonella-containing vacuole (SCV) is expected to occur. This review summarizes recent findings revealing marked differences in the SCV of diverse host cell types. Unlike the evidence found in other nonphagocytic cell types, S. enterica produces a long-lasting infection inside the SCV of fibroblasts with very limited, if any, proliferation (Figure 1) [9]. Recent transcriptome assays have shed light on how this unique lifestyle may have evolved. Interestingly, some of the unveiled new traits resemble those of the M. tuberculosis dormancy state [10].

Salmonella, vacuoles, cytosol, and autophagy The SCV has been intensively studied in tissue culture models [11–13]. Except in dendritic cells and fibroblasts, intravacuolar bacteria have been shown to replicate inside the SCV. Intriguingly, S. enterica does not undergo many replication rounds within the cells of animal tissues, neither in acute nor in chronic infections (reviewed in [12]). This picture implies the probable existence of mechanisms restricting replication, but not survival, of bacteria located inside the SCV. After 24 hours of infection, increases of no higher than twofold to threefold in intracellular wild-type bacteria are usually observed in fibroblasts [12]. However, bacterial mutants defective in certain functions, like the virulence regulatory system PhoP–PhoQ, overgrow in the SCV (Figure 1). Fibroblasts therefore exemplify a niche in which S. enterica probably adapts to an environment not supporting active growth. The view of the SCV as a compartment supporting only limited bacterial growth is not exclusive of fibroblasts. A www.sciencedirect.com

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Figure 1

Distinct modes of Salmonella growth inside different nonphagocytic cell types. Shown is a comparison of the Salmonella lifestyle inside epithelial cells and fibroblasts. Intracellular bacteria initiate the infection enclosed in the Salmonella-containing vacuole (SCV). In epithelial cells, this compartment is further modeled (1) to sustain bacterial proliferation (2). Salmonella replicates, however, at higher rates in the cytosol of epithelial cells, showing a characteristic larger cell size as it has been shown for wild-type or sifA strains (3). In epithelial cells, no differences have been reported in the phenotypes of wild-type and phoP bacteria. In fibroblasts, wild-type bacteria adapt to a nonproliferative state inside the SCV (4). By contrast, mutants with an inactive PhoP–PhoQ system overgrow inside the SCV upon the infection of this particular cell type (5). A proportion of SCV (damaged) and cytosolic bacteria is proposed to be targeted by the autophagic system and ubiquitinated proteins in both cell types (6). The significance of these later processes for the control of Salmonella intracellular growth remains to be determined. Relevant to the control of Salmonella intracellular growth is the action of host (TBK-1) and bacterial (SifA) proteins that ensure integrity of the SCV membrane. Very recently, the AKT-1 (Akt) kinase has also been implicated in preventing fusion of the SCV with lysosomes of epithelial cells, promoting bacterial replication in this way. This later model, however, contrasts with the elevated rate of interaction with the endolysosomal system shown for the SCV in HeLa epithelial cells.

defect in SifA, a bacterial protein secreted by the type-III secretion system encoded in the pathogenicity island-2 (SPI-2 TTSS), results in release of many intravacuolar bacteria to the cytosol [14,15]. Lack of SifA has consequences for growth since bacteria replicate at higher rates in the cytosol than inside the SCV of epithelial cells. Wild-type bacteria (0.7–24%, depending on the study) have also been claimed to reside in the cytosol upon release from damaged SCV [14,15]. The in vivo significance of this vacuole-to-cytosol transition and the subsequent massive cytosolic replication remain, however, elusive. Thus, though S. enterica replicates efficiently in animal tissues during an acute infection, such process occurs essentially by net increase in infection foci rather than by undergoing massive replication within cells [16]. www.sciencedirect.com

Recently, it has been shown that TANK-binding kinase 1 (TBK-1), a host factor involved in type-I interferon responses mediating antiviral-defense, preserves the integrity of the SCV [17]. tbk1( / ) embryonic fibroblasts contain more intracellular bacteria, predominantly located in the cytosol. This increase in bacterial load occurs in different cell types in which TBK-1 was knocked out (epithelial, fibroblasts, and macrophages) as well as in tbk1( / ) fibroblasts infected with other pathogens as Streptococcus pyogenes and pathogenic Escherichia coli [17]. These results are in line with the data obtained with the sifA mutant and favor the hypothesis that the SCV environment, in spite of supporting bacterial growth in certain cell types, could be more restrictive than the host cell cytosol. Recent work has shown that in epithelial cells the autophagosomal marker LC3 (light chain 3) colocalizes with intracellular S. enterica, and that such event peaks at onehour postinfection [18]. Most bacteria having LC3-labeling retain colocalization with SCV-membrane proteins as Lamp-1, which suggests that damaged (perforated) SCVs are rapidly targeted by the autophagic system [19]. Perforation of the SCV membrane could be accomplished by the invasion-associated type-III secretion apparatus encoded in the pathogenicity island-1 (SPI-1 TSS) [20], which remains active in intracellular bacteria. However, only 20% of the SCV is surrounded by LC3 in infected epithelial cells displaying maximal autophagic activity [19]. So, it remains to be demonstrated whether bacteria enclosed in the SCV of epithelial cells subvert autophagy or not. In macrophages, S. enterica induces autophagy and cell death by injecting SipB, an effector protein secreted by SPI-1 TTSS [21]. Autophagy, as a process responding to stress conditions [22], modulates the survival of M. tuberculosis inside macrophages [23,24]. At steady-state, about 5% of M. tuberculosis-containing vacuoles colocalize with LC3 whereas 35% of these vacuoles become positive upon autophagy stimulation by either nutritional starvation or drugs [22]. Importantly, autophagy releases the maturation arrest imposed by M. tuberculosis on its vacuole [23]. Intravacuolar survival of M. tuberculosis is also controlled by interferon-g (INF-g). Thus, immunity-related GTPases (IRGs) activated upon INF-g stimulation promote antimycobacterial effect by inducing autophagy [24,25]. Remarkably, no study has yet addressed whether autophagy induction alters the trafficking route of the SCV and the growth or survival of intravacuolar S. enterica. This aspect could be addressed in freshly isolated macrophages, which impair bacterial survival inside the SCV. Interestingly, S. enterica proliferates at a large extent in atg5( / ) embryonic fibroblasts, deficient in autophagosome maturation [19]. These differences correlate with the presence of a larger population of cytosolic bacteria, which were otherwise decorated with ubiquitinated proteins as in Current Opinion in Microbiology 2008, 11:46–52

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wild-type fibroblasts. M. tuberculosis survival is affected by the exposure to ubiquitin-derived peptides [26], but it is unknown whether a similar mechanism applies for S. enterica in fibroblasts. Studies in macrophages have shown that cytosolic wild-type bacteria colocalize with ubiquitinated proteins, a process that may ultimately contribute to pathogen death [27]. The exact mechanism of this proposed ubiquitin-mediated killing has not been explored further. Furthermore, increased cytosolic positioning and growth of S. enterica in the autophagy-defective atg5( / ) fibroblasts is intriguing considering that cytosol extracts of fibroblasts restrict S. enterica growth [14]. Finally, it should be noted that pathogens as Shigella flexneri and Listeria monocytogenes, which reside in the cytosol, efficiently evade autophagy [28–30]. In summary, in the case of S. enterica infections these yet-confusing data do not clarify whether autophagy limits bacterial growth in the SCV and how the process is directed.

Alarming but preserving the host cell Besides autophagy, eukaryotic cells use other tools to combat bacterial infections, like the pattern-recognition receptors (PRRs) [31] or members of the mitogen-activated protein (MAP) kinase family [32]. MAP kinase cascades are activated by mitogenic stimuli such as growth factors and hormones (ERK 1/2 pathway); or by a variety of cellular and environmental stresses (JNK and p38 pathways). In macrophages, S. enterica and M. tuberculosis activate extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK 1/2), which impairs pathogen intravacuolar growth [33,34]. S. enterica also activates ERK 1/2 kinases in fibroblasts (Eisman et al., unpublished). Consistent to these observations, mutants overgrowing in the SCV of fibroblasts activate the ERK 1/2 cascade to a lesser extent. Intravacuolar wild-type bacteria may therefore intentionally stimulate these MAP kinases to attenuate the growth rate. It is noteworthy that neither the JNK nor the p38 cascades are activated in S. enterica-infected fibroblasts (Eisman et al., unpublished), contrasting to the activation of these MAP kinases reported in epithelial cells infected with S. enterica or Campylobacter jejuni [35,36]. These differences reinforce once more the varied lifestyle of S. enterica in the SCV of distinct host cell types. In epithelial cells, S. enterica activates the pro-survival antiapoptotic kinase Akt-1 (also known as protein kinase B, PKB) by injecting SopB/SigD, a secreted effector with phosphoinositide-phosphatase activity. Although the exact mechanism of activation remains undefined, Akt1 is activated by S. enterica in a sustained manner several hours after bacterial entry [37]. This mode of activation is proposed to ensure the survival of the infected cell and to facilitate subsequent bacterial proliferation within the SCV. Such strategy has implications for the intestinal infection since S. enterica encounters epithelial cells undergoing a rapid turnover and having Akt-1 normally downregulated. S. enterica may also activate Akt-1 to limit Current Opinion in Microbiology 2008, 11:46–52

inflammation and ensure intestinal colonization [38]. In fibroblasts, nongrowing wild-type bacteria activate Akt-1 to a greater extent than mutants that overgrow inside the SCV (Eisman et al., unpublished). Apoptosis inhibition could facilitate long-lasting persistence of the bacteria in this particular SCV. Pharmacological inhibition of ERK 1/ 2-phosphorylation or Akt-1-phosphorylation results in overgrowth of wild-type S. enterica inside the SCV of fibroblasts, which is consistent with active host defenses operating in this nonphagocytic cell type. Taken together, these observations further support the idea of S. enterica intentionally stimulating host defenses to attenuate growth in the SCV.

Nutrition inside the SCV The microenvironment of the SCV remains largely unknown. However, recent studies have shed light on nutrients and intermediate metabolism probably used by S. enterica inside the SCV. Microarray analysis performed with serovar Typhimurium in murine macrophages indicated that magnesium, manganese, and iron could be limited in the SCV compared to a nutrient-rich medium like LB (reviewed in [39]). Genes encoding transporters required for the uptake of these cations were upregulated in intracellular bacteria. Using a proteomic approach, Shi et al. confirmed that some of these transporters, such as MgtB, SitA, SitB, and IroN, are abundant in bacteria recovered from macrophages [40]. Intriguingly, a recent microarray study suggests that iron may be not limiting in the SCV containing serovar Typhi [41]. This particular SCV may not have limiting manganese or phosphate, inferred by the non-induction of the sitABCD operon or genes induced by phosphate deprivation as phoN, pstA, or pstB [41]. Strikingly, serovar Typhi, but not Typhimurium, upregulates aceA in the SCV of macrophages. aceA encodes isocitrate lyase, an enzyme involved in the metabolism of fatty acids and acetate as carbon sources via the glyoxylate shunt [42]. These differences infer distinct lifestyles for these two serovars in the SCV of macrophages. Variables as the source of macrophages, infection conditions, methods of RNA isolation, and comparators used (bacteria growing in LB or collected from infection growth medium), may also affect the relative extent of these differences. As an example, the microarray analysis performed with serovar Typhimurium used macrophages expressing a nonfunctional Slc11a1 (also known as Nramp or Ity) protein. Slc11a1 is a metal efflux pump proposed to remove essential cations from the SCV and therefore it is relevant in the control of bacterial intracellular growth [43]. In addition, these studies were performed with actively growing bacteria, which may differ in physiological terms from bacteria nonreplicating or struggling for survival in the SCV. Such comparison imposes a technical challenge because of the limitations of obtaining sufficient material from nongrowing populations of intracellular bacteria. www.sciencedirect.com

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Regarding to in vivo data, recent proteomic studies identified serovar Typhimurium proteins in tissue extracts of infected mice and inferred usage of both aerobic and anaerobic electron acceptors [44]. Through a systematic analysis of bacterial mutants lacking key metabolic enzymes, Tchawa Yimga et al. showed that sugars could be used as main carbon source and that the tricarboxylic acid (TCA) cycle may operate as full cycle in the acute infection [45]. Fang et al. recently demonstrated that, for establishing a chronic infection, serovar Typhimurium may use fatty acids and acetate as carbon sources via the glyoxylate shunt [46]. AceA was shown to be essential in this infection model. Nonreplicating serovar Typhimurium also upregulates the glyoxylate shunt in cultured fibroblasts. Likewise, M. tuberculosis has two isocitrate lyases (Icl1 and Icl2) and both are involved in persistence and virulence [47]. Regarding other metabolic parameters, M. tuberculosis may undergo different respiratory states depending on the infection stage [48]. During the chronic infection, nitrate is apparently preferred as terminal electron acceptor [10]. The nonreplicative phase of S. enterica in fibroblasts is also accompanied by the upregulation of reductases using alternative electron acceptors other than oxygen (Nu´n˜ez-Herna´ndez et al., unpublished). Nonreplicating serovar Typhimurium inhabiting the SCV of fibroblasts display other metabolic traits resembling those reported for ‘dormant’ M. tuberculosis [10] (Figure 2). These include the decreased expression of genes encoding components of the H+-ATPase pump (atp operon) and ribosomal proteins as well as the upregulation of enzymes involved in anaerobic lipid catabolism and gluconeogenesis. Another important environmental cue unveiled in the SCV of fibroblasts is hypoxia (Nu´n˜ez-Herna´ndez et al., unpublished) [9]. This condition triggers entry of M. tuberculosis in the dormant state [4,5]. Cyo and Cyd terminal oxidases, which use oxygen exclusively as terminal acceptor, are strongly downregulated in bacteria inhabiting the SCV of fibroblasts. S. enterica also reduces in this niche energy-dependent processes as flagella synthesis, consistent with the probable reduction of protonmotive force (PMF) and the aforementioned probable downregulation of the H+-ATPase pump. This lowenergy state would also explain the strong upregulation of the ‘phage-shock-response’ ( psp) genes, which are induced upon PMF decrease [49]. Intriguingly, in fibroblasts S. enterica also upregulates genes that are under control of the alternative sigma factor RpoN (sN or s54), including some genes encoding enhancer-binding proteins (EBPs) promoting transcription by the RpoN–RNA–polymerase complex [50]. Target genes of the sN–EBP regulon are mostly involved in responses allowing survival in hostile environments, including adaptation to niches with limiting nitrogen sources. psp genes form part of the sN–EBP regulon www.sciencedirect.com

Figure 2

Main physiological changes deciphered in nonreplicating Salmonella enterica enclosed in the SCV of fibroblasts. (a) Components of S. enterica growing extracellularly that are strongly downregulated upon entry into fibroblasts; (b) functions upregulated in bacteria remaining in a nonreplicative state inside the SCV. Some environmental cues assigned to this particular SCV, as hypoxia and ions limitation, are also indicated. In blue are marked changes also described for dormant Mycobacterium tuberculosis (hypoxia; usage of lipids acetate as carbon source via the glyoxylate shunt; and upregulation of alternative reductases). Abbreviations: AceA, isocitrate lyase; EBP, enhancer-binding proteins that mediate RpoN (sN)-dependent transcription; Psp, phage-shock proteins; SPI-1–SPI-2 TTSS, type-III secretion systems encoded in the pathogenicity islands SPI-1 and SPI-2.

and are also highly upregulated by S. enterica inhabiting the SCV of macrophages [39,41] and fibroblasts.

Expression of virulence genes by nongrowing S. enterica The specialized SPI-2 TTSS secretion system is a key virulence factor largely involved in intracellular replication and survival within macrophage and epithelial cells [51,52]. In fibroblasts, expression of SPI-2 genes has been Current Opinion in Microbiology 2008, 11:46–52

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observed in nongrowing (wild-type) and overgrowing bacteria ( phoP mutant) (Nu´n˜ez-Herna´ndez et al., unpublished). Unlike what has been reported in macrophages [53], bacteria residing within the fibroblast may not strictly require a functional PhoP–PhoQ system to induce the SPI-2 TTSS system. Expression of SPI-2 genes also occurs in nongrowing Salmonella located inside the SCV of dendritic cells [54], though it is unknown the relative contribution of the PhoP–PhoQ in this particular cell type. The fact that in fibroblasts the exacerbated growth of the phoP mutant relies on a functional SPI-2 TTSS [55] sustains a model based on the fine-tuning of this virulence system as strategy to modulate the growth rate inside the SCV.

could prevent fusion of the SCV with lysosomes. Thus, pharmacological inhibition of Akt-1 as well as other kinases in a same functional network was shown to impair replication of Salmonella within the SCV. Akt-1 was previously shown to be targeted by Salmonella to promote antiapoptotic routes in the infected epithelial cell [37]. It is noteworthy that recent work by Drecktrah et al. in HeLa epithelial cells [58] revealed that the SCV, though being a replicative niche in this cell type, interacts with late compartments of the endocytic route such as lysosomes. Therefore, the exact extent at which Salmonella inhibits SCV–lysosome fusion in epithelial cells and its impact on the control of bacterial growth remains to be clarified.

Conclusions

Acknowledgements

S. enterica establishes different ways of life inside distinct eukaryotic cell types. Until recently, the biology of SCVs harboring nonreplicating bacteria was largely ignored. However, recent studies have shed new lights on this particular condition, finely regulated by the pathogen. The data collected in the fibroblast model reveal a remarkable overlap with data previously reported for M. tuberculosis in the dormant, nonreplicative state. Environmental cues and responses shared in both conditions include hypoxia, downregulation of the ATPsynthase, usage of fatty acids as main carbon source, and the synthesis of proteins responding to stress (Figure 2). A yet missing element in the S. enterica model is a dedicated ‘regulatory system’ promoting the adaptation to a nonreplicative state, as the DevSTR system in M. tuberculosis. If existing, the identification of such novel regulatory network would be undoubtedly a major breakthrough to understanding how S. enterica controls intravacuolar growth. Finally, we should be more aware of the often-discordant data obtained in distinct in vitro cultured cells and in vivo mouse models, which probably reflects the inherent limitations of both systems. Future studies directly addressing the ultimate basis of the divergent and common trends found are clearly required. These analyses would increase our limited knowledge of the processes behind the disparate growth rates observed in different cell types and infection conditions.

We thank Olivia Steele-Mortimer for the critical comments on sections of this manuscript. Work in the laboratory of FGP is supported by grants BIO2004-03455-C02-01 and GEN2006-27776-C2-1-E/PAT from the Ministry of Education and Science of Spain and LSHB-CT-2005-512061 (NoE ‘EuroPathogenomics’) from the European Union. CNH is recipient of a Fellowship from the ‘Consejerı´a de Educacio´n de la Comunidad de Madrid’.

Update Very recently, two studies have provided new insights on the different lifestyle of Salmonella inside the SCV of host distinct cell types as well as in mechanisms that could control the extent of bacterial replication within the SCV. In a microarray analysis performed in HeLa epithelial cells, Hautefort et al. [56] uncovered that, unlike what was previously observed in macrophages, Salmonella growing inside the SCV expresses the three type-III secretion systems present in this pathogen (flagella and those encoded in SPI-1 and SPI-2). In the second study, Kuijl et al. [57] report using breast cancer epithelial cell that the targeting by SopB of PKB (Akt-1) Current Opinion in Microbiology 2008, 11:46–52

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Current Opinion in Microbiology 2008, 11:46–52

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ANEXO IV Datos obtenidos en el análisis de expresión génica global de Salmonella enterica serovar Typhimurium

Anexo IV

A continuación se presentan los datos obtenidos en los análisis de expresión génica global de Salmonella enterica serovar Typhimurium realizados en esta Tesis doctoral. Las condiciones experimentales A, B y C corresponden a: A: Estirpe silvestre intracelular 24 h p.i. relativo a bacterias cultivadas en medio LB en la fase exponencial de crecimiento B: Mutante phoP intracelular 24 h p.i. relativo a bacterias cultivadas en medio LB en la fase exponencial de crecimiento C: Estirpe silvestre cultivada en medio LB en la fase estacionaria relativo a bacterias cultivadas en medio LB en la fase exponencial de crecimiento En esta tabla sólo se muestran los valores M. La información completa de cada gen se encuentra en los archivos incluidos en el CD adjunto.

226

Anexo IV

Tabla A12. Patrón de expresión génica global de Salmonella enterica serovar Typhimurium A Nombre del gen STM0002 STM0002 STM0003 STM0003 STM0004 STM0004 STM0005 STM0005 STM0006 STM0006 STM0008 STM0008 STM0009 STM0009 STM0010 STM0010 STM0011 STM0011 STM0012 STM0012 STM0013 STM0013 STM0014 STM0014 STM0015 STM0015 STM0016 STM0016 STM0017 STM0017 STM0018 STM0018 STM0019 STM0019 STM0020 STM0020 STM0028 STM0028 STM0028,1n STM0028,1n STM0029 STM0029 STM0030 STM0030 STM0031 STM0031 STM0032 STM0032 STM0033 STM0033

thrA thrA thrB thrB thrC thrC yaaA yaaA yaaJ yaaJ mogA mogA yaaH yaaH htgA htgA yaaI yaaI dnaK dnaK dnaJ dnaJ STM0014 STM0014 STM0015 STM0015 STM0016 STM0016 STM0017 STM0017 STM0018 STM0018 STM0019 STM0019 STM0020 STM0020 bcfH bcfH STM0028,1n STM0028,1n STM0029 STM0029 STM0030 STM0030 STM0031 STM0031 STM0032 STM0032 STM0033 STM0033

B

C

M

M

M

0,37 0,32 -1,30 1,02 -1,33 0,80 -1,05 -0,55 -1,38 0,01 -1,97 -0,46 -0,51 -0,17 -1,44 -2,52 -0,85 0,40 -1,65 -0,63 -1,20 0,19 -1,39 -1,23 -0,43 -0,16 0,07 1,25 0,88 2,62 -0,36 0,60 1,64 2,22 0,16 1,90 -0,46 -0,19 0,01 -0,63 0,97 2,33 -0,14 -0,35 1,44 3,17 -0,39 0,71 -0,59 0,51

-0,54 -0,15 -0,06 -0,35 -0,57 0,32 -0,38 -0,37 -1,07 -1,66 -0,90 -0,38 -0,08 0,38 -0,37 -1,54 -1,09 -0,78 0,28 0,31 0,10 -0,46 -0,32 -0,87 -1,54 -1,35 -1,10 0,03 -0,51 -0,33 0,12 -0,97 -0,52 -1,31 -0,22 -0,85 -0,23 -0,28 0,10 -0,49 -0,22 -0,24 0,01 0,33 -0,07 0,79 0,77 -0,22 0,15 0,41

-1,81 -2,17 -0,77 -1,07 -1,27 -1,45 -1,30 -0,48 -1,66 -0,94 -1,43 -1,11 1,71 1,91 -0,30 -3,61 -0,36 -0,80 -1,60 -1,17 -1,66 -1,52 0,05 -1,62 -0,83 -1,73 -0,09 -0,41 0,49 0,55 -0,71 -0,15 -0,74 0,11 -0,94 0,09 -0,62 -2,41 0,26 0,25 0,44 1,30 0,18 0,19 2,69 3,19 -0,12 0,40 -0,17 0,64

A Nombre del gen STM0034 STM0034 STM0035 STM0035 STM0036 STM0036 STM0037 STM0037 STM0038 STM0038 STM0039 STM0039 STM0040 STM0040 STM0041 STM0041 STM0042 STM0042 STM0043 STM0043 STM0044 STM0044 STM0045 STM0045 STM0046 STM0046 STM0047 STM0047 STM0048 STM0048 STM0049 STM0049 STM0050 STM0050 STM0051 STM0051 STM0052 STM0052 STM0053 STM0053 STM0054 STM0054 STM0054 STM0054 STM0056 STM0056 STM0057 STM0057 STM0058 STM0058

228

STM0034 STM0034 STM0035 STM0035 STM0036 STM0036 STM0037 STM0037 STM0038 STM0038 nhaA nhaA nhaR nhaR STM0041 STM0041 STM0042 STM0042 rpsT rpsT yaaY yaaY ribF ribF ileS ileS lspA lspA slpA slpA lytB lytB STM0050 STM0050 rihC rihC STM0052 STM0052 STM0053 STM0053 STM0054 STM0054 STM0054 STM0054 STM0056 STM0056 STM0057 STM0057 citC2 citC2

B

C

M

M

M

-0,48 6,46 0,26 1,73 -0,02 0,70 -0,25 2,22 -1,39 0,14 -0,78 -0,42 -0,32 0,72 -0,50 0,77 -0,57 1,26 -3,57 -3,16 -2,28 -1,95 -1,51 -0,96 -2,56 -1,64 -1,98 -1,85 -1,40 0,64 -2,41 -1,58 -0,84 -0,01 0,04 1,05 0,23 1,12 0,52 -1,35 1,62 1,84 2,08 3,17 3,11 3,60 0,78 1,38 -1,08 -0,29

-1,70 0,86 0,32 0,14 -1,00 0,83 -0,57 -0,54 -0,43 0,17 1,27 1,19 1,48 1,64 1,48 1,72 -0,49 -0,39 -1,89 -2,04 -1,08 -1,51 -0,87 -0,20 -0,57 -0,69 -0,28 -0,07 -0,59 -0,98 0,23 -0,58 0,24 0,06 0,69 0,71 -0,15 -0,24 -0,28 0,44 0,58 0,40 -0,73 -0,09 -1,41 -1,78 -1,36 -1,45 0,58 -0,50

0,04 1,89 -0,03 0,99 -0,73 1,34 -0,30 0,84 -0,72 0,19 -1,42 -1,29 -1,74 -0,43 -1,38 0,19 0,36 1,21 -3,41 -4,38 -1,65 -1,21 -2,83 -2,37 -3,04 -2,46 -2,88 -2,94 -2,00 -1,36 -2,52 -1,94 -0,38 -0,01 -0,73 -0,16 -0,33 0,52 -0,33 -0,90 -0,36 -0,15 -0,08 0,26 -1,64 -0,19 0,32 0,39 -0,64 -0,61

Anexo IV

STM0059 STM0059 STM0060 STM0060 STM0061 STM0061 STM0062 STM0062 STM0063 STM0063 STM0064 STM0064 STM0066 STM0066 STM0067 STM0067 STM0068 STM0068 STM0069 STM0069 STM0070 STM0070 STM0071 STM0071 STM0072 STM0072 STM0073 STM0073 STM0074 STM0074 STM0075 STM0075 STM0076 STM0076 STM0077 STM0077 STM0078 STM0078 STM0079 STM0079 STM0080 STM0080 STM0081 STM0081 STM0082 STM0082 STM0084 STM0084 STM0085 STM0085 STM0086 STM0086 STM0087 STM0087 STM0088

citD2 citD2 citE2 citE2 citF2 citF2 citX2 citX2 citG2 citG2 dapB dapB carA carA carB carB caiF caiF caiE caiE caiD caiD caiC caiC caiB caiB caiA caiA caiT caiT fixA fixA fixB fixB fixC fixC fixX fixX yaaU yaaU STM0080 STM0080 STM0081 STM0081 STM0082 STM0082 STM0084 STM0084 yabF yabF kefC kefC folA folA apaH

0,67 1,32 0,90 1,27 -0,01 2,35 -0,07 0,79 -0,73 -0,06 -0,31 -0,57 -1,19 -1,19 -1,33 -0,44 3,59 1,07 0,61 2,37 0,66 1,61 -0,24 1,55 -0,06 0,46 -0,19 0,56 -0,65 -0,89 0,73 1,58 -1,75 0,80 0,89 1,23 0,88 1,97 0,43 1,71 0,72 1,98 1,80 3,40 0,52 1,95 -0,77 0,13 -1,09 -0,52 1,10 1,58 0,74 0,54 -0,03

0,08 -0,21 0,17 -0,63 -0,56 -0,71 -0,21 -0,51 -0,32 -0,81 0,11 -0,49 1,05 0,90 0,06 0,51 3,86 -0,01 0,23 -0,35 0,59 0,19 -0,28 -0,83 1,26 0,39 -0,31 0,25 0,39 -1,86 0,27 0,23 -1,58 -1,59 -0,99 -0,22 1,03 -1,25 0,29 -0,65 1,23 -0,08 0,70 0,72 1,91 0,55 0,42 -0,32 -0,45 -1,00 -1,45 -1,14 -0,12 -0,05 0,06

-0,45 -0,50 0,14 1,17 -0,57 -1,04 -0,65 0,22 1,89 1,29 -1,10 -2,12 -1,70 -0,74 -1,00 -1,89 5,01 2,19 0,29 2,43 -0,24 0,31 -0,85 1,07 0,24 -0,21 -0,79 0,00 -0,29 -0,82 0,32 2,13 -0,64 -0,65 0,47 1,51 1,46 0,31 0,49 1,20 1,68 2,88 1,03 1,09 0,46 1,38 -1,23 -0,45 0,49 0,96 -0,61 -0,51 -1,34 -0,93 -0,72

STM0088 STM0089 STM0089 STM0090 STM0090 STM0091 STM0091 STM0092 STM0092 STM0093 STM0093 STM0094 STM0094 STM0095 STM0095 STM0096 STM0096 STM0097 STM0097 STM0098 STM0098 STM0100 STM0100 STM0101 STM0101 STM0102 STM0102 STM0103 STM0103 STM0104 STM0104 STM0105 STM0105 STM0106 STM0106 STM0107 STM0107 STM0108 STM0108 STM0109 STM0109 STM0110 STM0110 STM0111 STM0111 STM0112 STM0112 STM0113 STM0113 STM0115 STM0115 STM0116 STM0116 STM0117 STM0117

229

apaH apaG apaG ksgA ksgA pdxA pdxA surA surA imp imp djlA djlA rluA rluA hepA hepA polB polB STM0098 STM0098 STM0100 STM0100 araD araD araA araA araB araB araC araC yabI yabI yabJ yabJ thiP thiP tbpA tbpA yabN yabN leuD leuD leuC leuC leuB leuB leuA leuA leuO leuO ilvI ilvI ilvH ilvH

0,44 -2,02 -1,65 -2,64 -1,63 -3,34 -3,52 -2,57 -1,46 -1,96 -1,95 0,65 1,63 -1,97 1,10 -1,61 -1,26 -1,34 0,13 -0,51 0,76 0,42 2,52 0,38 0,33 -0,32 0,94 1,80 2,58 -0,24 3,51 -1,33 -0,41 -1,37 0,70 0,24 -0,02 -0,47 0,23 -1,23 -0,30 -0,34 -0,70 2,08 2,12 -0,73 -0,67 1,47 1,77 0,27 0,26 1,28 1,32 -0,12 1,05

-0,03 0,39 -0,29 -1,19 -0,69 -2,10 -2,09 -1,02 -1,34 -0,77 -0,81 -0,24 -0,18 -0,68 -0,10 -1,39 -1,20 -1,46 -1,28 -0,70 -0,02 0,10 -0,04 1,32 -0,09 0,15 -0,68 3,84 3,52 0,94 -0,09 0,02 -0,22 -0,11 0,21 0,53 0,03 0,81 0,82 -0,18 -0,38 0,72 0,28 1,12 0,57 0,74 0,80 2,00 2,00 -1,56 -1,74 0,90 0,82 0,20 0,17

-0,03 -0,22 -0,66 -1,20 -0,91 -2,26 -1,81 -3,42 -2,92 -1,88 -1,93 1,70 2,29 -1,36 1,12 -3,23 -1,82 -0,45 1,06 -1,41 0,02 -0,64 0,23 1,04 0,75 -0,77 0,20 -0,08 2,41 -0,42 1,92 -0,55 -0,62 -0,55 -0,69 0,73 2,04 -1,79 -1,02 -0,10 -0,53 -0,53 -2,47 -1,24 0,70 -1,06 -1,02 3,12 3,40 -0,49 -0,31 -0,77 0,05 -0,65 0,11

Anexo IV

STM0118 STM0118 STM0119 STM0119 STM0120 STM0120 STM0121 STM0121 STM0122 STM0122 STM0123 STM0123 STM0124 STM0124 STM0125 STM0125 STM0126 STM0126 STM0127 STM0127 STM0128 STM0128 STM0129 STM0129 STM0130 STM0130 STM0131 STM0131 STM0132 STM0132 STM0133 STM0133 STM0134 STM0134 STM0135 STM0135 STM0136 STM0136 STM0137 STM0137 STM0138 STM0138 STM0139 STM0139 STM0140 STM0140 STM0141 STM0141 STM0145 STM0145 STM0146 STM0146 STM0147 STM0147 STM0148

fruR fruR yabB yabB mraW mraW ftsL ftsL ftsI ftsI murE murE murF murF mraY mraY murD murD ftsW ftsW murG murG murC murC ddl ddl ftsQ ftsQ ftsA ftsA ftsZ ftsZ lpxC lpxC yacA yacA secA secA mutT mutT yacG yacG yacF yacF coaE coaE guaC guaC nadC nadC ampD ampD ampE ampE STM0148

-1,35 -0,83 -1,22 -0,94 -1,34 -0,98 -1,24 -0,01 -0,09 0,90 -2,65 -1,91 -2,54 -2,51 -1,68 -1,64 -0,10 -1,15 -1,91 -2,65 -2,37 -2,25 -2,89 -2,00 -2,37 -0,92 -0,62 0,37 -2,31 -0,61 -1,90 -1,12 -1,15 -0,27 -1,19 -0,89 -1,01 -0,05 -1,42 -0,13 -0,97 -0,18 -1,37 -0,30 -1,17 -0,51 -1,16 -0,41 -0,64 -0,25 -0,35 0,21 -0,32 -0,06 -0,19

-1,00 -1,35 -0,58 -0,43 -0,65 -0,18 -0,52 -0,79 -1,07 -1,17 -2,15 -2,25 -2,56 -2,53 -2,24 -2,17 -0,32 -1,56 -1,82 -2,07 -1,57 -1,61 -1,87 -1,43 -0,68 -0,30 -0,01 0,19 -0,21 -0,42 0,35 0,33 1,37 1,16 -1,07 -0,93 -0,99 -0,34 -0,26 -0,80 -0,68 -0,95 -1,07 -1,07 -0,86 -0,28 -0,06 -0,12 -0,75 -0,73 0,84 0,90 0,27 0,62 0,37

-0,87 -0,28 -1,77 -1,39 -1,07 -0,56 -0,94 0,08 -0,39 0,00 -3,15 -2,76 -2,98 -4,46 -3,27 -2,01 -1,44 -1,89 -1,90 -1,89 -1,34 -2,16 -2,47 -2,42 -2,23 -2,57 -2,83 -1,75 -2,36 -1,62 -2,15 -2,35 1,35 1,61 -1,00 -1,05 -2,00 -0,70 -1,26 -1,33 -1,00 -0,39 -1,48 -1,52 -2,33 -1,32 -0,15 0,44 -0,22 -0,21 -0,30 -0,09 -0,20 -0,59 0,13

STM0148 STM0149 STM0149 STM0150 STM0150 STM0151 STM0151 STM0152 STM0152 STM0153 STM0153 STM0154 STM0154 STM0155 STM0155 STM0156 STM0156 STM0157 STM0157 STM0159 STM0159 STM0160 STM0160 STM0161 STM0161 STM0162 STM0162 STM0163 STM0163 STM0164 STM0164 STM0165 STM0165 STM0166 STM0166 STM0167 STM0167 STM0168 STM0168 STM0170 STM0170 STM0171 STM0171 STM0172 STM0172 STM0173 STM0173 STM0174 STM0174 STM0178 STM0178 STM0179 STM0179 STM0180 STM0180

230

STM0148 STM0149 STM0149 aroP aroP pdhR pdhR aceE aceE aceF aceF lpdA lpdA STM0155 STM0155 STM0156 STM0156 yacH yacH STM0159 STM0159 yacL yacL kdgT kdgT STM0162 STM0162 STM0163 STM0163 STM0164 STM0164 speD speD speE speE yacC yacC cueO cueO hpt hpt yadF yadF yadG yadG yadH yadH stiH stiH yadI yadI yadE yadE panD panD

-0,53 0,95 1,54 0,51 0,89 -1,93 -0,48 -3,66 -2,30 -2,97 -2,82 -3,28 -2,62 -0,78 0,41 -1,57 -0,14 -1,64 -1,50 1,82 2,06 0,78 0,12 1,75 2,11 0,24 1,33 -0,28 0,51 -1,05 -1,71 -1,97 -0,70 -4,00 -3,83 -1,57 -1,16 -0,22 -0,19 -2,32 -1,55 1,19 1,76 -0,67 -0,26 1,78 0,60 1,28 1,26 -0,60 0,28 -1,34 -0,16 -0,85 -0,45

-0,83 0,55 -0,32 -0,60 -0,86 -1,36 -0,77 -0,71 -0,43 -2,15 -1,51 -0,85 -0,64 -1,68 -1,74 -1,34 -1,74 -0,53 -2,30 1,32 0,41 -0,69 -0,59 -0,33 0,25 0,05 0,06 0,40 -0,20 -0,67 -0,61 -1,04 -1,54 -2,52 -2,19 -1,04 -0,23 0,99 0,51 -0,06 0,18 0,83 1,18 -1,17 -0,43 -0,71 -0,85 -0,18 -0,49 0,63 0,30 -0,65 0,01 -0,12 0,05

0,47 -0,85 0,90 -0,31 0,31 -3,09 -2,50 -2,64 -3,06 -3,19 -4,58 -3,35 -2,72 -2,03 -1,02 -1,54 -1,38 -1,77 -1,84 3,59 3,96 -0,13 -0,39 0,71 1,22 -0,31 0,65 1,16 2,15 -1,86 -1,42 -1,74 -1,97 -5,00 -5,24 -2,97 -1,67 0,25 0,56 -2,99 -2,59 2,11 1,33 -0,62 -1,08 -0,26 -0,70 -0,69 0,50 1,25 2,50 -1,56 -1,42 -0,77 0,58

Anexo IV

STM0181 STM0181 STM0182 STM0182 STM0183 STM0183 STM0184 STM0184 STM0185 STM0185 STM0186 STM0186 STM0187 STM0187 STM0188 STM0188 STM0189 STM0189 STM0190 STM0190 STM0198 STM0198 STM0199 STM0199 STM0200 STM0200 STM0201 STM0201 STM0202 STM0202 STM0203 STM0203 STM0204,S STM0204,S STM0205 STM0205 STM0206 STM0206 STM0207 STM0207 STM0208 STM0208 STM0209 STM0209 STM0210 STM0210 STM0211 STM0211 STM0212 STM0212 STM0213 STM0213 STM0214 STM0214 STM0215

panC panC panB panB folK folK pcnB pcnB yadB yadB dksA dksA sfsA sfsA ligT ligT hrpB hrpB mrcB mrcB stfE stfE stfF stfF stfG stfG STM0201 STM0201 hemL hemL yadQ yadQ yadR yadR yadS yadS btuF btuF pfs pfs dgt dgt htrA htrA cdaR cdaR yaeH yaeH STM0212 STM0212 dapD dapD glnD glnD map

-1,92 -1,78 -1,47 -1,00 -2,06 -0,82 -2,34 -1,20 -1,56 -0,59 -1,61 -0,47 -1,19 -1,23 -1,59 -1,65 -0,91 0,22 -1,70 -0,52 -0,35 -0,51 0,62 1,54 -1,11 -0,86 -1,22 -0,39 -0,81 -0,69 -0,77 0,54 -1,91 -1,80 -0,39 0,35 -1,03 -0,36 -1,50 -0,65 -0,88 0,60 -0,45 0,33 -0,42 0,34 -0,77 0,18 -1,63 -0,68 -0,84 -0,45 -1,98 -0,39 -2,62

-1,54 -1,18 -1,44 -1,20 -1,31 -1,30 -1,29 -1,32 -1,69 -0,75 -0,87 -0,08 0,35 0,23 -0,79 -0,91 -0,22 -0,49 -0,83 -0,25 -0,22 -0,01 0,37 -1,03 -1,64 -1,14 -1,21 -0,71 -1,16 -1,16 -0,03 -0,45 -0,15 -0,22 1,00 0,91 -0,08 0,27 -0,15 -0,38 0,68 0,63 1,88 2,01 1,39 1,36 0,62 0,92 -0,21 0,05 0,86 1,11 -0,29 -0,95 -0,61

-2,95 -2,13 -1,12 -1,65 -1,07 -1,21 -3,86 -3,76 -1,61 -1,50 -0,29 -0,36 3,06 3,57 -0,93 -1,06 -2,14 -1,11 -2,18 -1,57 -0,50 0,78 -0,07 2,51 -1,53 -0,72 -0,59 0,06 -1,79 -0,90 -0,61 -0,40 -1,52 -2,21 -2,19 -1,69 -1,72 -2,03 -2,52 -1,23 -0,87 -0,17 0,69 0,53 0,85 1,24 0,68 1,56 -0,66 -0,34 -1,05 -0,39 -1,24 -3,55 -2,01

STM0215 STM0216 STM0216 STM0217 STM0217 STM0218 STM0218 STM0219 STM0219 STM0220 STM0220 STM0221 STM0221 STM0222 STM0222 STM0223 STM0223 STM0224 STM0224 STM0225 STM0225 STM0226 STM0226 STM0227 STM0227 STM0228 STM0228 STM0229 STM0229 STM0230 STM0230 STM0231 STM0231 STM0232 STM0232 STM0233 STM0233 STM0234 STM0234 STM0235 STM0235 STM0236 STM0236 STM0237 STM0237 STM0238 STM0238 STM0239 STM0239 STM0240 STM0240 STM0242 STM0242 STM0243 STM0243

231

map rpsB rpsB tsf tsf pyrH pyrH frr frr dxr dxr uppS uppS cdsA cdsA yaeL yaeL yaeT yaeT hlpA hlpA lpxD lpxD fabZ fabZ lpxA lpxA lpxB lpxB rnhB rnhB dnaE dnaE accA accA STM0233 STM0233 ldcC ldcC yaeR yaeR mesJ mesJ rof rof yaeP yaeP yaeQ yaeQ yaeJ yaeJ proS proS yaeB yaeB

-0,04 -2,62 -1,78 -2,78 -1,50 -2,57 -0,33 -1,96 -1,34 -2,34 -1,46 -2,15 -0,91 -0,05 -1,77 -0,76 -0,62 -3,71 -2,87 -4,56 -3,82 -2,60 -2,61 -0,87 -0,82 -0,92 -0,77 -1,88 -1,29 -3,24 -2,66 -2,21 -2,46 -2,84 -1,64 -0,92 0,15 -0,70 0,19 -0,03 0,62 -0,93 0,49 -1,10 -0,18 -1,58 -1,30 -1,47 -1,07 -1,07 0,33 -0,10 -0,10 -1,17 -0,09

-0,14 -0,84 -1,18 -1,44 -1,19 -0,72 -2,41 -0,27 -0,29 -1,68 -1,20 -1,03 -1,15 -1,06 -0,71 -0,51 -0,74 -1,68 -1,53 -2,62 -1,38 -0,46 -0,49 -0,54 -0,39 -0,65 -0,17 -1,27 -1,50 -1,94 -1,96 -1,60 -1,68 -1,09 -1,46 -0,93 -0,87 0,17 0,20 -0,54 0,11 -0,93 -0,72 -0,55 -0,48 -0,58 0,06 -0,96 -1,70 -0,09 -0,03 -1,88 -2,36 -0,83 -1,00

-0,77 -4,09 -5,33 -4,49 -3,89 -0,22 -0,70 -1,37 -0,93 -2,01 -2,26 -2,30 -2,43 -2,27 -1,44 -1,49 -1,92 -3,98 -3,53 -4,87 -5,05 -2,22 -2,13 -2,28 -2,47 -1,61 -2,04 -2,76 -2,11 -2,99 -2,72 -3,08 -2,56 -2,70 -1,26 0,08 -0,79 -0,92 0,39 0,17 0,77 -1,40 0,16 -1,10 -0,46 -0,09 -0,07 -0,64 -1,74 -0,65 0,35 -1,32 -0,22 -2,36 -1,81

Anexo IV

STM0244 STM0244 STM0245 STM0245 STM0246 STM0246 STM0247 STM0247 STM0248 STM0248 STM0249 STM0249 STM0252 STM0252 STM0255 STM0255 STM0256 STM0256 STM0257 STM0257 STM0258 STM0258 STM0259 STM0259 STM0260 STM0260 STM0261 STM0261 STM0262 STM0262 STM0263 STM0263 STM0264 STM0264 STM0266 STM0266 STM0267 STM0267 STM0268 STM0268 STM0269 STM0269 STM0270 STM0270 STM0271 STM0271 STM0272 STM0272 STM0273 STM0273 STM0274 STM0274 STM0275,s STM0275,s STM0276

rcsF rcsF yaeC yaeC yaeE yaeE abc abc yaeD yaeD rrsH rrsH rrlH rrlH yafB yafB yafC yafC STM0257 STM0257 yafD yafD yafE yafE dniR dniR gloB gloB yafS yafS rnhA rnhA dnaQ dnaQ STM0266 STM0266 STM0267 STM0267 STM0268 STM0268 STM0269 STM0269 STM0270 STM0270 STM0271 STM0271 STM0272 STM0272 STM0273 STM0273 STM0274 STM0274 STM0275,s STM0275,s STM0276

-2,60 -1,40 -1,46 -0,24 -1,87 -1,26 -1,81 -0,98 1,31 1,15 -1,59 -1,37 -2,35 -2,08 -1,18 0,20 -1,47 -1,52 -0,30 -1,48 -0,84 -0,44 -0,17 0,45 3,15 -0,54 -0,83 0,35 -0,87 0,02 0,63 0,58 -1,31 1,70 -0,34 -0,51 -0,98 -1,06 0,24 0,18 -0,24 0,19 -0,59 -1,19 -0,15 1,20 0,12 0,47 0,14 0,43 -0,09 -0,75 -0,20 -1,40 1,24

-1,54 -1,04 -0,36 -0,34 -0,71 0,40 -0,95 -0,89 0,37 0,16 0,93 0,69 0,75 1,16 -0,95 -1,14 -1,20 -1,33 -0,33 -0,86 0,72 0,73 1,36 1,48 2,31 2,00 1,10 0,97 0,08 -0,53 0,19 -0,09 -0,82 -0,58 -0,50 -0,75 -0,25 -1,42 -2,76 -2,70 -0,42 -0,38 -0,44 -0,71 0,69 0,40 -0,52 0,55 -0,16 -0,22 -0,07 -0,96 0,34 -1,23 0,47

-2,07 -1,61 -1,29 -1,27 -0,63 -0,30 -0,75 -0,44 0,35 1,23 0,26 0,06 0,24 0,06 0,12 0,71 0,23 0,30 -0,26 -1,55 -0,34 0,35 -1,00 -0,17 2,04 0,19 -1,62 -0,18 0,74 -0,12 -1,15 -0,72 -0,54 0,27 -0,92 -0,52 -0,27 -0,22 -1,16 -0,31 -1,37 -0,77 -0,16 -0,47 -0,22 1,44 -0,43 0,73 -0,62 0,44 0,93 -0,28 -0,66 0,15 -0,56

STM0276 STM0277 STM0277 STM0278 STM0278 STM0279 STM0279 STM0280 STM0280 STM0281 STM0281 STM0282 STM0282 STM0283 STM0283 STM0284 STM0284 STM0285 STM0285 STM0286 STM0286 STM0287 STM0287 STM0288 STM0288 STM0289 STM0289 STM0290 STM0290 STM0291 STM0291 STM0292 STM0292 STM0293 STM0293 STM0294 STM0294 STM0294,1N STM0294,1N STM0295 STM0295 STM0302 STM0302 STM0303 STM0303 STM0304 STM0304 STM0306 STM0306 STM0307 STM0307 STM0308 STM0308 STM0309 STM0309

232

STM0276 STM0277 STM0277 STM0278 STM0278 STM0279 STM0279 STM0280 STM0280 STM0281 STM0281 STM0282 STM0282 STM0283 STM0283 STM0284 STM0284 STM0285 STM0285 STM0286 STM0286 STM0287 STM0287 STM0288 STM0288 STM0289 STM0289 STM0290 STM0290 STM0291 STM0291 STM0292 STM0292 STM0293 STM0293 STM0294 STM0294 STM0294,1N STM0294,1N STM0295 STM0295 safD safD ybeJ ybeJ sinR sinR STM0306 STM0306 STM0307 STM0307 yafV yafV fadE fadE

3,14 1,01 0,71 0,03 0,69 3,03 3,46 1,88 2,65 1,45 2,18 -0,49 0,45 -0,73 0,45 -0,86 -1,35 -0,73 0,12 1,08 1,76 0,71 1,15 0,71 1,18 0,80 1,76 -0,65 1,48 0,14 1,31 -1,19 0,86 0,27 0,30 0,70 1,39 3,26 3,33 3,90 3,27 0,30 0,73 0,79 1,20 -0,56 -0,76 0,66 1,71 -1,07 1,11 -0,26 1,87 0,58 0,67

-0,42 -0,13 0,08 0,34 1,12 -1,71 -1,78 0,22 -0,04 -0,48 0,66 -0,03 -0,85 -0,13 -0,61 0,79 -0,10 -0,70 -0,87 0,67 0,07 0,79 0,83 -0,94 -0,96 -0,52 -0,57 -1,33 -2,06 1,71 1,78 0,86 1,71 1,55 0,93 1,10 0,84 1,15 -0,13 2,83 1,66 1,67 1,31 -0,64 -0,69 -1,11 -0,63 0,29 0,37 1,14 1,28 0,14 0,80 0,74 0,78

0,21 -0,23 0,36 0,55 1,95 0,19 -0,03 2,64 3,05 1,77 1,28 -0,35 0,05 -0,04 -0,37 0,42 -0,17 -1,01 0,45 0,76 2,64 0,36 -0,05 -1,22 -0,40 0,28 0,78 -0,53 -0,10 0,97 1,12 -0,64 0,58 -0,73 0,00 1,08 1,20 3,76 3,62 5,03 5,44 -1,07 -0,06 -0,69 0,18 -0,71 -0,33 -2,02 -0,18 -0,41 1,69 -0,96 0,49 1,13 1,60

Anexo IV

STM0310 STM0310 STM0311 STM0311 STM0312 STM0312 STM0313 STM0313 STM0315 STM0315 STM0316 STM0316 STM0317 STM0317 STM0318 STM0318 STM0319 STM0319 STM0320 STM0320 STM0321 STM0321 STM0322 STM0322 STM0323 STM0323 STM0325 STM0325 STM0327 STM0327 STM0328,s STM0328,s STM0329 STM0329 STM0330 STM0330 STM0331 STM0331 STM0332 STM0332 STM0333 STM0333 STM0335 STM0335 STM0337 STM0337 STM0341 STM0341 STM0342 STM0342 STM0343 STM0343 STM0344 STM0344 STM0345

ghmA ghmA yafJ yafJ yafK yafK dinP dinP prfH prfH pepD pepD gpt gpt yafA yafA crl crl phoE phoE proB proB proA proA thrW thrW STM0325 STM0325 STM0327 STM0327 STM0328,s STM0328,s STM0329 STM0329 STM0330 STM0330 STM0331 STM0331 STM0332 STM0332 STM0333 STM0333 STM0335 STM0335 stbD stbD STM0341 STM0341 STM0342 STM0342 STM0343 STM0343 STM0344 STM0344 STM0345

-2,38 -1,29 -0,85 -0,98 -2,23 -1,54 0,81 2,24 -0,44 -0,34 -1,30 -0,57 -1,50 -0,47 -1,09 -0,45 -0,60 0,66 -1,48 -0,22 -1,72 -0,71 -0,77 0,23 -2,02 -0,40 -0,29 1,26 0,21 1,25 0,05 1,54 1,08 1,06 0,83 0,59 -0,97 0,75 -0,20 0,89 -0,32 -0,16 -0,45 0,00 0,10 1,85 0,05 0,48 0,18 0,40 0,04 0,71 -0,67 0,80 0,77

0,19 -0,54 -0,08 -0,19 -0,62 -0,69 0,53 -0,29 0,47 0,87 1,08 1,67 -0,97 -1,26 -0,37 -0,49 -0,74 -0,34 -0,23 -0,53 -0,42 -0,61 -0,16 -0,29 -1,57 -1,07 -0,58 -0,81 1,29 1,22 -1,24 -1,03 1,15 0,52 -1,39 -1,41 -0,17 -0,95 0,30 -1,63 -1,92 -0,80 -0,67 -0,84 0,62 0,21 0,17 1,03 0,20 0,12 0,88 0,56 0,64 -0,05 0,46

-1,13 -0,88 -1,14 -0,62 -1,97 -2,63 0,25 0,76 -2,49 -1,92 -1,39 -1,02 -1,73 -0,95 -0,36 0,58 -0,62 -0,74 -0,49 -0,23 -3,13 -2,11 -0,69 0,19 3,03 3,25 -1,23 -0,13 1,30 3,05 -0,48 1,14 2,41 2,79 0,48 1,81 -0,66 0,80 1,46 -2,06 -1,07 -0,67 -0,67 0,57 0,83 2,19 -0,20 -0,33 1,48 0,87 -0,05 -0,09 -0,26 -0,70 -0,97

STM0345 STM0346 STM0346 STM0347 STM0347 STM0348 STM0348 STM0349 STM0349 STM0350,S STM0350,S STM0351 STM0351 STM0352,S STM0352,S STM0353 STM0353 STM0354 STM0354 STM0355 STM0355 STM0356 STM0356 STM0357 STM0357 STM0358,S STM0358,S STM0359 STM0359 STM0360 STM0360 STM0361 STM0361 STM0363 STM0363 STM0364 STM0364 STM0365 STM0365 STM0366 STM0366 STM0367 STM0367 STM0368 STM0368 STM0369 STM0369 STM0370 STM0370 STM0371 STM0371 STM0372 STM0372 STM0373 STM0373

233

STM0345 STM0346 STM0346 STM0347 STM0347 STM0348 STM0348 STM0349 STM0349 STM0350,S STM0350,S STM0351 STM0351 STM0352,S STM0352,S STM0353 STM0353 STM0354 STM0354 STM0355 STM0355 STM0356 STM0356 mod mod res res STM0359 STM0359 STM0360 STM0360 STM0361 STM0361 STM0363 STM0363 foxA foxA yahN yahN yahO yahO prpR prpR prpB prpB prpC prpC prpD prpD prpE prpE hemB hemB yaiU yaiU

1,03 -0,07 0,32 -0,82 0,39 -0,66 -0,24 0,37 1,42 0,43 1,31 0,03 0,64 0,46 1,71 0,75 1,99 0,38 0,80 0,79 0,84 -1,07 -1,92 -0,62 -0,57 -0,98 0,47 2,08 2,05 -0,78 -0,88 -0,72 0,35 -0,62 -0,10 -0,09 0,21 -0,08 0,75 1,28 2,24 -0,53 -0,15 0,72 2,69 1,29 2,07 -0,30 0,36 -0,66 -0,36 -1,31 -0,95 0,31 2,24

0,02 0,67 0,09 0,01 -0,75 0,50 0,45 0,48 0,52 0,19 -0,48 -0,23 -0,87 -0,57 -0,33 0,59 -0,06 -0,57 -0,63 0,10 -0,29 -1,17 -1,21 -1,19 -1,40 -0,27 -0,96 -1,47 -1,62 0,82 0,85 0,22 0,58 -0,17 0,98 0,22 0,68 0,65 1,25 2,60 1,97 1,36 1,52 1,18 0,92 -0,09 -0,17 0,34 -0,95 -0,04 0,04 0,16 -0,03 0,96 0,56

-0,15 0,11 0,68 -0,60 0,21 -0,76 0,34 -1,05 0,60 -0,97 0,76 0,64 0,24 -0,69 1,13 0,18 1,08 -0,42 0,84 -0,24 1,29 -0,97 -0,97 -0,74 -0,47 0,06 0,42 3,01 3,93 3,46 3,79 1,83 2,15 -0,41 0,07 -0,19 0,04 0,38 0,41 4,47 5,20 2,68 3,10 0,63 2,37 -0,35 -1,32 0,47 -1,42 -1,52 -0,22 -0,19 -0,43 0,24 1,66

Anexo IV

STM0374 STM0374 STM0375 STM0375 STM0376 STM0376 STM0377 STM0377 STM0378 STM0378 STM0379 STM0379 STM0380 STM0380 STM0381 STM0381 STM0382 STM0382 STM0383 STM0383 STM0384 STM0384 STM0385 STM0385 STM0386 STM0386 STM0387 STM0387 STM0388 STM0388 STM0389 STM0389 STM0390 STM0390 STM0391 STM0391 STM0392 STM0392 STM0393 STM0393 STM0394 STM0394 STM0395 STM0395 STM0396 STM0396 STM0397 STM0397 STM0398 STM0398 STM0399 STM0399 STM0400 STM0400 STM0401

yaiV yaiV ampH ampH sbmA sbmA yaiW yaiW yaiY yaiY yaiZ yaiZ ddl ddl STM0381 STM0381 STM0382 STM0382 yaiB yaiB psiF psiF yaiC yaiC proC proC yaiI yaiI aroL aroL yaiA yaiA aroM aroM yaiE yaiE rdgC rdgC yajF yajF araJ araJ sbcC sbcC sbcD sbcD phoB phoB phoR phoR brnQ brnQ proY proY malZ

0,48 -0,56 0,26 0,02 -1,23 -0,26 1,53 2,32 -0,12 1,73 -1,21 0,53 -1,31 0,01 -0,17 1,31 -0,46 0,80 0,03 0,91 0,29 1,26 -1,18 0,24 -1,23 -0,34 -0,85 0,00 -0,38 0,32 0,72 0,23 -0,50 -0,67 -0,88 -0,37 1,36 1,73 0,59 1,18 -1,51 0,20 1,55 2,67 -1,49 -0,09 0,13 1,19 -0,77 -0,18 1,02 1,50 -2,21 -1,98 -1,31

1,33 0,63 0,92 0,17 -0,34 -0,17 1,40 1,09 1,31 0,75 -0,50 -0,71 -0,27 -0,31 0,13 -0,77 -0,15 0,25 0,80 0,57 1,17 1,64 1,19 1,58 0,80 1,50 0,01 -0,20 -0,13 0,07 -0,14 -0,12 0,72 0,44 -0,12 -0,73 -0,03 -0,14 -0,08 -0,04 -0,24 -0,51 -0,45 -0,02 -2,38 -1,15 -0,05 -0,21 -0,34 -0,06 -1,01 -1,59 -1,85 -1,59 0,37

1,55 0,58 1,03 0,27 -1,79 -0,43 0,00 1,88 1,84 2,75 -1,09 0,49 -1,29 -0,29 0,58 3,01 -0,04 0,56 -1,66 -1,84 1,59 1,85 -1,65 -0,44 -0,87 -0,35 -1,63 -0,63 -0,11 0,07 3,03 3,69 0,03 0,27 -0,47 -0,69 -1,19 -0,60 -0,39 0,73 -0,28 -0,45 1,78 4,12 -1,58 -1,65 -0,99 0,52 -0,47 -0,60 -1,31 -0,10 -1,91 -1,53 -1,47

STM0401 STM0402 STM0402 STM0403 STM0403 STM0404 STM0404 STM0405 STM0405 STM0406 STM0406 STM0407 STM0407 STM0408 STM0408 STM0409 STM0409 STM0410 STM0410 STM0411 STM0411 STM0413 STM0413 STM0415 STM0415 STM0416 STM0416 STM0417 STM0417 STM0418 STM0418 STM0419 STM0419 STM0420 STM0420 STM0421 STM0421 STM0422 STM0422 STM0423 STM0423 STM0424 STM0424 STM0425 STM0425 STM0426 STM0426 STM0427 STM0427 STM0428 STM0428 STM0429 STM0429 STM0430 STM0430

234

malZ STM0402 STM0402 yajB yajB queA queA tgt tgt yajC yajC secD secD secF secF STM0409 STM0409 STM0410 STM0410 yajD yajD tsx tsx ybaD ybaD ribD ribD ribH ribH nusB nusB thiL thiL pgpA pgpA yajO yajO dxs dxs ispA ispA xseB xseB thiI thiI phnV phnV phnU phnU phnT phnT phnS phnS phnR phnR

-0,67 -0,64 -0,31 -1,07 -1,04 -1,61 -1,33 -2,46 -1,70 -2,93 -2,85 -2,71 -1,71 -0,43 -0,21 -1,37 -0,91 -0,48 0,58 0,37 0,69 -1,01 -1,47 1,05 0,04 -0,69 0,65 -1,95 -1,57 -1,64 -0,52 -1,87 -0,41 1,35 -0,20 -1,42 0,52 -1,24 -0,68 -3,00 -1,48 -2,45 -2,55 -1,38 -1,19 -0,44 0,70 0,43 1,33 -0,07 2,07 -0,70 -0,29 0,98 1,83

0,25 0,01 0,31 0,74 0,82 -1,66 -1,75 -0,70 -0,57 -1,38 -1,34 -0,98 -0,70 -1,16 -0,96 -0,01 -0,92 -0,47 -1,44 0,11 -0,29 -3,11 -3,37 -0,69 -0,67 0,17 0,07 -1,00 -0,91 -0,89 -0,18 -1,10 -0,69 -0,76 -0,72 0,56 -0,49 -0,47 -0,46 -0,95 -0,66 -0,93 -1,09 -1,96 -1,95 -0,19 -0,10 -0,90 -0,58 -0,82 0,04 0,19 -0,63 0,20 -0,23

-1,67 -2,01 -1,98 -1,28 -1,23 -2,33 -2,43 -3,02 -2,69 -2,86 -3,37 -3,11 -3,50 -1,46 -0,70 -0,81 -1,59 -1,34 -2,07 0,16 0,27 -1,81 -2,03 -2,54 -1,84 -2,58 -2,19 -2,21 -1,67 -0,77 -1,37 -1,47 -1,00 1,30 2,04 0,64 0,83 -0,34 0,26 -2,95 -2,01 -2,56 -1,52 -1,71 -1,05 -0,47 -0,25 -0,49 0,13 -0,13 -0,54 -0,48 -0,44 0,95 -0,24

Anexo IV

STM0431 STM0431 STM0432 STM0432 STM0433 STM0433 STM0434 STM0434 STM0435 STM0435 STM0436,S STM0436,S STM0437 STM0437 STM0438 STM0438 STM0439 STM0439 STM0440 STM0440 STM0441 STM0441 STM0442 STM0442 STM0443 STM0443 STM0444 STM0444 STM0445 STM0445 STM0446 STM0446 STM0447 STM0447 STM0448 STM0448 STM0449 STM0449 STM0450 STM0450 STM0451 STM0451 STM0452 STM0452 STM0453 STM0453 STM0454 STM0454 STM0455 STM0455 STM0456 STM0456 STM0457 STM0457 STM0458

phnW phnW phnX phnX thiJ thiJ apbA apbA yajQ yajQ yajR yajR STM0437 STM0437 STM0438 STM0438 cyoE cyoE cyoD cyoD cyoC cyoC cyoB cyoB cyoA cyoA ampG ampG yajG yajG bolA bolA tig tig clpP clpP clpX clpX lon lon hupB hupB cypD cypD ybaV ybaV ybaW ybaW ybaX ybaX ybaE ybaE cof cof STM0458

-0,94 0,17 -0,36 0,97 -0,38 0,71 -0,15 -0,63 0,42 1,29 -0,56 0,15 -0,56 0,80 -1,37 -2,30 -3,45 -2,53 -4,68 -4,30 -3,80 -4,01 -3,65 -2,67 -3,56 -2,42 -1,39 -1,04 -3,46 -2,53 -1,83 -2,32 -3,34 -1,21 -1,27 -0,88 -0,92 -0,28 -2,51 -1,77 -1,63 -1,31 0,61 -0,95 0,18 1,63 0,62 1,48 -0,81 0,54 0,53 0,98 -0,98 1,43 0,68

1,43 1,70 -0,67 -0,59 -0,07 -1,13 0,11 0,40 -0,16 0,33 0,79 0,30 -0,18 0,25 -2,09 -1,95 -2,78 -2,68 -2,68 -2,36 -3,20 -3,12 -2,07 -2,12 -1,25 -1,38 -2,08 -2,01 -1,27 -1,67 -1,43 -1,41 -1,25 -1,07 0,40 0,64 0,25 0,27 0,01 0,15 0,64 0,42 -1,35 -1,17 -0,29 -0,07 -0,55 -0,53 -0,21 -0,99 -1,23 -0,26 0,21 1,82 0,88

1,96 2,96 -0,60 0,66 -0,76 0,62 1,45 0,43 0,18 0,60 0,22 1,14 -0,80 0,31 -1,28 -1,77 -1,21 -1,30 -2,00 -2,03 -1,91 -1,84 -1,59 -1,28 -1,04 -0,68 -1,87 -0,69 -2,00 -2,14 0,79 0,65 -3,66 -1,42 -1,25 -0,76 -0,47 0,29 -1,70 -1,96 -2,64 -1,92 -0,11 -0,65 -0,53 0,89 1,44 2,01 -0,79 0,20 -0,19 0,80 0,05 3,22 -0,37

STM0458 STM0459 STM0459 STM0460 STM0460 STM0461 STM0461 STM0462 STM0462 STM0463 STM0463 STM0464 STM0464 STM0465 STM0465 STM0466 STM0466 STM0467 STM0467 STM0468 STM0468 STM0469 STM0469 STM0470 STM0470 STM0471 STM0471 STM0472 STM0472 STM0473 STM0473 STM0474 STM0474 STM0475 STM0475 STM0476 STM0476 STM0477 STM0477 STM0478 STM0478 STM0479 STM0479 STM0480 STM0480 STM0481 STM0481 STM0482 STM0482 STM0483 STM0483 STM0484 STM0484 STM0485 STM0485

235

STM0458 ybaO ybaO mdlA mdlA mdlB mdlB glnK glnK amtB amtB tesB tesB ybaY ybaY ybaZ ybaZ ffs ffs ylaB ylaB rpmE2 rpmE2 rpmJ2 rpmJ2 ylaC ylaC maa maa hha hha ybaJ ybaJ acrB acrB acrA acrA acrR acrR aefA aefA STM0479 STM0479 ybaM ybaM priC priC ybaN ybaN apt apt dnaX dnaX ybaB ybaB

1,75 1,43 1,29 -0,36 -0,17 0,83 2,82 -1,83 -0,75 0,24 1,11 -0,45 0,14 -0,25 2,13 -1,37 0,97 -0,87 -0,42 0,98 0,73 -0,54 -0,60 -0,52 0,11 -1,14 -1,77 -0,86 -0,10 -1,60 -0,15 -2,31 -1,92 -1,49 0,46 -1,80 -0,34 -0,52 0,70 1,80 2,69 0,85 1,27 -1,47 -0,46 -0,30 1,30 0,32 0,02 -0,87 1,33 -2,83 -1,52 -2,57 -2,82

0,14 0,18 0,95 -0,13 -0,20 0,14 -0,10 -0,42 -1,77 0,20 -0,62 0,32 0,00 2,73 2,62 0,22 -0,20 0,83 0,82 1,39 -0,22 -0,14 -0,11 0,21 0,70 -0,80 -1,42 0,42 0,36 -1,03 -0,02 -1,22 -1,10 -0,94 -0,97 -0,74 -0,55 -1,49 -0,98 0,33 -0,29 0,69 0,63 0,62 -0,37 1,07 0,85 -0,35 0,15 -1,49 -1,66 -1,29 -0,91 -1,70 -1,87

0,66 0,95 -0,10 -1,14 -1,39 0,57 1,50 -0,49 0,92 0,40 0,29 0,33 1,16 4,18 4,80 0,59 1,42 3,69 4,21 1,68 1,96 -0,20 0,78 0,59 1,24 -0,90 -0,77 -0,32 0,10 -0,28 0,37 0,06 -0,26 -1,53 -1,85 -2,40 -1,90 -1,05 0,03 0,14 2,18 -0,49 0,11 -0,21 -0,08 -0,75 1,14 -0,84 -0,38 -1,78 -1,31 -3,17 -2,15 -2,96 -2,60

Anexo IV

STM0486 STM0486 STM0487,S STM0487,S STM0488 STM0488 STM0489 STM0489 STM0490 STM0490 STM0491 STM0491 STM0492 STM0492 STM0493 STM0493 STM0494 STM0494 STM0495 STM0495 STM0496 STM0496 STM0497 STM0497 STM0498 STM0498 STM0499 STM0499 STM0500 STM0500 STM0501 STM0501 STM0502 STM0502 STM0503 STM0503 STM0504 STM0504 STM0505 STM0505 STM0506 STM0506 STM0507 STM0507 STM0508 STM0508 STM0509 STM0509 STM0510 STM0510 STM0511 STM0511 STM0512 STM0512 STM0513

recR recR htpG htpG adk adk hemH hemH aes aes gsk gsk ybaL ybaL fsr fsr ushA ushA ybaK ybaK ybaP ybaP STM0497 STM0497 copA copA cueR cueR ybbJ ybbJ ybbK ybbK ybbL ybbL ybbM ybbM ybbN ybbN ybbO ybbO tesA tesA ybbA ybbA ybbP ybbP STM0509 STM0509 sfbA sfbA sfbB sfbB sfbC sfbC ybbB

-3,28 -2,06 -2,39 -1,26 -1,45 -0,60 -1,22 -1,27 -1,21 -0,12 -0,96 -0,08 0,19 0,46 -0,38 0,38 2,51 2,46 -1,55 -2,46 -0,42 -0,19 0,03 0,71 -0,14 0,67 -0,22 -0,19 -0,15 1,21 -1,18 -0,18 0,48 0,39 -2,35 -1,42 -1,52 -0,74 -1,08 -0,64 -0,53 -0,33 0,80 2,35 0,77 1,73 -0,47 0,31 0,10 1,47 -0,27 -0,30 -1,23 0,02 -1,47

-1,55 -1,45 -0,32 -0,85 -2,12 -1,73 -1,20 -0,94 -1,16 -1,55 -0,51 -0,30 0,10 -0,32 -1,22 -0,83 -0,75 -0,47 -0,68 -0,73 0,04 0,15 0,79 -0,41 -0,28 -0,62 0,64 0,10 0,16 -0,15 -0,42 -0,49 -0,67 -0,48 -0,43 -0,35 -1,10 -0,33 0,06 0,29 -0,15 -0,53 1,99 1,96 0,01 -0,42 0,05 0,54 2,07 1,92 0,71 0,47 0,07 0,31 -0,28

-3,83 -3,99 -2,23 -2,20 -3,06 -4,42 -0,19 -0,09 -0,65 -0,35 -1,95 -0,93 -1,37 -0,56 -0,90 -0,61 -1,46 -1,66 -0,94 -2,32 -1,86 -0,55 0,05 -0,32 0,72 1,07 0,44 1,42 0,36 -0,03 -0,48 0,09 0,00 -0,09 -1,11 -1,32 -2,28 -2,38 -2,57 -1,81 -1,39 -1,04 -0,79 -0,72 -1,28 0,04 0,28 1,14 -0,69 0,98 -0,38 0,47 -1,03 -0,44 -0,49

STM0513 STM0514 STM0514 STM0515 STM0515 STM0516 STM0516 STM0517 STM0517 STM0518 STM0518 STM0519 STM0519 STM0520 STM0520 STM0522 STM0522 STM0523 STM0523 STM0524 STM0524 STM0525 STM0525 STM0526 STM0526 STM0527 STM0527 STM0528 STM0528 STM0529 STM0529 STM0530 STM0530 STM0531 STM0531 STM0532 STM0532 STM0533 STM0533 STM0534 STM0534 STM0535 STM0535 STM0536 STM0536 STM0537 STM0537 STM0538 STM0538 STM0539 STM0539 STM0540 STM0540 STM0541 STM0541

236

ybbB ybbS ybbS allA allA allR allR gcl gcl gip gip glxR glxR STM0520 STM0520 allP allP allB allB ybbY ybbY glxK glxK ylbA ylbA allC allC allD allD fdrA fdrA ylbE ylbE ylbF ylbF arcC arcC purK purK purE purE lpxH lpxH ppiB ppiB cysS cysS STM0538 STM0538 STM0539 STM0539 ybcI ybcI ybcJ ybcJ

-0,34 0,36 1,01 0,77 1,21 1,21 2,27 0,52 2,69 -0,71 -0,32 0,36 0,18 -0,16 -0,53 0,24 0,38 2,74 0,98 2,52 0,00 -0,14 0,74 -0,07 0,40 -0,73 -0,15 -0,64 -0,05 0,00 0,20 -0,10 1,25 0,95 0,57 -0,25 0,33 0,70 1,13 -0,24 -0,19 -1,33 -0,49 -2,56 -0,56 -0,41 -0,50 -1,30 0,15 0,25 0,18 -0,74 -0,64 -0,03 0,75

-0,14 0,37 0,45 0,24 0,43 0,43 0,83 0,57 -0,26 -0,68 -0,04 -0,11 -1,41 -0,96 -0,93 0,41 0,35 0,53 -0,68 -0,34 -1,30 -0,52 0,26 0,52 0,05 0,64 -0,50 1,17 -1,22 -0,45 -0,74 0,29 -1,03 -0,24 -1,90 -0,25 -0,15 0,97 0,78 1,15 1,16 -0,95 -1,43 -0,95 -0,28 -0,58 -0,22 -1,85 -1,90 0,07 -1,20 -1,51 -0,64 0,13 0,17

-1,20 -0,45 0,57 -0,67 0,73 -0,44 1,15 0,76 2,27 0,24 -0,20 0,93 1,97 -0,12 0,63 1,46 1,61 3,00 0,56 1,17 1,80 -0,25 0,97 0,70 1,31 0,07 -0,48 -1,52 -3,05 -1,56 -0,39 -0,17 -0,24 -0,29 -0,23 -1,04 -0,59 -0,98 0,26 -2,55 -1,81 -1,93 -2,11 -1,62 -1,23 -0,93 -0,72 -2,01 -1,79 -0,48 -0,79 -1,04 0,00 -0,96 0,04

Anexo IV

STM0542 STM0542 STM0549 STM0549 STM0550 STM0550 STM0551 STM0551 STM0552 STM0552 STM0553 STM0553 STM05559.T1 STM05559.T1 STM0557 STM0557 STM0558 STM0558 STM0559 STM0559 STM0561 STM0561 STM0563 STM0563 STM0564 STM0564 STM0565 STM0565 STM0566 STM0566 STM0567 STM0567 STM0568 STM0568 STM0569 STM0569 STM0570 STM0570 STM0571 STM0571 STM0572 STM0572 STM0573 STM0573 STM0574 STM0574 STM0575 STM0575 STM0576 STM0576 STM0577 STM0577 STM0578 STM0578 STM0579

folD folD fimZ fimZ fimY fimY STM0551 STM0551 fimW fimW argU argU STM0557 STM0557 yfdH yfdH rfbI rfbI STM0561 STM0561 STM0563 STM0563 STM0564 STM0564 STM0565 STM0565 STM0566 STM0566 STM0567 STM0567 pheP pheP ybdG ybdG apeE apeE STM0571 STM0571 STM0572 STM0572 STM0573 STM0573 STM0574 STM0574 STM0575 STM0575 STM0576 STM0576 STM0577 STM0577 nfnB nfnB ybdF

-1,15 -1,67 0,22 -0,05 1,91 0,89 -0,53 0,58 0,35 2,16 -2,96 -0,78 -1,90 -0,42 1,06 1,71 -0,76 -0,33 -1,79 -0,45 6,16 7,72 0,31 2,50 -0,25 0,36 -0,14 0,50 -0,33 0,10 0,31 0,95 -1,10 -0,76 -2,15 -0,81 0,64 1,08 -1,43 -1,51 0,20 0,34 0,51 1,10 2,42 0,85 -0,29 1,00 -1,20 -0,12 1,98 2,91 -1,84 -0,94 1,46

-0,57 -0,55 0,48 -0,16 0,28 -0,94 -0,11 -1,12 0,09 -0,04 -1,38 -1,36 -1,75 -1,60 0,68 0,09 -0,79 -0,80 -0,51 -1,51 0,26 0,28 0,62 0,22 0,81 -0,01 0,32 -0,61 -1,10 -0,73 -0,94 0,04 -0,60 -0,66 -1,23 -0,67 1,58 1,93 0,37 -0,68 -0,52 -1,11 -0,47 -2,49 -0,22 -0,24 -0,22 -0,62 -0,93 -1,32 1,22 0,84 -0,50 -0,68 -0,03

-1,32 -2,54 -0,37 -0,32 2,90 0,99 1,02 0,26 -0,30 1,13 -1,63 -0,62 -2,12 -1,51 0,01 1,76 -0,88 -0,74 -0,42 -0,58 1,67 4,47 -0,49 -0,72 0,45 0,98 0,17 1,06 -1,78 -1,37 -1,14 -0,20 -0,60 -1,15 -2,35 -0,68 0,26 -0,01 -0,60 0,14 0,72 0,23 0,16 -0,87 0,32 1,03 1,16 0,69 -0,04 0,27 1,79 2,53 -1,96 -0,60 -0,18

STM0579 STM0580 STM0580 STM0581 STM0581 STM0582 STM0582 STM0583 STM0583 STM0587 STM0587 STM0593 STM0593 STM0599 STM0599 STM0600 STM0600 STM0601 STM0601 STM0602 STM0602 STM0603 STM0603 STM0604 STM0604 STM0605 STM0605 STM0606 STM0606 STM0607 STM0607 STM0608 STM0608 STM0609 STM0609 STM0610 STM0610 STM0611 STM0611 STM0612 STM0612 STM0613 STM0613 STM0614 STM0614 STM0615 STM0615 STM0616 STM0616 STM0617 STM0617 STM0618 STM0618 STM0619 STM0619

237

ybdF STM0580 STM0580 STM0581 STM0581 ybdJ ybdJ ybdK ybdK ybdZ ybdZ entS entS ybdB ybdB cstA cstA ybdD ybdD ybdH ybdH ybdL ybdL ybdM ybdM ybdN ybdN ybdO ybdO dsbG dsbG ahpC ahpC ahpF ahpF STM0610 STM0610 STM0611 STM0611 STM0612 STM0612 STM0613 STM0613 ybdQ ybdQ ybdR ybdR rnk rnk rna rna citT citT citG citG

-0,43 -1,36 -0,37 2,06 2,09 -0,31 0,18 0,32 0,78 0,55 0,71 0,05 1,18 -0,22 0,69 0,16 1,39 -0,52 0,44 0,56 -0,42 -1,37 -0,27 0,22 0,69 0,46 1,42 -0,71 -0,52 -1,00 0,69 -1,08 -0,52 -0,84 0,48 -0,82 1,11 0,92 -0,45 -0,21 -0,35 -1,10 0,36 0,28 -1,39 0,32 1,72 -0,34 0,62 0,23 0,67 -0,43 0,83 -0,36 -0,69

-0,59 -0,74 -0,86 2,33 1,75 0,84 0,71 0,37 0,54 2,71 2,74 -0,03 -0,06 1,23 0,97 1,68 1,52 0,20 1,35 0,54 0,59 -0,19 -0,09 0,85 0,64 0,70 -0,20 0,07 0,37 1,29 1,35 -0,13 -0,20 -0,89 -0,28 -1,80 -2,18 -0,84 -1,91 -0,86 0,07 0,05 0,43 0,97 0,45 -0,13 -0,10 -0,10 -0,87 0,26 0,50 0,28 -0,20 0,30 0,43

-0,39 -1,82 -1,39 0,97 2,10 0,20 0,21 0,90 1,79 -1,89 -0,62 -0,56 0,79 -1,53 -0,28 0,73 1,89 1,01 1,36 0,18 0,81 -1,11 -0,85 -0,72 0,51 0,67 1,42 -1,02 -0,01 0,17 1,15 -1,18 -0,96 -2,82 -1,62 -1,17 1,49 -0,71 0,90 -0,33 -0,70 0,72 1,12 1,50 2,18 1,11 1,99 0,01 0,12 -0,60 -0,32 -0,03 -0,64 -0,11 -1,10

Anexo IV

STM0620 STM0620 STM0621 STM0621 STM0622 STM0622 STM0623 STM0623 STM0624 STM0624 STM0625 STM0625 STM0626 STM0626 STM0627 STM0627 STM0628 STM0628 STM0629 STM0629 STM0630 STM0630 STM0631 STM0631 STM0632 STM0632 STM0633 STM0633 STM0634 STM0634 STM0635,S STM0635,S STM0636 STM0636 STM0637 STM0637 STM0638 STM0638 STM0639 STM0639 STM0640 STM0640 STM0641 STM0641 STM0642 STM0642 STM0643 STM0643 STM0644 STM0644 STM0645 STM0645 STM0646 STM0646 STM0647

citX citX citF citF citE citE citD citD citC citC dpiB dpiB dpiA dpiA dcuC dcuC pagP pagP cspE cspE ccrB ccrB ybeM ybeM tatE tatE lipA lipA ybeF ybeF lipB lipB ybeD ybeD dacA dacA rlpA rlpA mrdB mrdB mrdA mrdA ybeA ybeA ybeB ybeB cobC cobC cobD cobD nadD nadD holA holA rlpB

-0,47 1,01 0,56 1,75 0,36 0,37 -0,85 0,04 -0,44 1,38 -0,29 2,34 0,77 0,91 -0,97 -0,21 -1,47 -1,35 -3,07 -1,72 -2,11 -1,27 -1,65 -0,46 0,39 1,63 -1,62 -0,92 -1,09 -0,23 -1,88 -1,50 -1,61 -0,38 -2,87 -1,78 -1,91 -0,66 -1,03 -0,26 0,01 1,41 -2,56 -1,12 -1,99 -0,90 -1,05 0,33 -0,86 -0,77 0,40 0,77 -1,06 -1,17 -2,56

0,26 0,79 1,42 1,65 2,28 1,52 1,39 0,90 1,23 0,49 0,98 0,99 0,88 -0,89 0,27 -0,06 -1,77 -0,46 0,19 0,45 -1,02 -0,63 -0,08 -0,35 0,07 0,82 -1,14 -1,21 -0,59 -0,82 -0,57 -0,95 0,85 0,94 -1,44 -1,73 -1,36 -1,10 -0,67 -0,89 -1,30 -1,51 -0,36 -0,92 -0,15 -0,26 -1,18 -0,44 -0,44 -1,23 -1,00 -0,47 -1,11 -1,12 -1,10

-0,92 -0,08 -1,09 0,10 0,54 0,06 -0,12 0,83 -0,79 0,74 -0,14 2,21 -0,40 -0,70 -0,72 1,04 -0,76 -0,80 1,40 2,05 -0,35 -0,13 -0,60 0,44 1,16 1,35 -1,42 0,02 -0,56 0,09 -1,12 -1,68 -1,48 -1,37 -2,19 -2,67 -2,86 -2,27 -1,99 -1,19 -0,94 -1,02 -3,17 -3,24 -2,47 -0,76 -1,96 -0,96 -0,28 -1,14 -1,32 -0,61 -1,53 -2,92 -2,24

STM0647 STM0648 STM0648 STM0649,S STM0649,S STM0650 STM0650 STM0651 STM0651 STM0652 STM0652 STM0653 STM0653 STM0654 STM0654 STM0655 STM0655 STM0656 STM0656 STM0657 STM0657 STM0657 STM0657 STM0658 STM0658 STM0659 STM0659 STM0660 STM0660 STM0661 STM0661 STM0662 STM0662 STM0663 STM0663 STM0664 STM0664 STM0665 STM0665 STM0666 STM0666 STM0667 STM0667 STM0668 STM0668 STM0669 STM0669 STM0670 STM0670 STM0671 STM0671 STM0672 STM0672 STM0673 STM0674

238

rlpB leuS leuS STM0649,S STM0649,S STM0650 STM0650 STM0651 STM0651 STM0652 STM0652 ybeL ybeL ybeQ ybeQ ybeR ybeR ybeS ybeS ybeU ybeU ybeU ybeU ybeV ybeV hscC hscC STM0660 STM0660 ybeK ybeK gltL gltL gltK gltK gltJ gltJ gltI gltI lnt lnt ybeX ybeX ybeY ybeY phoL phoL miaB miaB ubiF ubiF STM0672 STM0672 glnX glnV

-2,20 -3,44 -2,22 0,96 0,70 1,41 3,22 1,49 3,53 1,17 2,49 -0,11 1,56 0,02 1,48 1,06 2,10 -0,18 1,01 -0,64 -0,27 0,53 0,71 -0,72 0,74 1,47 2,36 -0,35 0,22 -0,49 -0,77 3,37 3,41 0,88 0,72 -2,14 1,15 0,77 0,84 -1,38 -0,20 -0,75 -0,42 -2,17 -1,60 -1,02 0,00 -1,64 -0,93 -1,20 -1,63 -1,97 -1,90 -1,14 -1,14

-0,89 -0,69 -0,57 -0,71 -1,42 1,07 2,17 -0,45 -0,48 -0,46 -0,51 0,38 1,77 1,40 0,99 -0,09 -0,12 0,14 -0,62 -0,58 -0,09 -2,10 -0,98 -0,33 1,24 -0,26 0,01 -0,80 -2,66 -0,88 -0,79 1,42 0,91 1,17 0,73 0,27 -1,26 4,91 4,02 0,69 1,34 0,66 -0,70 -0,65 0,39 0,00 -0,02 -1,65 -1,34 -1,88 -1,60 -1,87 -2,16 -1,36 -2,05

-2,03 -1,16 -1,72 1,29 1,19 1,75 4,18 0,68 1,74 0,56 1,69 3,34 4,19 2,24 2,97 -0,70 0,44 0,16 0,81 0,87 -0,58 -0,58 -0,49 -0,86 0,65 -0,14 -0,41 1,00 0,42 -0,21 -0,15 1,16 1,81 0,80 1,73 0,92 1,58 4,09 4,95 0,40 0,81 -1,50 -0,58 -0,49 -0,74 -1,82 -1,32 -2,59 -1,82 -0,54 -0,81 -0,84 -0,91 2,81 2,45

Anexo IV

STM0673 STM0674 STM0677 STM0676 STM0677 STM0676 STM0678 STM0678 STM0675 STM0679 STM0675 STM0679 STM0680 STM0680 STM0681 STM0681 STM0682 STM0682 STM0683 STM0683 STM0684 STM0684 STM0685 STM0685 STM0686 STM0686 STM0687 STM0687 STM0688 STM0688 STM0689 STM0689 STM0690 STM0690 STM0691 STM0691 STM0692 STM0692 STM0693 STM0693 STM0694 STM0694 STM0695 STM0695 STM0696 STM0696 STM0697 STM0697 STM0698 STM0698 STM0699 STM0699 STM0700 STM0700 STM0701

glnX glnV glnU glnW glnU glnW leuW leuW metU metT metU metT asnB asnB nagD nagD nagC nagC nagA nagA nagB nagB nagE nagE glnS glnS ybfM ybfM ybfN ybfN citA citA citB citB STM0691 STM0691 STM0692 STM0692 fur fur fldA fldA ybfE ybfE ybfF ybfF seqA seqA pgm pgm STM0699 STM0699 potE potE speF

-0,04 -1,02 -2,19 -1,45 -1,66 -1,58 -4,65 -4,33 -3,20 -3,03 -1,80 -2,24 -0,47 -0,47 -0,84 0,74 -1,05 -1,08 -1,10 -0,09 -2,34 -1,79 -0,91 -1,27 -0,58 0,50 1,00 1,71 2,36 2,05 -0,71 -0,20 1,08 2,18 0,40 1,17 -0,33 0,32 -1,90 -0,97 -3,42 -1,12 -2,56 -2,25 -1,50 -1,37 -3,16 -1,32 0,45 0,88 -0,85 0,68 0,60 3,32 -0,52

-1,23 -2,42 -1,44 -1,12 -2,16 -1,59 -3,46 -3,66 -1,86 -1,86 -1,73 -1,90 -0,47 -1,75 -0,01 -0,48 -0,84 -0,92 -0,14 0,26 -0,06 -0,30 -0,37 -1,11 -0,80 -1,00 -0,11 0,13 0,67 -0,35 -0,60 -0,45 0,52 -0,04 -0,20 -0,86 -0,97 -1,10 -1,28 -1,15 -1,04 -0,76 -1,92 -2,13 -1,61 -1,15 -0,96 -1,16 -0,14 -0,08 -1,75 -1,09 -0,53 0,09 -1,06

2,96 2,77 1,65 2,65 1,61 2,42 -2,50 -2,89 1,34 1,33 2,01 1,54 -1,00 -2,44 -0,89 -0,68 -1,99 -0,52 -0,80 -0,36 0,15 1,16 -0,79 -0,95 -1,27 -0,52 -0,41 0,74 1,35 0,62 -0,66 -0,76 0,25 0,69 1,43 0,63 -2,03 -0,57 -1,75 -1,70 -2,82 -1,62 -2,47 -3,98 -3,44 -1,97 -2,29 -1,68 1,52 2,29 -1,61 -0,93 -1,17 2,43 -0,03

STM0701 STM0708 STM0708 STM0709 STM0709 STM0710 STM0710 STM0711 STM0711 STM0712 STM0712 STM0713 STM0713 STM0714 STM0714 STM0715 STM0715 STM0716 STM0716 STM0719 STM0719 STM0719 STM0719 STM0719 STM0719 STM0720 STM0720 STM0721 STM0721 STM0722 STM0722 STM0723 STM0723 STM0724 STM0724 STM0725 STM0725 STM0726 STM0726 STM0728 STM0728 STM0729 STM0729 STM0740 STM0740 STM0741 STM0741 STM0742 STM0742 STM0743 STM0743 STM0744 STM0744 STM0745 STM0745

239

speF ybfA ybfA phrB phrB ybgH ybgH ybgI ybgI ybgJ ybgJ ybgK ybgK ybgL ybgL STM0715 STM0715 INT_FimBE_C INT_FimBE_C STM0719 STM0719 STM0719 STM0719 STM0719 STM0719 STM0720 STM0720 STM0721 STM0721 STM0722 STM0722 STM0723 STM0723 STM0724 STM0724 STM0725 STM0725 STM0726 STM0726 nei nei abrB abrB cydA cydA cydB cydB ybgT ybgT ybgE ybgE ybgC ybgC tolQ tolQ

1,49 0,63 1,78 -0,69 -0,25 -0,73 0,50 -1,09 -0,36 -1,52 -0,63 -1,80 -0,99 -0,63 -1,20 0,38 1,22 -0,41 1,73 -0,10 0,55 0,77 2,10 2,60 0,46 -0,86 0,09 -0,06 -0,11 -0,54 -0,11 -0,71 0,52 -0,72 0,59 -0,94 1,25 1,39 2,61 -0,06 0,09 -1,38 -0,64 -1,93 -0,87 -1,93 -1,61 0,45 0,05 -1,65 -2,34 -2,37 -1,39 -0,72 0,42

-0,89 1,76 1,38 0,33 0,16 0,64 0,07 0,46 0,12 0,11 0,13 -0,85 -0,58 -0,26 -0,42 -0,05 -0,03 0,52 0,24 -0,04 0,54 0,97 -0,79 -1,14 -0,20 -0,85 -0,03 0,23 -2,04 -0,09 -1,26 0,29 -0,62 -0,40 -1,13 -0,61 -0,11 0,90 0,10 0,31 -0,07 -1,01 -0,87 -0,86 -0,84 0,00 -0,59 -0,86 -0,39 -1,17 -1,15 -1,09 -1,04 -1,30 -1,66

0,91 0,49 1,14 -0,56 0,13 -0,66 -0,07 -1,21 0,16 -1,94 -1,10 -0,81 -1,25 -1,79 -1,35 0,03 0,32 -0,06 1,29 -0,86 -0,08 0,94 0,56 -0,51 0,96 -0,03 0,74 0,66 -2,42 0,00 -0,12 -0,77 0,73 0,38 -0,54 -0,42 1,23 1,50 3,04 -0,30 0,67 -0,62 -1,14 -2,48 -2,60 -1,79 -2,06 -1,56 -1,70 -2,44 -2,07 -1,98 -1,38 -2,52 -2,32

Anexo IV

STM0746 STM0746 STM0747 STM0747 STM0748 STM0748 STM0749 STM0749 STM0750 STM0750 STM0756 STM0756 STM0757 STM0757 STM0758 STM0758 STM0759 STM0759 STM0760 STM0760 STM0761 STM0761 STM0762 STM0762 STM0763,s STM0763,s STM0764 STM0764 STM0765 STM0765 STM0766 STM0766 STM0769 STM0769 STM0770 STM0770 STM0771 STM0771 STM0772 STM0772 STM0773 STM0773 STM0774 STM0774 STM0775 STM0775 STM0776 STM0776 STM0777 STM0777 STM0778 STM0778 STM0779 STM0779 STM0781

tolR tolR tolA tolA tolB tolB pal pal ybgF ybgF nadA nadA pnuC pnuC ybgR ybgR ybgS ybgS aroG aroG STM0761 STM0761 STM0762 STM0762 STM0763,s STM0763,s STM0764 STM0764 STM0765 STM0765 dcoC dcoC STM0769 STM0769 STM0770 STM0770 STM0771 STM0771 gpmA gpmA galM galM galK galK galT galT galE galE STM0777 STM0777 modF modF modE modE modA

-2,09 -1,41 -2,20 -0,65 -2,83 -1,49 -3,96 -2,70 -1,20 -0,99 -0,81 0,01 -0,94 -0,34 -0,94 -1,54 2,77 -0,73 -0,32 1,52 -0,14 3,16 0,92 1,23 2,69 3,16 -0,51 -0,48 -0,42 -0,38 2,20 2,85 -0,98 0,80 -1,15 -0,44 -1,11 0,68 -0,47 0,86 -1,45 -1,01 -0,81 0,00 -1,77 -1,43 1,16 0,45 0,47 2,99 -0,55 0,18 -1,44 -0,37 -1,63

-1,08 -0,69 -0,54 -0,53 -0,28 -0,26 -1,13 -1,24 -0,35 -0,10 -0,21 -0,08 0,68 -0,29 -0,11 0,09 3,30 3,11 -0,02 0,62 0,02 0,49 -0,39 0,43 1,89 1,73 -0,31 -1,17 -1,04 -1,34 -0,56 -0,86 0,53 0,06 0,64 0,32 1,18 2,27 2,26 2,37 0,37 0,82 -0,24 -0,07 -1,59 -1,11 -0,81 -0,65 -0,65 -0,44 -0,29 -0,02 -0,09 0,57 1,17

-3,35 -2,05 -2,39 -1,84 -2,31 -1,57 -3,14 -3,02 -2,03 -1,23 0,50 0,73 0,95 0,62 0,84 0,91 8,46 9,52 1,12 1,43 -0,13 0,71 0,85 0,28 3,12 3,56 0,13 -0,26 0,00 0,11 -1,09 -0,10 -1,57 -0,31 0,33 0,37 0,06 0,64 0,85 1,50 -0,61 -0,32 -0,91 -0,45 -1,53 -1,31 2,85 1,60 -0,10 1,52 -0,52 -0,49 -1,74 -1,29 -3,49

STM0781 STM0782 STM0782 STM0783 STM0783 STM0784 STM0784 STM0785 STM0785 STM0786 STM0786 STM0787 STM0787 STM0788 STM0788 STM0789 STM0789 STM0791 STM0791 STM0792 STM0792 STM0793 STM0793 STM0794 STM0794 STM0795 STM0795 STM0796 STM0796 STM0797 STM0797 STM0798 STM0798 STM0801 STM0801 STM0802 STM0802 STM0803 STM0803 STM0804 STM0804 STM0805 STM0805 STM0806 STM0806 STM0807 STM0807 STM0808 STM0808 STM0809 STM0809 STM0810 STM0810 STM0811 STM0811

240

modA modB modB modC modC ybhA ybhA ybhE ybhE ybhC ybhC hutI hutI hutG hutG hutC hutC hutH hutH ybhB ybhB bioA bioA bioB bioB bioF bioF bioC bioC bioD bioD uvrB uvrB ybhK ybhK moaA moaA moaB moaB moaC moaC moaD moaD moaE moaE ybhL ybhL ybhM ybhM STM0809 STM0809 STM0810 STM0810 ybhN ybhN

-1,51 -1,29 -0,50 -1,37 -1,42 0,14 -0,46 -0,80 0,21 -0,85 -0,48 -0,74 0,37 -0,55 0,50 -1,19 -1,27 -0,22 -0,98 0,32 1,19 -0,78 0,38 0,97 1,74 0,82 0,24 0,23 1,84 0,05 0,67 -0,88 0,14 -0,36 0,96 -1,85 -0,42 -1,82 -0,34 -0,97 -1,70 -0,39 -1,34 -1,55 -0,91 -1,13 -0,30 -1,61 -1,06 0,86 1,08 -0,09 1,09 1,92 2,95

1,48 0,12 -0,24 -0,43 -0,31 0,29 -0,12 0,20 -0,01 -0,47 -1,30 0,50 -0,09 -0,85 -0,26 -1,33 -1,62 0,37 -0,11 0,70 0,63 1,45 1,55 3,97 2,93 -0,49 -1,08 2,01 1,86 -0,59 -0,54 0,00 0,26 0,03 0,77 -1,02 -0,90 0,11 0,19 -1,62 -1,14 -1,52 -1,99 -1,31 -0,64 0,09 0,17 -1,33 -0,69 -0,42 -0,98 -0,72 -0,80 -1,01 -1,29

-3,24 -2,38 -1,35 -2,50 -1,03 0,93 -1,65 -0,54 -0,19 -0,84 -0,98 -0,69 0,77 -0,80 0,20 0,59 -1,44 0,77 -1,23 0,39 1,22 -0,86 0,21 -0,17 0,07 -0,56 0,00 -1,27 0,27 -1,44 -0,27 0,52 -0,20 -0,08 0,54 -0,61 0,75 -0,69 -0,46 -1,42 -1,51 -1,37 -1,53 -0,53 -0,45 1,28 1,82 0,94 0,22 0,37 0,36 0,45 1,48 0,65 2,06

Anexo IV

STM0812 STM0812 STM0813 STM0813 STM0814 STM0814 STM0815 STM0815 STM0816 STM0816 STM0817 STM0817 STM0818 STM0818 STM0819 STM0819 STM0820 STM0820 STM0821 STM0821 STM0822 STM0822 STM0823 STM0823 STM0825 STM0825 STM0826 STM0826 STM0827 STM0827 STM0828 STM0828 STM0829 STM0829 STM0830 STM0830 STM0831 STM0831 STM0832 STM0832 STM0833 STM0833 STM0834 STM0834 STM0835 STM0835 STM0836 STM0836 STM0837 STM0837 STM0838 STM0838 STM0839 STM0839 STM0840

ybhO ybhO ybhP ybhP ybhQ ybhQ ybhR ybhR ybhS ybhS ybhF ybhF STM0818 STM0818 ybiH ybiH rhlE rhlE dinG dinG ybiB ybiB ybiJ ybiJ ybiI ybiI ybiN ybiN ybiO ybiO glnQ glnQ glnP glnP glnH glnH dps dps ybiF ybiF ompX ompX ybiP ybiP STM0835 STM0835 ybiR ybiR ybiS ybiS ybiT ybiT STM0839 STM0839 ybiV(2)

2,79 2,33 -1,44 0,65 -0,82 0,42 -0,89 -0,22 -0,75 -0,29 -0,28 0,65 -0,35 -0,55 -0,91 -0,36 -1,05 0,32 -0,35 0,09 -0,74 0,67 -1,10 0,12 0,75 0,62 -0,44 1,96 -0,79 0,41 -0,35 -0,46 -2,72 0,05 -2,45 -2,56 -1,33 -0,26 -1,00 -0,89 -2,19 -0,83 0,02 0,38 -0,03 -0,61 -0,52 1,09 -0,94 1,33 0,23 0,84 -0,08 -0,52 -1,79

-0,39 -0,23 -0,08 -0,21 0,78 1,50 0,15 0,53 -0,40 -0,97 0,50 -0,50 0,34 -0,75 0,01 0,08 -1,51 -0,92 -0,47 -1,27 -0,08 -0,32 -0,08 0,11 0,47 0,23 -1,01 -0,57 -0,60 -0,79 -0,91 -1,15 -1,87 -1,21 -0,26 -0,51 2,58 2,79 -0,54 0,02 -1,23 -0,92 -1,16 -0,57 0,14 -0,09 -0,72 -0,51 -0,56 -1,23 1,04 1,52 0,96 0,11 -0,02

0,66 1,16 0,11 0,62 2,65 2,62 1,05 1,02 -0,63 0,16 0,46 -0,08 0,05 0,21 -0,10 0,67 -2,57 -1,99 -0,04 0,04 0,30 -0,24 0,07 0,36 2,08 2,22 -0,30 -0,11 -0,69 -0,89 -1,56 -1,93 -1,05 -1,70 -1,25 -1,69 5,89 6,38 1,27 1,85 0,45 0,63 0,71 1,02 -0,51 0,13 0,10 0,19 -0,62 -1,55 -0,91 -1,08 -0,42 -0,45 -1,79

STM0840 STM0841 STM0841 STM0842 STM0842 STM0843 STM0843 STM0844 STM0844 STM0845 STM0845 STM0846 STM0846 STM0847 STM0847 STM0848 STM0848 STM0849 STM0849 STM0850 STM0850 STM0851 STM0851 STM0852 STM0852 STM0853 STM0853 STM0854 STM0854 STM0855 STM0855 STM0856 STM0856 STM0858 STM0858 STM0859 STM0859 STM0860 STM0860 STM0862 STM0862 STM0863 STM0863 STM0864 STM0864 STM0865 STM0865 STM0866 STM0866 STM0867 STM0867 STM0868 STM0868 STM0869 STM0869

241

ybiV(2) ybiU ybiU ybiV(1) ybiV(1) pflF pflF pflE pflE moeB moeB moeA moeA ybiK ybiK yliA yliA yliB yliB yliC yliC yliD yliD yliG yliG yliH yliH STM0854 STM0854 STM0855 STM0855 STM0856 STM0856 STM0858 STM0858 STM0859 STM0859 STM0860 STM0860 yliJ yliJ dacC dacC deoR deoR ybjG ybjG mdfA mdfA STM0867 STM0867 STM0868 STM0868 STM0869 STM0869

-0,77 0,23 1,97 -0,56 1,71 -0,27 0,45 -0,83 0,49 -0,29 0,95 -1,23 -0,24 -1,80 0,57 -0,50 -0,44 -0,89 -1,21 -1,45 -0,10 -1,80 -0,59 -1,80 -0,66 -0,35 -1,19 0,28 1,26 0,11 0,62 0,09 1,10 0,89 2,59 -0,17 -0,49 -0,31 0,75 -0,71 -0,11 -0,52 -0,76 1,09 0,88 -1,00 0,34 -0,99 -0,21 -0,33 0,31 0,96 1,02 -0,87 -0,97

-0,46 1,16 1,30 -1,38 -0,73 0,40 -0,38 -0,35 -0,67 -0,59 -0,41 -0,54 -0,71 -0,53 0,04 -0,98 -1,38 0,10 -0,01 -0,44 -1,32 -1,11 -1,18 -1,00 -2,00 1,89 2,01 0,30 0,17 -0,09 0,42 0,04 0,02 0,42 0,50 -0,54 0,08 1,03 0,57 0,92 1,48 0,41 -0,11 0,39 0,07 -0,24 -0,45 -0,77 -1,21 -0,37 -0,07 -0,32 -0,41 0,40 -0,90

-0,52 -0,66 0,60 -1,62 -0,33 -0,27 0,71 -1,45 1,02 -1,47 -1,13 -0,96 1,51 -1,26 0,01 -1,52 -1,10 0,13 -1,05 -1,63 -0,94 -1,09 -1,38 -2,09 -1,35 6,49 6,40 1,75 2,59 -0,79 1,11 -0,93 0,01 0,05 2,49 0,21 -1,87 0,12 0,21 -0,68 -0,50 -0,12 -0,28 0,23 -0,51 -1,05 -0,82 -1,40 -0,65 -0,63 -0,27 0,05 1,11 -0,30 -0,13

Anexo IV

STM0870 STM0870 STM0871 STM0871 STM0872 STM0872 STM0873 STM0873 STM0874 STM0874 STM0875 STM0875 STM0876 STM0876 STM0877 STM0877 STM0878 STM0878 STM0879 STM0879 STM0880 STM0880 STM0881 STM0881 STM0882 STM0882 STM0884 STM0884 STM0885 STM0885 STM0886 STM0886 STM0887 STM0887 STM0888 STM0888 STM0889 STM0889 STM0890 STM0890 STM0891 STM0891 STM0892 STM0892 STM0893 STM0893 STM0898 STM0898 STM0906 STM0906 STM0907 STM0907 STM0908 STM0908 STM0930

STM0870 STM0870 ybjM ybjM grxA grxA ybjC ybjC mdaA mdaA rimK rimK ybjN ybjN potF potF potG potG potH potH potI potI ybjO ybjO ybjF ybjF ulaA ulaA STM0885 STM0885 STM0886 STM0886 artJ artJ artM artM artQ artQ artI artI artP artP ybjP ybjP STM0893 STM0893 STM0898 STM0898 STM0906 STM0906 STM0907 STM0907 STM0908 STM0908 orfB

-0,97 0,08 -1,53 -0,52 -0,98 0,67 -0,83 -0,66 -0,23 -0,01 -1,06 -0,74 -1,67 -0,90 0,68 1,60 0,88 2,37 -1,47 -1,21 0,01 1,01 -1,94 -0,87 -0,69 2,30 0,45 1,53 -0,98 0,19 0,60 1,29 0,22 0,30 -1,42 -0,19 -1,67 -0,53 -0,99 -1,54 -0,39 -0,84 -0,94 -0,23 -1,44 -1,83 -0,40 0,09 1,12 2,04 1,17 2,55 2,58 2,81 0,35

-0,99 -0,76 0,26 0,48 0,30 0,48 -0,17 -0,32 0,05 -0,19 -0,71 -0,73 -0,84 -0,58 0,80 0,87 -0,56 -1,84 -1,67 -2,30 0,12 -0,24 -0,25 -1,18 -0,62 -0,75 0,55 -1,56 -1,09 -0,98 0,47 1,11 1,81 1,41 -0,24 0,28 -0,85 -0,52 -0,16 -0,06 0,14 0,50 0,28 0,11 -0,68 -0,95 0,96 0,62 0,32 0,14 0,77 0,29 1,11 0,18 1,30

-2,37 -0,61 -0,42 -1,20 -0,81 0,62 -1,53 0,53 -1,13 -0,73 -0,89 -1,92 -2,15 -1,27 0,84 0,78 -0,82 0,42 -1,22 -1,34 -0,57 0,50 -0,89 -0,40 -0,12 -0,31 -0,68 -2,23 -1,50 -0,91 0,70 0,78 0,93 0,85 -0,87 0,24 -3,54 -1,69 -1,42 -1,48 -1,00 -0,24 -0,40 0,29 -1,16 -1,76 -0,64 0,54 -0,13 0,26 -0,15 1,59 4,05 3,57 0,41

STM0930 STM0931 STM0931 STM0932 STM0932 STM0933 STM0933 STM0934 STM0934 STM0936 STM0936 STM0937 STM0937 STM0938 STM0938 STM0939 STM0939 STM0940 STM0940 STM0941 STM0941 STM0942 STM0942 STM0943 STM0943 STM0944 STM0944 STM0945 STM0945 STM0947 STM0947 STM0948 STM0948 STM0950 STM0950 STM0951 STM0951 STM0952 STM0952 STM0953 STM0953 STM0955 STM0955 STM0956 STM0956 STM0957 STM0957 STM0958 STM0958 STM0959 STM0959 STM0960 STM0960 STM0961 STM0961

242

orfB ybjR ybjR STM0932 STM0932 ybjT ybjT ltaA ltaA hcr hcr hcp hcp ybjE ybjE ybjD ybjD ybjX ybjX ybjY ybjY ybjZ ybjZ cspD cspD clpS clpS clpA clpA STM0947 STM0947 STM0948 STM0948 STM0950 STM0950 STM0951 STM0951 STM0952 STM0952 infA infA aat aat cydC cydC cydD cydD trxB trxB lrp lrp ftsK ftsK lolA lolA

1,23 -0,48 0,32 -0,29 0,76 -0,08 2,75 -1,49 -0,98 -0,77 1,18 -1,23 0,18 -0,42 0,18 -2,69 -1,34 -2,40 -1,34 0,95 1,32 1,22 0,05 -0,61 -0,04 0,11 0,82 1,16 2,08 -0,32 1,08 0,79 2,13 0,00 0,00 -0,37 1,63 -1,13 -0,07 -2,58 -0,20 -1,51 -1,36 -1,45 -3,16 -2,01 -2,04 -1,51 -0,45 -0,29 -0,49 -1,03 -0,46 -1,24 -0,99

1,06 -0,74 -0,15 0,11 -0,04 -0,35 -0,42 -0,49 -0,82 0,66 0,20 0,35 0,50 -0,53 1,07 -0,29 -0,88 0,01 -0,34 0,93 1,11 0,50 0,86 3,26 2,98 2,09 1,67 1,11 1,11 0,63 -0,20 0,80 0,39 0,92 0,85 1,05 0,99 -0,55 0,06 -1,05 -0,81 -0,87 -1,40 -1,20 -1,04 -1,97 -1,62 -0,82 -0,86 0,86 0,59 -0,71 -0,17 0,31 0,50

1,25 -0,81 -0,40 -2,10 -0,99 -0,14 -1,22 -1,45 -0,84 -0,27 -0,14 0,06 -0,22 -0,92 0,13 -2,22 -2,34 -3,00 -2,18 -0,65 0,05 0,27 0,95 2,37 3,23 0,83 1,40 1,99 2,97 0,39 1,28 1,41 3,24 2,82 3,00 2,08 2,72 -2,36 -1,42 -3,19 -2,32 -1,36 -0,44 -1,69 -1,71 -2,76 -2,38 -3,48 -2,87 -2,05 -0,33 -1,60 -1,38 -0,96 -0,08

Anexo IV

STM0962 STM0962 STM0963 STM0963 STM0964 STM0964 STM0965 STM0965 STM0966 STM0966 STM0968 STM0968 STM0969 STM0969 STM0970 STM0970 STM0973 STM0973 STM0974 STM0974 STM0975 STM0975 STM0976 STM0976 STM0977 STM0977 STM0978 STM0978 STM0979 STM0979 STM0980 STM0980 STM0981 STM0981 STM0982 STM0982 STM0983 STM0983 STM0984 STM0984 STM0985 STM0985 STM0986 STM0986 STM0987 STM0987 STM0988 STM0988 STM0989 STM0989 STM0990 STM0990 STM0991 STM0991 STM0992

ycaJ ycaJ serS serS dmsA dmsA dmsB dmsB dmsC dmsC ycaD ycaD ycaM ycaM pflA pflA pflB pflB focA focA ycaO ycaO ycaP ycaP serC serC aroA aroA ycaL ycaL cmk cmk rpsA rpsA himD himD ycaI ycaI msbA msbA lpxK lpxK ycaQ ycaQ ycaR ycaR kdsB kdsB STM0989 STM0989 ycbC ycbC smtA smtA mukF

-1,36 -0,63 -1,76 -2,15 0,70 0,92 2,58 3,54 0,81 3,89 -0,49 1,20 2,83 0,69 -1,15 0,26 -1,76 -0,08 -1,99 -1,37 -1,77 -1,93 -1,50 -0,75 -2,07 0,39 -2,38 -0,64 -1,19 -0,74 -1,78 -1,67 -2,42 -1,84 -2,76 -2,58 -0,77 -2,22 -3,21 -1,81 -0,75 -0,26 -0,54 0,21 0,24 -0,22 -1,18 -0,29 1,68 -0,23 -0,59 0,33 -1,99 0,58 -1,85

-0,71 -1,78 -0,47 -0,70 -0,17 -0,49 1,28 -0,23 0,18 0,18 -1,98 -1,00 -0,23 -0,07 0,47 0,08 1,09 1,40 -0,13 -0,13 -2,23 -2,60 -0,48 1,65 -0,14 0,25 -0,78 -0,42 -0,33 -1,25 -1,41 -1,29 -1,90 -1,69 -1,55 -1,70 -0,02 -0,95 -1,26 -1,74 -0,96 -1,40 -1,18 -0,37 0,32 0,17 -0,97 -0,87 0,44 -0,48 -0,29 -0,27 -0,57 -0,85 -1,16

-1,58 -2,02 -2,35 -1,83 -0,50 -0,16 0,70 2,27 0,72 2,97 -1,23 -0,10 0,26 -0,31 -0,66 0,41 0,19 0,20 0,98 0,96 -1,77 -1,37 -2,48 -1,34 -2,64 -2,38 -2,68 -1,79 0,16 0,01 -1,91 -1,63 -3,02 -3,32 -0,24 -0,24 0,02 -1,02 -2,11 -1,50 -1,55 -1,98 0,92 -0,58 0,77 0,78 -0,83 -1,18 0,97 0,91 -0,30 0,82 -2,00 -0,85 -1,28

STM0992 STM0993 STM0993 STM0994 STM0994 STM0995 STM0995 STM0996 STM0996 STM0997 STM0997 STM0998 STM0998 STM0999 STM0999 STM1000 STM1000 STM1001 STM1001 STM1002 STM1002 STM1003 STM1003 STM1004 STM1004 STM1005 STM1005 STM1006 STM1006 STM1008,S STM1008,S STM1008,S STM1008,S STM1010,1n STM1010,1n STM1020 STM1020 STM1020 STM1020 STM1021 STM1021 STM1022 STM1022 STM1028 STM1028 STM1029 STM1029 STM1030 STM1030 STM1031 STM1031 STM1032 STM1032 STM1033 STM1033

243

mukF mukE mukE mukB mukB ycbB ycbB ycbK ycbK ycbL ycbL aspC aspC ompF ompF asnS asnS STM1001 STM1001 STM1002 STM1002 STM1003 STM1003 pncB pncB STM1005 STM1005 STM1006 STM1006 STM1008,S STM1008,S STM1008,S STM1008,S STM1010,1n STM1010,1n STM1020 STM1020 STM1020 STM1020 STM1021 STM1021 STM1022 STM1022 STM1028 STM1028 STM1029 STM1029 STM1030 STM1030 STM1031 STM1031 STM1032 STM1032 STM1033 STM1033

-2,33 -1,37 -0,36 -1,94 -0,77 -1,25 -0,99 -1,58 -1,97 -2,78 -1,81 -1,69 -0,91 -0,07 -1,01 -2,42 -2,39 -1,62 -1,37 0,05 -1,06 -1,05 0,05 -0,45 -0,70 -0,72 0,33 2,32 2,80 1,01 1,17 1,78 3,16 1,77 2,69 0,04 2,61 2,26 3,14 2,39 3,05 0,94 1,90 1,43 1,31 1,00 2,30 0,71 1,75 1,68 2,49 0,49 -0,20 -0,45 0,53

-1,28 -0,89 -0,99 -1,35 -1,45 0,18 0,38 0,78 0,91 -0,24 -0,14 -0,13 0,54 0,94 0,98 -0,79 -0,86 -0,48 -0,96 0,09 -0,60 -0,32 0,25 -0,48 -0,38 -0,05 0,01 0,77 -0,09 2,03 -0,23 0,69 -0,94 0,43 0,19 0,10 0,33 0,84 0,54 0,99 0,47 -0,01 -0,89 0,43 -0,23 -0,26 -0,98 -0,64 -0,96 0,39 -0,30 -0,81 -2,59 1,21 -0,12

-1,56 -1,39 -1,25 -2,34 -2,09 -0,79 0,16 -1,90 -2,59 -2,28 -2,38 -1,64 -2,12 -1,82 -1,67 -2,56 -2,24 -0,46 -0,15 1,26 0,53 0,20 -0,44 -0,08 -0,96 -0,74 0,14 2,89 3,52 1,34 1,28 1,32 2,09 1,07 2,99 -0,71 -0,11 0,11 0,32 0,34 0,86 0,11 0,62 -0,26 -0,01 0,63 0,89 0,20 3,26 1,42 2,72 -0,75 -0,63 0,58 0,67

Anexo IV

STM1034 STM1034 STM1035 STM1035 STM1036 STM1036 STM1037 STM1037 STM1038 STM1038 STM1039 STM1039 STM1040 STM1040 STM1041 STM1041 STM1042 STM1042 STM1043 STM1043 STM1044 STM1044 STM1045 STM1045 STM1046 STM1046 STM1047 STM1047 STM1048 STM1048 STM1049 STM1049 STM1050 STM1050 STM1053 STM1053 STM1055 STM1055 STM1056 STM1056 STM1057 STM1057 STM1058 STM1058 STM1059 STM1059 STM1060 STM1060 STM1061 STM1061 STM1062 STM1062 STM1063 STM1063 STM1064

STM1034 STM1034 STM1035 STM1035 STM1036 STM1036 STM1037 STM1037 STM1038 STM1038 STM1039 STM1039 STM1040 STM1040 STM1041 STM1041 STM1042 STM1042 STM1043 STM1043 sodC sodC STM1045 STM1045 STM1046 STM1046 STM1047 STM1047 STM1048 STM1048 STM1049 STM1049 STM1050 STM1050 STM1053 STM1053 STM1055 STM1055 STM1056 STM1056 pepN pepN pyrD pyrD ycbW ycbW STM1060 STM1060 ycbY ycbY uup uup pqiA pqiA pqiB

1,15 2,39 -0,22 -0,50 0,83 -0,27 1,36 3,75 1,94 1,57 -0,43 0,71 0,48 1,61 2,23 2,25 -0,08 1,58 0,48 0,38 0,49 2,02 -0,20 0,83 1,30 1,20 1,98 2,32 2,67 2,15 2,22 3,44 1,51 1,79 0,32 2,70 -0,74 3,25 0,39 1,99 1,56 1,48 -0,37 1,42 -0,29 0,98 1,48 3,09 -0,16 0,03 0,42 1,54 -1,35 -0,75 0,82

-0,51 -0,35 0,83 -0,12 0,40 0,44 0,67 0,35 -2,00 -2,55 0,48 0,13 0,63 0,59 0,24 -1,67 0,64 0,85 0,72 -0,16 0,78 0,15 -2,33 -1,97 1,06 0,66 -0,99 -1,24 0,91 -0,28 2,44 1,42 1,63 1,13 2,69 2,47 0,92 1,70 1,10 0,79 -0,29 0,55 -0,76 0,59 1,04 1,39 1,24 1,49 -1,55 -0,88 -0,47 -0,94 -0,53 -0,69 -0,06

-1,06 0,53 0,00 -0,02 0,96 0,77 1,37 2,91 1,44 2,32 0,61 0,98 1,56 1,18 -0,28 -0,27 1,86 1,23 0,05 -0,94 -0,45 -0,19 -1,62 0,51 0,68 0,82 0,39 0,98 2,69 1,78 2,17 2,49 1,13 0,28 0,29 1,12 -0,54 1,31 1,54 1,77 -0,86 0,14 -0,90 1,26 -0,60 0,53 0,04 1,76 -1,78 -1,86 0,20 -0,10 -0,60 -0,72 1,57

STM1064 STM1065 STM1065 STM1067 STM1067 STM1068 STM1068 STM1069 STM1069 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1070 STM1071 STM1071 STM1074 STM1074 STM1075 STM1075 STM1076 STM1076 STM1077 STM1077 STM1078 STM1078

244

pqiB ymbA ymbA fabA fabA lonH lonH ycbG ycbG ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA ompA sulA sulA yccF yccF helD helD mgsA mgsA yccT yccT STM1078 STM1078

2,05 -0,70 0,12 -1,88 -1,15 -2,57 -1,11 -1,37 -1,30 -3,70 -3,83 -3,11 -4,10 -3,22 -3,86 -3,79 -3,71 -3,64 -3,88 -3,58 -2,78 -3,50 -3,81 -3,56 -3,44 -3,31 -2,76 -2,71 -2,44 -2,46 -3,40 -3,71 -2,52 -2,92 -3,10 -3,25 -2,80 -3,41 -3,03 -3,34 -2,97 -2,92 -2,80 -3,52 -2,36 -1,10 -0,15 -0,93 0,57 -1,02 -0,12 -0,15 0,34 0,89 1,16

-0,15 -0,19 -0,28 -1,53 -1,53 -1,25 -1,66 0,39 0,26 0,45 0,21 0,20 0,38 0,20 -0,18 0,29 0,11 0,38 0,11 0,53 0,55 0,08 0,26 0,88 0,51 0,66 0,81 0,92 0,52 1,00 0,40 0,53 0,46 0,93 0,32 0,49 0,75 0,71 0,40 0,38 0,95 0,74 0,57 -0,52 -0,19 -0,90 -0,87 -0,04 -0,40 0,02 0,16 0,17 -0,65 2,10 2,27

2,45 0,37 0,54 -2,23 -1,75 -2,40 -2,33 -0,51 -0,16 -0,68 -1,71 -1,17 -1,44 -1,45 -1,26 -1,34 -1,37 -1,19 -1,23 -1,26 -0,70 -1,42 -1,28 -1,30 -1,37 -1,20 -0,18 -0,90 -0,82 -0,98 -1,27 -0,87 -1,07 -1,28 -1,10 -0,83 -1,13 -1,27 -1,02 -0,92 -0,84 -1,18 -0,83 -0,91 -1,32 -1,07 -0,48 -0,43 -0,63 -0,57 0,64 0,19 0,17 1,24 1,70

Anexo IV

STM1079 STM1079 STM1080 STM1080 STM1081 STM1081 STM1082 STM1082 STM1083 STM1083 STM1084 STM1084 STM1085 STM1085 STM1086 STM1086 STM1097 STM1097 STM1098 STM1098 STM1099 STM1099 STM1100 STM1100 STM1101 STM1101 STM1102 STM1102 STM1103 STM1103 STM1104 STM1104 STM1105 STM1105 STM1106 STM1106 STM1107 STM1107 STM1108 STM1108 STM1109 STM1109 STM1111 STM1111 STM1112 STM1112 STM1113 STM1113 STM1114 STM1114 STM1115 STM1115 STM1116 STM1116 STM1117

yccV yccV yccW yccW STM1081 STM1081 STM1082 STM1082 yccX yccX yccK yccK yccA yccA serT serT STM1097 STM1097 hpaC hpaC hpaB hpaB hpaR hpaR hpaG hpaG hpaE hpaE hpaD hpaD hpaF hpaF hpaH hpaH hpaI hpaI hpaX hpaX hpaA hpaA STM1109 STM1109 yccD yccD cbpA cbpA scsA scsA scsB scsB scsC scsC scsD scsD agp

-0,84 -0,79 -0,52 -2,33 -1,17 0,57 -0,67 1,52 -0,31 0,22 0,25 2,00 0,27 0,16 -2,30 -1,11 -0,51 0,84 0,12 1,30 -0,39 1,09 -0,80 1,91 0,26 1,07 -0,37 0,16 -0,72 -0,32 0,05 1,48 0,43 0,98 -0,71 0,27 -0,39 1,07 -0,27 0,02 0,28 0,65 -1,09 -0,66 -1,31 -0,62 -0,23 0,49 -0,10 0,75 1,35 3,36 -0,46 1,25 -0,11

-0,06 -0,05 -0,78 -0,65 0,39 0,44 0,50 0,66 1,06 0,85 1,05 0,41 1,78 2,05 -0,76 -0,60 1,15 2,09 1,34 1,82 -0,56 -0,39 -0,32 0,19 1,14 0,85 0,02 0,91 0,25 -1,24 1,23 -0,32 -1,03 -1,02 -0,56 -0,53 -0,45 -0,23 -2,17 -0,90 0,22 -0,79 0,44 0,44 0,32 0,61 1,13 0,37 1,03 0,42 1,49 1,27 -0,25 0,24 3,22

0,46 1,60 0,57 0,12 -0,89 -0,19 0,26 1,82 0,65 0,86 1,05 1,38 2,28 2,65 3,08 3,45 0,62 2,61 -0,46 -1,13 -0,60 1,14 0,91 0,46 0,59 1,78 -0,62 0,25 0,42 0,20 0,44 1,00 -0,32 1,38 -0,01 0,28 -0,34 0,11 0,79 -1,56 0,31 1,58 0,24 0,88 0,37 0,64 -0,48 0,21 0,67 0,69 0,96 2,14 -0,17 0,61 2,63

STM1117 STM1118 STM1118 STM1119 STM1119 STM1121 STM1121 STM1122 STM1122 STM1123 STM1123 STM1125 STM1125 STM1127 STM1127 STM1128 STM1128 STM1129 STM1129 STM1130 STM1130 STM1131 STM1131 STM1132 STM1132 STM1133 STM1133 STM0949 STM1134 STM0949 STM1134 STM1135 STM1135 STM1136 STM1136 STM1137 STM1137 STM1138 STM1138 STM1146 STM1146 STM1147 STM1147 STM1148,S STM1148,S STM1149 STM1149 STM1150 STM1150 STM1151 STM1151 STM1152 STM1152 STM1153 STM1153

245

agp yccJ yccJ wraB wraB ymdF ymdF ycdC ycdC STM1123 STM1123 putP putP STM1127 STM1127 STM1128 STM1128 STM1129 STM1129 STM1130 STM1130 STM1131 STM1131 STM1132 STM1132 STM1133 STM1133 serW serX serW serX ycdW ycdW ycdX ycdX ycdY ycdY ycdZ ycdZ ymdA ymdA STM1147 STM1147 ymdC ymdC mdoC mdoC mdoG mdoG mdoH mdoH yceK yceK msyB msyB

0,42 1,20 1,73 0,42 1,28 0,86 2,48 -0,87 -0,17 -0,64 -0,15 0,36 0,26 -0,66 -0,14 -1,27 0,56 -0,08 -0,45 -0,05 0,35 0,13 0,91 -0,93 -0,77 -1,44 0,04 -0,19 0,90 0,95 1,64 0,28 1,42 -1,85 -1,33 0,12 1,35 -0,90 0,36 -0,76 -0,78 -0,65 1,21 -0,05 -0,27 -0,96 -0,08 -0,92 0,69 -2,15 -0,62 0,23 0,82 0,91 2,63

3,59 2,28 2,28 3,12 3,21 2,60 2,69 0,47 0,29 -2,81 -2,46 0,28 0,19 0,29 -0,44 -0,67 -0,45 0,96 -0,05 0,82 -0,31 0,25 0,28 -0,35 0,33 0,45 1,26 -1,18 -1,29 -1,16 -1,01 -0,68 -0,40 -0,82 -0,51 -0,09 -0,04 -0,99 -0,97 -0,45 -0,91 -0,63 -1,25 -0,27 -0,26 -0,31 -0,98 -0,52 0,09 -0,54 -0,64 -0,43 0,42 1,51 1,35

3,31 4,09 5,31 5,47 5,39 7,21 8,99 1,15 1,37 -0,73 -0,87 -0,87 -0,82 0,47 0,58 -0,97 -0,47 -0,16 -2,49 1,23 -0,47 1,24 1,54 -0,22 0,51 0,41 1,23 1,65 2,15 2,13 2,57 -0,95 0,19 -0,93 -0,29 -0,82 1,11 -1,39 0,01 -0,71 -0,23 0,10 0,67 0,01 -0,79 -1,17 -0,64 -1,11 -1,25 -0,58 -0,13 1,20 2,08 2,57 2,83

Anexo IV

STM1154 STM1154 STM1155 STM1155 STM1156 STM1156 STM1157 STM1157 STM1158 STM1158 STM1159 STM1159 STM1160 STM1160 STM1161,S STM1161,S STM1162 STM1162 STM1163 STM1163 STM1164 STM1164 STM1165 STM1165 STM1166 STM1166 STM1167 STM1167 STM1168 STM1168 STM1169 STM1169 STM1170 STM1170 STM1185 STM1185 STM1187 STM1187 STM1188 STM1188 STM1189 STM1189 STM1190 STM1190 STM1192 STM1192 STM1193 STM1193 STM1194 STM1194 STM1194 STM1194 STM1195 STM1195 STM1196

yceE yceE htrB htrB yceA yceA yceI yceI STM1158 STM1158 yceO yceO solA solA yceP yceP dinI dinI pyrC pyrC yceB yceB grxB grxB yceL yceL rimJ rimJ yceH yceH mviM mviM mviN mviN rne rne rluC rluC STM1188 STM1188 maf maf yceD yceD plsX plsX fabH fabH fabD fabD fabD fabD fabG fabG acpP

1,15 0,60 0,04 -0,96 -1,37 -0,77 -1,11 0,25 -0,56 0,67 -1,03 -0,93 -0,29 -1,00 -0,19 1,02 -0,93 0,21 -0,79 -0,93 1,49 1,51 -1,61 -1,36 -0,66 -0,26 -1,48 0,02 -1,32 -0,76 1,22 1,61 -2,22 -2,36 -1,44 -0,71 -1,50 -2,43 -0,87 0,50 -1,89 -0,88 -4,19 -3,62 -2,01 -1,03 -2,54 -2,28 -1,05 -2,27 -1,04 -1,18 -3,50 -3,43 -2,05

0,13 -0,12 0,51 1,34 -0,57 -0,69 0,15 -0,10 1,08 0,67 0,07 -1,04 -0,70 -0,60 -0,71 -0,70 -0,53 -0,10 -0,11 0,06 1,11 1,03 2,53 2,38 -0,31 0,13 -0,21 -0,29 -0,04 -0,21 -1,35 -1,29 -3,01 -2,14 -0,16 -0,35 -0,78 -1,77 -0,98 -0,92 -1,62 -0,93 -0,63 -0,56 -1,07 -0,38 -1,70 -0,99 -0,49 -1,17 -0,56 -0,72 -1,84 -1,60 0,47

1,49 1,73 1,05 -0,14 -1,69 -0,45 -1,08 -0,94 0,25 1,03 0,31 -0,75 -0,71 -0,06 -0,46 0,50 -1,99 -1,32 -0,68 -0,88 2,22 3,38 4,81 5,05 1,26 1,51 -0,20 -0,80 -1,99 -1,17 -0,85 0,15 -2,19 -2,21 -2,16 -2,27 -1,02 -2,41 -1,28 -0,57 -1,93 -1,11 -5,15 -4,87 -2,72 -2,74 -3,37 -3,45 -0,55 -4,17 0,58 -3,99 -3,11 -3,67 -1,51

STM1196 STM1197 STM1197 STM1198 STM1198 STM1199 STM1199 STM1200 STM1200 STM1201 STM1201 STM1202 STM1202 STM1203 STM1203 STM1204 STM1204 STM1205 STM1205 STM1206 STM1206 STM1207 STM1207 STM1208 STM1208 STM1209 STM1209 STM1210 STM1210 STM1211 STM1211 STM1212 STM1212 STM1213 STM1213 STM1214 STM1214 STM1215 STM1215 STM1216 STM1216 STM1217,S STM1217,S STM1218 STM1218 STM1219 STM1219 STM1220 STM1220 STM1221 STM1221 STM1222 STM1222 STM1223 STM1223

246

acpP fabF fabF pabC pabC yceG yceG tmk tmk holB holB ycfH ycfH ptsG ptsG fhuE fhuE ycfF ycfF ycfL ycfL ycfM ycfM ycfN ycfN nagZ nagZ ycfP ycfP ndh ndh ycfJ ycfJ ycfQ ycfQ ycfR ycfR ycfS ycfS mfd mfd ycfU ycfU ycfV ycfV ycfW ycfW ycfX ycfX cobB cobB potD potD potC potC

0,07 -2,89 -2,36 -0,33 -0,25 -0,10 -0,31 -2,43 -2,17 -2,27 -1,92 -2,04 -1,20 -2,33 -0,36 -1,14 -0,20 -2,66 -2,29 -1,28 -1,07 -1,27 -0,18 -1,79 -0,70 -0,99 -1,15 -1,18 -0,69 -0,50 0,09 -0,71 0,49 3,94 1,09 1,40 2,38 -0,52 1,00 -0,72 -0,26 -1,73 -1,93 -1,59 -1,88 1,88 2,67 -0,28 -0,61 -1,78 -0,75 -0,66 -0,54 -1,06 -1,26

0,29 -1,23 -0,17 -0,12 -0,70 0,14 -0,35 -1,15 -1,99 -1,77 -1,45 -1,85 -1,56 -1,02 -0,93 -0,25 0,40 -0,25 -0,24 0,62 0,78 0,33 0,77 -1,24 -0,56 -0,30 0,30 0,82 0,90 0,06 0,02 0,81 1,31 1,06 1,68 4,75 4,74 2,80 2,94 0,36 -0,55 -1,37 -1,98 -1,63 -1,86 2,72 3,26 -0,03 -0,16 2,29 2,85 3,81 3,60 2,85 3,17

-0,84 -2,96 -3,51 -1,34 -1,27 -1,25 -0,19 -1,63 -1,92 -2,47 -2,72 -1,77 -1,25 -1,87 -1,25 -0,06 -0,21 -0,56 -0,83 -0,68 -0,14 -0,91 -0,01 -1,42 -1,31 -0,25 -0,27 0,07 0,14 -0,75 0,43 2,37 2,67 2,38 2,15 1,48 2,28 0,48 1,09 -0,88 -0,58 -2,12 -1,49 -3,53 -2,07 -2,01 -1,97 -1,39 -0,55 -2,34 -2,04 -0,94 -1,79 -2,73 -1,63

Anexo IV

STM1225 STM1225 STM1226 STM1226 STM1227 STM1227 STM1228 STM1228 STM1229 STM1229 STM1230 STM1230 STM1231 STM1231 STM1232 STM1232 STM1233 STM1233 STM1234,S STM1234,S STM1235 STM1235 STM1236 STM1236 STM1237 STM1237 STM1239 STM1239 STM1240 STM1240 STM1241 STM1241 STM1242 STM1242 STM1246 STM1246 STM1247 STM1247 STM1249 STM1249 STM1250 STM1250 STM1251 STM1251 STM1252 STM1252 STM1253 STM1253 STM1254 STM1254 STM1255 STM1255 STM1256 STM1256 STM1257

potB potB potA potA pepT pepT STM1228 STM1228 ycfD ycfD phoQ phoQ phoP phoP purB purB ycfC ycfC trmU trmU ymfB ymfB STM1236 STM1236 ymfC ymfC STM1239 STM1239 envF envF msgA msgA envE envE pagC pagC STM1249 STM1249 STM1250 STM1250 STM1251 STM1251 STM1252 STM1252 STM1253 STM1253 STM1254 STM1254 STM1255 STM1255 STM1256 STM1256 STM1257

-1,67 -1,34 -0,57 -0,21 0,19 0,06 -1,31 -0,17 0,03 1,44 -1,13 0,05 -0,16 1,16 -1,76 0,15 -2,06 -1,61 -1,60 -2,24 -1,24 -0,88 -0,68 -0,27 -1,25 0,83 -0,41 -0,08 2,55 3,87 1,32 1,97 1,01 2,02 2,25 3,23 0,16 0,81 2,18 1,94 -0,31 1,85 2,56 2,93 -0,24 0,76 0,38 0,46 1,28 1,54 0,48 1,77 0,62 0,33 1,32

0,86 1,38 -0,72 -0,76 1,02 0,48 -0,47 -0,51 0,12 -0,26 -0,68 0,08 0,80 0,52 0,74 1,19 0,06 0,11 -0,23 -0,86 -0,76 -0,66 0,66 0,50 0,09 0,13 -1,14 -0,22 2,59 1,60 1,46 1,53 1,33 0,80 -0,32 0,09 -1,93 -0,71 1,65 1,36 4,03 4,66 2,22 2,44 0,06 -0,10 0,51 0,16 -0,33 0,40 0,21 0,49 -0,36 -0,51 -0,17

-0,04 -1,24 1,44 0,63 0,22 0,84 -1,03 -0,45 -1,36 -0,46 0,69 -0,97 -0,94 -0,38 -2,36 -1,65 -2,31 -3,05 -2,46 -2,59 -0,73 -1,01 -0,08 0,49 0,35 1,73 -1,13 0,20 3,56 4,38 0,87 1,20 -1,21 -0,53 0,21 0,47 -1,09 -0,60 1,89 1,23 1,02 -0,56 3,94 5,00 -0,90 -0,33 -1,08 -0,37 -1,28 -0,81 -0,72 1,21 -0,19 -0,48 -0,73

STM1257 STM1258 STM1258 STM1259 STM1259 STM1260 STM1260 STM1261 STM1261 STM1262 STM1262 STM1263 STM1263 STM1264 STM1264 STM1265 STM1265 STM1266 STM1266 STM1267 STM1267 STM1268 STM1268 STM1269 STM1269 STM1270 STM1270 STM1271 STM1271 STM1273 STM1273 STM1273,1n STM1273,1n STM1274 STM1274 STM1275 STM1275 STM1276 STM1276 STM1277 STM1277 STM1278 STM1278 STM1279 STM1279 STM1280 STM1280 STM1282 STM1282 STM1283 STM1283 STM1284 STM1284 STM1285 STM1285

247

STM1257 STM1258 STM1258 STM1259 STM1259 STM1260 STM1260 STM1261 STM1261 STM1263 STM1263 aadA aadA STM1265 STM1265 STM1266 STM1266 STM1267 STM1267 STM1268 STM1268 STM1269 STM1269 yeaS yeaS yeaR yeaR STM1273 STM1273 STM1273,1n STM1273,1n yeaQ yeaQ yaoF yaoF STM1276 STM1276 yeaO yeaO yeaN yeaN yeaM yeaM yeaL yeaL yeaK yeaK yeaJ yeaJ yeaH yeaH yeaG yeaG

-0,10 0,72 2,47 -0,33 0,49 1,28 2,71 0,09 1,02 0,01 0,85 -0,49 -0,12 0,34 1,86 0,00 1,09 0,18 1,74 -0,61 -0,75 -0,97 2,02 -0,20 1,20 -0,19 -0,29 -0,52 0,28 1,25 2,31 -0,76 -0,49 0,20 1,09 0,54 1,64 0,23 0,97 -0,04 1,21 0,18 1,01 -0,23 0,22 -0,53 0,95 1,48 -0,33 -0,16 0,56 4,62 5,57 -0,04 1,59

-0,51 1,32 0,37 -0,28 -0,44 0,24 0,68 0,45 0,37 1,36 1,83 0,81 -0,40 0,30 -0,01 0,18 0,24 0,25 0,55 0,22 -0,08 1,41 0,64 -0,33 -0,44 2,46 -0,25 2,31 2,49 -0,21 -0,56 1,05 1,25 2,90 3,18 0,47 0,91 1,19 0,91 1,43 1,50 0,25 0,51 1,32 0,52 -0,58 0,24 0,01 -1,13 1,06 0,62 3,65 2,68 3,95 4,00

0,77 -0,10 -0,08 -0,10 0,16 2,51 3,74 2,05 3,05 1,64 2,33 0,87 1,58 -0,39 2,02 0,46 0,57 0,41 0,55 1,34 1,77 -0,04 0,49 -0,96 -0,34 0,33 -0,65 -0,07 -0,96 -0,13 2,08 -0,65 0,49 0,76 1,56 0,03 0,80 -0,83 -0,38 -0,49 0,85 0,48 1,05 0,31 0,53 -0,11 -0,06 0,51 -2,09 -0,87 0,53 4,77 2,57 3,06 3,58

Anexo IV

STM1286 STM1286 STM1287 STM1287 STM1288 STM1288 STM1289 STM1289 STM1291 STM1291 STM1292 STM1292 STM1293 STM1293 STM1294 STM1294 STM1295 STM1295 STM1296 STM1296 STM1297 STM1297 STM1298 STM1298 STM1299 STM1299 STM1300 STM1300 STM1301 STM1301 STM1302 STM1302 STM1303 STM1303 STM1304 STM1304 STM1305 STM1305 STM1306 STM1306 STM1307 STM1307 STM1308 STM1308 STM1309 STM1309 STM1310 STM1310 STM1311 STM1311 STM1312 STM1312 STM1313 STM1313 STM1314

mipA mipA STM1287 STM1287 STM1288 STM1288 yeaD yeaD yeaA yeaA yeaC yeaC pncA pncA ansA ansA sppA sppA ydjA ydjA selD selD topB topB gdhA gdhA STM1300 STM1300 STM1301 STM1301 xthA xthA argD argD astA astA astD astD astB astB astE astE spy spy STM1309 STM1309 nadE nadE osmE osmE celA celA celB celB celC

-2,43 -1,41 -0,35 -0,65 -1,28 -0,63 -1,59 -1,49 -2,35 -0,72 -1,01 -0,51 -0,58 0,07 -2,88 -0,41 -2,16 -1,65 -0,65 -0,16 2,56 2,99 0,96 1,59 -1,16 0,37 0,68 -0,48 -1,41 -1,25 -0,92 0,02 -0,21 -0,63 -0,51 0,29 -0,10 0,97 -0,49 0,68 -0,79 -0,16 -0,20 1,72 1,51 0,81 -0,85 0,36 -0,41 1,04 -0,08 0,53 2,47 3,03 -0,23

1,10 1,40 0,48 -0,48 -0,13 -0,91 -0,53 -0,43 0,03 0,22 -0,12 -0,08 -1,21 -1,37 -1,38 -1,28 -1,36 -1,15 -0,35 -0,51 -1,27 -1,71 -0,67 0,21 0,73 0,22 -0,54 -0,79 -0,61 -0,84 0,03 0,30 1,52 0,69 2,21 2,35 1,71 2,72 1,42 0,82 0,75 -0,28 1,23 1,31 1,04 0,91 2,04 1,55 3,21 2,66 -0,18 0,06 2,00 1,15 1,67

-2,65 -2,70 1,16 -0,21 0,41 -0,59 -1,58 -1,50 -1,03 -0,47 -1,00 -0,25 -1,49 -0,71 -2,48 -1,42 -2,78 -2,52 -1,55 -0,53 -1,74 -1,25 1,34 1,46 -0,97 -1,13 -0,98 0,20 -0,57 -1,12 -1,22 -0,44 1,63 0,66 1,67 2,74 3,02 2,47 1,13 1,40 0,01 0,97 3,65 4,32 2,02 2,42 2,62 2,37 4,96 5,76 1,60 1,35 4,19 4,89 1,53

STM1314 STM1315 STM1315 STM1316 STM1316 STM1317 STM1317 STM1318 STM1318 STM1319 STM1319 STM1320 STM1320 STM1321 STM1321 STM1322 STM1322 STM1323 STM1323 STM1324 STM1324 STM1325 STM1325 STM1327 STM1327 STM1328 STM1328 STM1329 STM1329 STM1330 STM1330 STM1332 STM1332 STM1333 STM1333 STM1334,c STM1334,c STM1335 STM1335 STM1336 STM1336 STM1337 STM1337 STM1338 STM1338 STM1339 STM1339 STM1340 STM1340 STM1341 STM1341 STM1342 STM1342 STM1343 STM1343

248

celC celD celD celF celF celG celG katE katE cedA cedA ydjN ydjN ydjM ydjM yniC yniC yniB yniB STM1324 STM1324 ydiZ ydiZ ydiY ydiY STM1328 STM1328 STM1329 STM1329 STM1330 STM1330 rfc rfc thrS thrS infC infC rpmI rpmI rplT rplT pheS pheS pheT pheT himA himA btuC btuC btuE btuE btuD btuD nlpC nlpC

0,09 -0,54 0,55 -1,09 0,48 0,07 0,84 0,23 1,48 -0,13 0,46 -0,94 0,25 -0,44 0,06 0,23 0,21 -1,13 -0,83 -1,27 0,79 -0,41 0,67 -1,49 -1,29 -0,83 -0,09 3,72 2,18 0,15 1,15 -1,12 -0,76 -2,47 -1,77 -2,87 -2,53 -2,50 -1,38 -2,92 -0,99 -2,05 -1,82 -1,78 -0,79 -1,69 -0,49 -1,45 -0,70 -0,97 -0,36 -0,66 0,68 -1,35 -0,07

1,64 0,47 0,73 1,84 1,44 1,64 1,37 0,81 0,36 0,12 0,86 0,36 0,91 0,06 -0,58 0,22 0,04 0,26 0,57 1,14 1,55 1,76 1,86 -1,27 -1,71 -1,48 -1,35 1,86 0,92 -0,25 -1,20 0,21 -0,57 -0,13 -0,06 0,40 0,62 0,48 0,83 -1,95 -0,03 -1,49 -1,54 0,23 0,50 0,70 1,16 -0,95 -1,17 0,71 0,38 0,55 0,82 0,89 1,24

2,31 0,47 0,20 -0,28 0,50 2,74 2,39 2,11 3,11 0,66 1,12 -0,30 0,15 0,10 0,35 -0,99 -0,19 -0,13 0,44 0,85 1,39 1,01 1,89 -0,91 -1,31 -0,96 -0,37 4,20 2,77 0,47 0,24 -0,47 0,20 -3,38 -3,05 -4,84 -4,40 -4,50 -4,36 -4,09 -3,81 -2,89 -2,72 -0,37 0,31 0,28 0,97 -1,10 -0,88 0,69 2,07 0,83 1,31 -0,43 0,19

Anexo IV

STM1344 STM1344 STM1345 STM1345 STM1346 STM1346 STM1347 STM1347 STM1348 STM1348 STM1351 STM1351 STM1352 STM1352 STM1353 STM1353 STM1354 STM1354 STM1355 STM1355 STM1356 STM1356 STM1357,S STM1357,S STM1358 STM1358 STM1359 STM1359 STM1360 STM1360 STM1361 STM1361 STM1362 STM1362 STM1363 STM1363 STM1364 STM1364 STM1365 STM1365 STM1366 STM1366 STM1367 STM1367 STM1368 STM1368 STM1369 STM1369 STM1370 STM1370 STM1371 STM1371 STM1372 STM1372 STM1373

ydiV ydiV ydiU ydiU ydiE ydiE aroH aroH ydiA ydiA ydiT ydiT ydiS ydiS ydiR ydiR ydiQ ydiQ ydiP ydiP ydiO ydiO ydiF ydiF aroD aroD aroE aroE ydiN ydiN ydiM ydiM ydiL ydiL rprA rprA ydiK ydiK ydiJ ydiJ STM1366 STM1366 ydiH ydiH STM1368 STM1368 sufA sufA sufB sufB sufC sufC sufD sufD sufS

-0,24 0,45 0,90 1,22 0,29 2,12 -0,94 -0,89 -0,08 0,09 1,83 3,63 -0,93 0,13 0,77 1,56 1,42 2,78 0,28 0,63 -3,11 0,03 0,01 0,00 -1,00 1,44 0,15 2,28 1,56 1,78 -0,68 1,71 0,04 1,12 -0,73 -0,29 1,17 2,28 -1,64 -1,09 -0,79 0,18 2,48 0,12 -0,38 0,06 0,57 1,39 -0,49 0,39 -0,50 0,91 -0,66 -0,31 0,81

0,17 -0,15 1,63 1,00 1,28 0,87 -0,20 -0,35 1,24 1,36 -0,41 -0,30 -0,16 -0,30 -1,11 -0,43 0,38 0,14 1,49 -0,20 -1,81 -4,34 0,11 -0,01 0,68 0,18 0,48 0,88 -0,26 -0,68 -0,76 -1,47 0,81 1,40 0,43 0,37 0,73 0,55 0,11 -0,05 0,38 0,71 1,29 3,32 -0,05 -0,33 4,77 4,89 3,26 4,89 3,94 4,31 3,01 3,60 4,57

0,17 1,05 2,04 1,55 -0,11 -0,48 -0,74 0,05 -0,06 0,34 0,04 1,68 -1,12 -1,39 -0,86 0,56 0,39 1,44 0,94 0,04 -2,88 -2,83 -0,91 0,85 -1,25 -0,15 -0,08 0,68 -0,20 0,46 -0,75 0,75 0,88 1,23 1,31 0,62 1,70 2,31 -1,19 -0,39 -1,25 -0,27 1,31 0,85 -0,60 0,09 1,31 2,05 0,22 1,66 0,97 1,37 0,54 0,89 1,39

STM1373 STM1374 STM1374 STM1375 STM1375 STM1376 STM1376 STM1377 STM1377 STM1423 STM1423 STM1424 STM1424 STM1425 STM1425 STM1426 STM1426 STM1427 STM1427 STM1428 STM1428 STM1429 STM1429 STM1430 STM1430 STM1431 STM1431 STM1432 STM1432 STM1433 STM1433 STM1434 STM1434 STM1435 STM1435 STM1436 STM1436 STM1437 STM1437 STM1438 STM1438 STM1439 STM1439 STM1440 STM1440 STM1441 STM1441 STM1442 STM1442 STM1444 STM1444 STM1445 STM1445 STM1446 STM1446

249

sufS ynhA ynhA ynhG ynhG lppB lppB lpp lpp valW valW valV valV ydhE ydhE ribE ribE cfa cfa ydhC ydhC ydhB ydhB purR purR sodB sodB ydhO ydhO ydhD ydhD rnt rnt gloA gloA nemA nemA ydhM ydhM ydhL ydhL ydhF ydhF sodC sodC STM1441 STM1441 ydhJ ydhJ slyA slyA slyB slyB ydhH ydhH

1,64 0,28 0,28 -1,73 -1,05 -2,78 -2,27 -3,96 -3,43 0,33 0,46 -0,87 -0,77 -1,47 -1,32 -0,29 0,03 -0,29 -0,82 -1,68 1,23 -0,65 -0,74 -1,05 -0,93 -0,77 -0,53 -0,62 0,19 -1,61 1,36 -1,16 -0,49 -0,64 -0,45 -0,90 -1,18 -2,34 -1,25 -1,79 0,46 -1,66 -2,12 -0,49 -0,39 -0,76 -0,13 -0,58 -0,24 -0,53 -0,32 -0,66 -0,09 -1,70 -0,21

4,50 2,98 3,06 -0,47 0,21 -2,17 -1,68 -0,86 -0,98 -1,05 -0,67 -0,58 -0,76 0,33 0,23 0,03 0,29 0,06 0,59 -1,12 0,00 -0,50 -0,26 -0,57 -0,19 -0,58 -0,62 -0,11 -0,09 -0,50 -0,77 -0,72 -0,27 0,74 0,48 -0,44 -1,06 -1,51 -1,58 0,29 -0,56 -0,68 -0,74 0,95 1,33 2,41 2,58 -0,57 -1,22 0,26 0,47 0,91 0,60 -0,30 -0,38

2,44 0,82 1,05 0,14 0,39 -1,12 -0,81 -2,54 -2,19 0,23 1,14 -0,39 -0,21 -0,42 -0,39 -0,41 0,15 0,84 0,93 -0,28 2,10 -0,53 -0,19 -0,12 -1,10 -1,98 -1,50 -1,99 -1,10 -1,64 -2,35 -2,34 -1,54 0,03 0,72 -1,81 -1,06 -1,11 -1,46 0,74 -1,87 0,47 -0,11 2,50 3,03 2,85 3,26 -1,12 -0,13 -0,29 -0,06 0,88 1,48 -0,43 0,06

Anexo IV

STM1447 STM1447 STM1448 STM1448 STM1449 STM1449 STM1450 STM1450 STM1451 STM1451 STM1452 STM1452 STM1453 STM1453 STM1454 STM1454 STM1455 STM1455 STM1456 STM1456 STM1457 STM1457 STM1458 STM1458 STM1459 STM1459 STM1460 STM1460 STM1461,S STM1461,S STM1462,S STM1462,S STM1463 STM1463 STM1466 STM1466 STM1467 STM1467 STM1470 STM1470 STM1471 STM1471 STM1472 STM1472 STM1473 STM1473 STM1475 STM1475 STM1476 STM1476 STM1477 STM1477 STM1478 STM1478 STM1479

ydhA ydhA pdxH pdxH tyrS tyrS pdxY pdxY gst gst ydgR ydgR nth nth ydgQ ydgQ ydgP ydgP rnfD rnfD STM1457 STM1457 ydgM ydgM STM1459 STM1459 ydgK ydgK ydgT ydgT ydgJ ydgJ add add ydgA ydgA manA manA tus tus rstB rstB STM1472 STM1472 ompN ompN rstA rstA ydgC ydgC ydgI ydgI ydgH ydgH pntA

-0,03 -0,13 -2,79 -0,47 0,79 0,28 0,47 0,87 -0,80 -3,03 -0,21 0,55 -0,79 -0,58 -1,70 -0,57 -0,03 0,94 -1,35 -0,45 -0,76 -1,45 -1,75 -0,55 -1,57 -0,74 -1,05 -0,31 -1,20 -0,07 -1,24 0,78 -1,32 -0,19 -2,30 -2,11 -0,89 -0,66 -0,41 -0,67 -0,26 1,84 -1,84 -0,25 -2,18 -1,83 -1,75 -1,17 -1,16 0,34 -0,59 0,63 -3,13 -1,73 -2,02

-0,30 0,13 -1,49 -1,15 -0,68 -1,03 0,12 -0,30 0,57 1,13 0,55 0,38 -0,07 -1,23 -0,36 -1,13 -0,58 -0,54 -1,49 -1,07 -0,63 -0,84 -0,08 -0,15 -0,63 -0,33 0,03 0,27 -0,02 0,22 -0,01 -0,17 -0,41 -0,43 -1,56 -1,49 -1,55 -1,13 0,68 0,68 -0,97 -1,67 -0,52 -0,03 -1,84 -2,10 -0,86 -0,93 -1,05 -1,08 -0,70 -1,11 -1,43 -1,47 -0,37

-0,87 -0,09 -2,93 -3,78 -1,31 -1,15 -0,65 -0,60 -0,90 -0,07 -1,93 -0,96 -0,01 -2,99 -1,46 -1,10 -1,38 -0,71 -1,40 -2,45 -1,97 -1,24 -1,52 -0,86 -1,62 -1,66 -1,51 -2,25 -1,96 -1,86 -0,29 -0,24 -1,03 -0,55 -1,08 -0,71 -1,35 -0,98 1,21 1,24 -0,75 0,38 -0,02 0,89 -1,20 -2,42 -1,58 -2,40 -1,09 -0,53 -0,03 -0,46 -2,56 -3,29 -1,52

STM1479 STM1480 STM1480 STM1481 STM1481 STM1482 STM1482 STM1483 STM1483 STM1484 STM1484 STM1486 STM1486 STM1487 STM1487 STM1488 STM1488 STM1489 STM1489 STM1490 STM1490 STM1491 STM1491 STM1492 STM1492 STM1493 STM1493 STM1494 STM1494 STM1495 STM1495 STM1496 STM1496 STM1497 STM1497 STM1498 STM1498 STM1499 STM1499 STM1500 STM1500 STM1501 STM1501 STM1502 STM1502 STM1503 STM1503 STM1504 STM1504 STM1505 STM1505 STM1506 STM1506 STM1508 STM1508

250

pntA pntB pntB STM1481 STM1481 ydgF ydgF ydgE ydgE STM1484 STM1484 ynfM ynfM ynfL ynfL mlc mlc bioD bioD STM1490 STM1490 STM1491 STM1491 STM1492 STM1492 STM1493 STM1493 STM1494 STM1494 ynfI ynfI STM1496 STM1496 STM1497 STM1497 STM1498 STM1498 STM1499 STM1499 ynfD ynfD ynfC ynfC speG speG ynfB ynfB ynfA ynfA rspA rspA rspB rspB ydfI ydfI

-1,65 -1,21 -0,81 0,18 0,45 -0,41 -0,11 -0,86 0,27 0,14 -0,45 0,41 2,72 -0,44 0,86 -0,33 -0,61 -0,90 0,10 0,26 0,62 0,11 0,19 0,16 -0,43 0,72 1,21 -0,19 0,38 -0,70 -0,73 -0,75 -0,65 1,61 2,05 0,68 1,54 4,09 3,96 -0,48 0,65 -0,39 -0,52 -0,60 -0,52 -0,75 -0,44 -0,31 0,14 -0,45 0,59 -0,25 2,17 1,10 1,81

-0,89 0,15 -0,23 0,40 0,12 0,63 0,10 1,09 0,63 0,32 -0,06 -0,89 -1,12 0,05 0,22 0,05 -1,23 -0,31 -0,03 0,34 0,07 0,88 0,01 0,53 0,40 1,24 0,58 1,01 0,58 0,07 0,61 0,16 0,16 0,56 -0,34 -0,36 -0,64 0,50 0,07 0,57 0,26 -0,22 -0,46 0,25 0,19 -0,25 0,28 -1,08 -1,19 0,92 1,28 2,15 2,19 -0,31 -0,50

-1,40 -0,52 -0,05 -1,13 -0,38 0,16 0,54 -0,34 -0,74 0,33 -1,58 1,61 2,41 0,32 2,39 -0,64 -1,32 0,72 0,57 0,51 1,07 0,61 0,72 0,99 1,28 1,83 2,43 0,94 1,54 0,80 -0,64 -1,37 -1,00 0,45 0,51 -0,40 0,85 1,45 1,39 0,82 1,68 -0,55 -1,02 -1,12 -0,61 -2,32 -1,72 -1,00 -0,78 -1,41 0,48 0,48 -0,09 -0,56 1,07

Anexo IV

STM1510 STM1510 STM1511 STM1511 STM1512 STM1512 STM1514 STM1514 STM1515 STM1515 STM1516 STM1516 STM1517 STM1517 STM1518 STM1518 STM1519,S STM1519,S STM1520 STM1520 STM1521 STM1521 STM1522 STM1522 STM1523 STM1523 STM1524 STM1524 STM1525 STM1525 STM1526 STM1526 STM1527 STM1527 STM1528 STM1528 STM1530 STM1530 STM1531 STM1531 STM1532 STM1532 STM1533 STM1533 STM1534 STM1534 STM1535 STM1535 STM1536 STM1536 STM1537 STM1537 STM1538 STM1538 STM1539

ydfH ydfH ydfG ydfG dcp dcp ydeJ ydeJ ydeI ydeI ydeE ydeE ydeD ydeD marB marB marA marA marR marR marC marC ydeA ydeA yneJ yneJ yneI yneI yneH yneH yneG yneG STM1527 STM1527 STM1528 STM1528 STM1530 STM1530 STM1531 STM1531 STM1532 STM1532 STM1533 STM1533 STM1534 STM1534 STM1535 STM1535 STM1536 STM1536 STM1537 STM1537 STM1538 STM1538 STM1539

3,10 2,37 -1,24 -0,42 0,17 0,28 1,97 1,28 1,33 2,73 0,36 1,11 -0,83 -0,14 -0,39 0,63 -0,26 0,85 -0,43 1,26 0,07 1,43 -0,03 0,77 0,05 1,01 -1,13 -0,46 -0,68 1,56 -0,02 2,72 -1,90 -0,83 -0,41 0,08 -0,19 0,71 -0,64 0,67 -1,17 0,19 0,02 -0,42 -0,59 4,23 2,86 3,96 -0,59 -0,42 0,07 0,70 -0,45 0,34 1,61

-0,43 -0,05 0,23 0,48 0,86 0,74 0,73 0,84 2,92 3,17 0,34 0,52 0,87 0,26 0,80 1,17 0,32 0,47 0,13 0,71 1,16 0,91 0,32 -0,01 -0,02 -0,57 -0,52 -0,89 -1,40 -0,86 -0,08 0,30 -0,49 -0,87 -1,06 -0,96 -0,88 -1,36 0,29 -0,85 0,18 0,90 0,91 -0,03 0,58 -0,52 3,53 3,62 0,06 0,42 0,88 0,71 -1,96 -1,34 0,56

2,46 2,42 -0,48 0,08 1,36 1,35 3,87 4,79 3,83 5,20 1,80 1,15 -0,14 -0,03 -0,51 -0,12 -1,30 -0,22 -0,21 1,00 0,63 1,07 -0,35 0,24 -0,83 1,11 -1,41 -1,13 -1,65 0,41 0,13 0,77 -1,64 -1,16 -2,41 -1,60 -0,72 0,43 -0,78 0,62 -0,16 0,72 1,12 0,44 0,38 1,05 4,01 5,18 -1,13 0,03 1,38 2,03 -1,07 -0,10 2,76

STM1539 STM1540 STM1540 STM1541 STM1541 STM1542 STM1542 STM1543 STM1543 STM1544 STM1544 STM1545 STM1545 STM1546 STM1546 STM1547 STM1547 STM1548,s STM1548,s STM1549 STM1549 STM1551 STM1551 STM1551,1n STM1551,1n STM1552 STM1552 STM1554 STM1554 STM1555 STM1555 STM1556 STM1556 STM1557 STM1557 STM1558 STM1558 STM1559 STM1559 STM1560 STM1560 STM1561 STM1561 STM1562 STM1562 STM1563 STM1563 STM1564 STM1564 STM1565 STM1565 STM1566 STM1566 STM1567 STM1567

251

STM1539 STM1540 STM1540 STM1541 STM1541 STM1542 STM1542 STM1543 STM1543 pqaA pqaA STM1545 STM1545 STM1546 STM1546 STM1547 STM1547 STM1548,s STM1548,s STM1549 STM1549 STM1551 STM1551 STM1551,1n STM1551,1n STM1552 STM1552 STM1554 STM1554 STM1555 STM1555 STM1556 STM1556 STM1557 STM1557 STM1558 STM1558 STM1559 STM1559 STM1560 STM1560 STM1561 STM1561 STM1562 STM1562 osmC osmC yddX yddX rpsV rpsV sfcA sfcA adhP adhP

2,50 0,14 0,54 -0,44 1,13 -0,63 -0,21 -0,54 0,26 1,49 2,10 -1,16 -0,05 0,16 -0,04 -0,68 -0,06 -0,14 1,05 -0,83 0,91 -0,20 0,71 -0,89 0,45 -0,78 -0,77 -0,55 0,34 -0,70 0,12 -0,52 0,77 0,77 2,20 -0,39 0,35 0,67 1,55 -0,49 1,04 -0,03 -0,20 -0,06 1,38 -0,40 0,22 -1,11 1,54 0,22 -0,54 -1,81 -0,85 -0,51 0,83

0,45 1,18 0,40 -0,14 0,37 0,22 -0,25 -0,56 -0,97 -0,53 0,28 0,06 -0,83 0,73 1,28 0,44 0,45 1,12 0,69 0,30 0,03 1,73 1,43 0,05 -0,73 -0,63 -0,99 -0,01 -0,03 0,11 -0,99 0,60 1,10 0,55 0,71 0,28 -0,62 -0,38 -0,54 0,78 0,24 -0,05 -1,04 2,42 0,98 4,34 4,02 1,01 0,61 1,39 0,59 -0,20 -0,65 3,32 2,74

4,14 0,03 0,55 -1,15 -0,63 -0,04 -0,02 -0,66 -0,33 4,46 1,68 -0,15 -0,26 2,34 2,10 -0,65 -0,36 -0,12 0,09 -0,73 -2,28 -0,29 0,37 -0,87 -1,64 -0,17 -0,03 -1,95 0,51 -0,97 -0,49 0,09 0,76 1,37 3,06 0,16 0,81 1,00 1,53 0,57 1,73 0,10 0,23 0,51 1,33 4,42 4,35 2,46 3,43 2,21 2,58 -0,10 0,23 2,23 3,00

Anexo IV

STM1568 STM1568 STM1569 STM1569 STM1570 STM1570 STM1571 STM1571 STM1572 STM1572 STM1573,Sc STM1573,Sc STM1574 STM1574 STM1575 STM1575 STM1576 STM1576 STM1577 STM1577 STM1578 STM1578 STM1579 STM1579 STM1580 STM1580 STM1581 STM1581 STM1582 STM1582 STM1584 STM1584 STM1585 STM1585 STM1586 STM1586 STM1587 STM1587 STM1588 STM1588 STM1589 STM1589 STM1590 STM1590 STM1591 STM1591 STM1592 STM1592 STM1593 STM1593 STM1594 STM1594 STM1595 STM1595 STM1596

fdnI fdnI fdnH fdnH fdnG fdnG yddG yddG nmpC nmpC STM1573,Sc STM1573,Sc smvA smvA STM1575 STM1575 narU narU narZ narZ narY narY narW narW narV narV yddE yddE nhoA nhoA ansP ansP STM1585 STM1585 STM1586 STM1586 yncD yncD yncC yncC yncB yncB yncA yncA ydcZ ydcZ ydcY ydcY srfA srfA srfB srfB srfC srfC ydcX

2,73 3,40 -0,08 0,61 -0,97 0,52 0,91 0,11 -3,69 -2,09 -1,21 -0,61 -2,34 -1,09 -0,78 -0,95 1,41 1,28 2,91 4,53 1,35 1,61 0,11 2,09 0,90 1,64 0,26 -0,30 -1,16 -0,32 -0,96 -0,94 2,04 2,19 -0,09 0,40 -0,25 -1,48 1,20 2,33 -0,57 1,34 -0,47 -0,22 -0,86 -0,18 4,13 1,84 -1,12 -0,96 -1,42 -1,16 -1,08 -0,21 -1,40

1,82 1,58 0,22 0,17 -1,69 -1,69 -2,27 -2,34 -2,52 -1,98 -1,55 -2,05 -1,74 -1,93 -0,97 -0,41 0,75 0,37 0,69 0,60 -1,48 -3,16 -0,72 0,17 0,55 -0,07 -1,39 -0,15 -0,39 -0,64 -0,57 -0,45 0,65 1,46 0,80 1,88 0,62 0,31 0,75 0,73 0,13 0,91 0,20 0,09 -0,01 -0,77 -0,38 -1,51 -2,16 -2,57 -2,23 -2,50 -0,59 -0,67 -1,26

4,36 5,26 0,42 0,77 -1,68 -1,32 -2,60 -2,43 -5,46 -5,00 -2,90 -3,66 -2,26 -2,82 -0,98 -0,61 1,31 1,95 3,91 5,68 -5,06 -3,01 2,29 0,74 0,60 2,00 -0,17 -0,75 -1,37 0,00 -0,69 -1,34 0,64 1,39 -1,39 -0,09 0,91 0,02 1,45 2,58 1,34 1,57 -1,02 -0,39 -0,61 -1,29 1,47 0,81 -2,17 -1,63 -1,76 -0,81 -1,32 -0,99 -1,27

STM1596 STM1597 STM1597 STM1598 STM1598 STM1599 STM1599 STM1601 STM1601 STM1603 STM1603 STM1604 STM1604 STM1605 STM1605 STM1606 STM1606 STM1607 STM1607 STM1608 STM1608 STM1609 STM1609 STM1610 STM1610 STM1611 STM1611 STM1612 STM1612 STM1613 STM1613 STM1614 STM1614 STM1615 STM1615 STM1616 STM1616 STM1617 STM1617 STM1618 STM1618 STM1619 STM1619 STM1620 STM1620 STM1621 STM1621 STM1622 STM1622 STM1623 STM1623 STM1624 STM1624 STM1625 STM1625

252

ydcX ydcW ydcW ydcR ydcR pdgL pdgL ugtL ugtL yncJ yncJ ydcP ydcP ydcN ydcN STM1606 STM1606 STM1607 STM1607 tehB tehB tehA tehA ydcK ydcK rimL rimL STM1612 STM1612 STM1613 STM1613 STM1614 STM1614 STM1615 STM1615 STM1616 STM1616 STM1617 STM1617 STM1618 STM1618 STM1619 STM1619 STM1620 STM1620 STM1621 STM1621 ydcG ydcG STM1623 STM1623 STM1624 STM1624 ydcI ydcI

-0,90 0,03 1,42 -0,62 0,58 -0,12 0,98 0,16 1,79 0,99 1,16 0,05 -0,50 -0,17 0,80 -0,32 0,89 -0,67 0,33 -0,52 0,10 -0,39 -1,28 -0,38 1,55 0,33 0,73 0,20 2,04 -0,10 0,43 0,33 -0,73 -0,22 -0,66 -0,10 0,17 -0,36 0,28 1,45 1,50 0,55 2,19 0,96 2,15 1,08 0,21 -0,73 0,32 -1,59 -0,74 -0,41 0,37 -1,30 1,78

-1,16 1,26 0,70 0,22 0,35 0,20 -0,49 0,94 1,32 3,37 3,75 -0,23 0,32 0,11 0,03 0,15 0,85 1,51 1,24 1,10 1,09 1,16 1,33 1,00 0,63 1,33 1,50 2,10 3,05 2,09 2,64 1,33 0,42 0,27 -0,89 0,68 0,42 -1,71 -1,54 1,06 1,60 0,13 0,14 0,82 0,19 0,96 -0,44 -0,12 -0,92 -1,22 -0,98 -0,26 0,49 0,36 0,38

-0,86 1,95 2,99 -0,10 1,29 -0,89 0,55 -0,23 1,37 0,64 1,50 -1,25 -1,17 -0,43 0,18 -0,95 0,32 -0,07 0,38 -1,04 -0,89 -1,88 -0,62 -0,51 0,83 0,60 1,33 1,93 3,08 0,59 1,16 -0,08 -0,08 0,14 -0,70 0,64 1,30 -0,05 -0,11 0,04 1,52 0,51 0,77 0,91 2,13 1,78 1,14 -1,34 -1,03 -0,78 -1,58 1,87 2,50 -1,68 0,59

Anexo IV

STM1626 STM1626 STM1627 STM1627 STM1628 STM1628 STM1630 STM1630 STM1632 STM1632 STM1633 STM1633 STM1634 STM1634 STM1635 STM1635 STM1636 STM1636 STM1637 STM1637 STM1638 STM1638 STM1639 STM1639 STM1640 STM1640 STM1641 STM1641 STM1642 STM1642 STM1643 STM1643 STM1644 STM1644 STM1645 STM1645 STM1646 STM1646 STM1647 STM1647 STM1648 STM1648 STM1649 STM1649 STM1651 STM1651 STM1652 STM1652 STM1654 STM1654 STM1655 STM1655 STM1656 STM1656 STM1657

trg trg STM1627 STM1627 STM1628 STM1628 STM1630 STM1630 STM1632 STM1632 STM1633 STM1633 STM1634 STM1634 STM1635 STM1635 STM1636 STM1636 STM1637 STM1637 STM1638 STM1638 cybB cybB ydcF ydcF hrpA hrpA acpD acpD STM1643 STM1643 ydbL ydbL ynbE ynbE ydbH ydbH ldhA ldhA hslJ hslJ STM1649 STM1649 nifJ nifJ ynaF ynaF ydaO ydaO dbpA dbpA STM1656 STM1656 STM1657

-1,02 -0,85 -1,08 0,04 -1,85 -0,68 -0,92 -1,52 -0,16 1,41 -0,30 1,97 -0,30 -0,40 -1,16 0,06 -0,14 0,62 0,06 1,13 0,38 -0,81 -1,25 -1,33 -0,93 -0,48 -1,35 -0,09 -1,22 0,20 -0,70 0,48 -0,06 0,94 0,72 0,52 -0,91 -0,72 -0,18 0,14 -0,87 0,68 -0,40 -1,62 -1,11 1,06 -0,75 -0,34 -2,17 -0,49 1,41 2,19 -0,36 -0,24 0,07

-0,18 -0,59 -0,69 -0,04 -0,18 0,09 -0,07 -0,42 4,05 4,27 1,08 1,97 0,23 0,80 -0,98 0,08 -0,68 -0,99 1,50 1,27 0,44 1,19 0,21 0,10 -0,30 -0,34 -0,28 -0,15 0,29 0,70 0,92 0,83 -0,10 -0,53 0,42 -0,08 -0,98 -0,35 -0,34 -0,18 0,01 0,13 0,10 0,10 -0,31 -0,86 0,43 0,73 -1,19 -0,84 0,83 0,03 -0,52 -1,10 -0,45

0,12 -0,58 -1,27 -0,39 -1,74 -2,70 0,11 0,39 0,22 0,99 0,29 1,12 -0,64 1,30 -0,65 0,48 -1,07 0,01 0,08 0,76 -1,44 0,09 -0,76 -0,58 -1,14 -0,81 -0,68 0,28 -0,26 -0,21 -0,03 1,24 -0,21 1,27 0,83 1,25 -0,30 -0,67 0,14 1,13 -0,34 0,39 -1,75 -1,73 -0,74 0,24 -0,26 -1,62 -1,78 -2,04 3,02 2,97 0,24 0,98 -0,69

STM1657 STM1658 STM1658 STM1659 STM1659 STM1660,S STM1660,S STM1661 STM1661 STM1662 STM1662 STM1663 STM1663 STM1664 STM1664 STM1665 STM1665 STM1667 STM1667 STM1668 STM1668 STM1669 STM1669 STM1670 STM1670 STM1671 STM1671 STM1673 STM1673 STM1674 STM1674 STM1675 STM1675 STM1676 STM1676 STM1677 STM1677 STM1678 STM1678 STM1679 STM1679 STM1680 STM1680 STM1681 STM1681 STM1682 STM1682 STM1683 STM1683 STM1684 STM1684 STM1685 STM1685 STM1686 STM1686

253

STM1657 ydaL ydaL ogt ogt fnr fnr ydaA ydaA ynaJ ynaJ ynaI ynaI STM1664 STM1664 STM1665 STM1665 STM1667 STM1667 STM1668 STM1668 STM1669 STM1669 STM1670 STM1670 STM1671 STM1671 STM1673 STM1673 STM1674 STM1674 STM1675 STM1675 STM1676 STM1676 STM1677 STM1677 STM1678 STM1678 mppA mppA ycjI ycjI ycjG ycjG tpx tpx tyrR tyrR ycjF ycjF ycjX ycjX pspE pspE

-0,65 0,22 1,01 -0,36 0,32 -0,41 -0,40 -0,04 -1,95 -0,73 -0,59 -1,47 0,15 -0,96 0,01 2,07 -0,19 -0,51 -0,18 0,37 1,62 1,09 2,30 0,10 0,99 -0,18 -1,14 -0,20 0,60 0,52 1,52 -0,42 0,35 -0,36 0,27 0,37 0,93 0,15 0,37 -1,04 -0,12 -0,55 0,68 -0,33 1,63 -1,88 -1,31 -1,41 -1,46 -0,09 -0,45 -0,67 0,35 2,04 3,12

-0,65 1,77 1,52 0,40 0,83 0,14 0,25 0,68 1,13 1,07 1,02 0,40 -0,33 0,40 -0,16 0,68 0,36 -0,18 0,44 0,69 0,02 0,44 0,14 -0,09 -0,79 -1,29 0,91 0,06 0,82 -0,11 0,00 -0,71 -0,99 -0,52 -0,50 -0,18 -0,08 1,26 1,15 0,58 0,97 1,09 0,55 0,59 0,51 0,53 0,88 0,40 0,62 1,10 0,66 2,13 2,20 3,99 4,10

-0,80 0,45 1,50 -0,46 0,64 -0,29 0,30 1,05 1,16 1,15 0,76 -0,83 0,05 -1,48 -0,62 0,96 0,79 -0,41 0,52 0,95 1,64 1,11 2,18 -0,72 0,50 0,00 -0,12 -0,55 0,96 0,08 1,93 -1,07 -0,79 -0,86 0,26 0,44 1,35 -0,35 0,02 -0,73 -0,18 0,37 -0,42 -0,21 -0,71 -2,49 -2,75 -1,42 -1,81 0,85 1,47 -0,56 -1,21 0,17 0,31

Anexo IV

STM1687 STM1687 STM1688 STM1688 STM1689 STM1689 STM1690 STM1690 STM1691 STM1691 STM1692 STM1692 STM1693 STM1693 STM1694 STM1694 STM1695 STM1695 STM1696 STM1696 STM1697 STM1697 STM1700 STM1700 STM1701 STM1701 STM1702 STM1702 STM1703 STM1703 STM1704 STM1704 STM1705 STM1705 STM1706 STM1706 STM1707 STM1707 STM1708 STM1708 STM1709 STM1709 STM1710 STM1710 STM1711 STM1711 STM1713 STM1713 STM1714 STM1714 STM1715 STM1715 STM1716 STM1716 STM1717

pspD pspD pspC pspC pspB pspB pspA pspA pspF pspF sapA sapA sapB sapB sapC sapC sapD sapD sapF sapF STM1697 STM1697 fabI fabI yciW yciW rnb rnb yciR yciR yciT yciT osmB osmB yciH yciH pyrF pyrF yciM yciM yciS yciS pgpB pgpB ribA ribA cysB cysB topA topA yciN yciN sohB sohB yciK

1,85 3,12 3,22 3,83 4,46 5,81 4,41 5,27 1,69 1,26 -1,55 0,07 -2,15 -0,82 -1,77 -1,25 -0,99 -0,87 -0,33 0,33 0,44 0,75 -2,06 -0,99 -1,34 -0,93 -1,27 -0,80 -0,12 1,70 -1,33 0,16 1,93 1,18 1,17 1,44 -2,35 -0,43 -0,73 -1,34 -1,94 -1,03 -0,74 -0,40 0,06 0,25 1,93 1,03 0,52 2,15 -0,85 -0,03 0,50 0,84 -1,81

4,22 4,59 4,65 4,84 5,84 5,39 5,70 5,54 0,35 0,29 -0,30 -1,49 -1,42 -1,16 -1,31 -2,04 -0,70 -0,54 0,97 1,43 1,53 2,07 -0,02 0,57 -0,79 -0,24 -0,70 -1,11 0,80 0,79 -0,08 -0,86 2,20 1,90 0,24 -0,15 -1,17 -1,14 0,08 0,05 -0,29 0,32 1,20 0,99 -0,39 0,26 -0,11 0,43 0,08 0,12 -1,31 -1,22 -0,24 0,01 0,55

-0,44 -0,21 0,60 0,26 0,71 1,66 2,30 2,85 0,54 0,20 -0,69 -0,84 -1,55 -0,75 -1,44 -1,91 -1,56 -1,45 -1,16 0,10 -0,36 -0,09 -1,66 -1,58 -1,53 -1,24 -1,55 -0,60 0,96 0,32 -0,37 0,00 4,40 4,74 0,33 1,48 -0,60 -0,52 -0,12 -1,21 -1,88 -2,06 0,04 1,11 0,49 0,95 -0,76 0,54 0,13 0,87 -0,46 -0,84 -1,52 -1,31 -1,16

STM1717 STM1718 STM1718 STM1719 STM1719 STM1720 STM1720 STM1721 STM1721 STM1723 STM1723 STM1724 STM1724 STM1725 STM1725 STM1726 STM1726 STM1727 STM1727 STM1728 STM1728 STM1729 STM1729 STM1730 STM1730 STM1731 STM1731 STM1732 STM1732 STM1733 STM1733 STM1734 STM1734 STM1735 STM1735 STM1736 STM1736 STM1737 STM1737 STM1738 STM1738 STM1739 STM1739 STM1741 STM1741 STM1742 STM1742 STM1743 STM1743 STM1744 STM1744 STM1745 STM1745 STM1746,S STM1746,S

254

yciK btuR btuR yciL yciL yciO yciO trpH trpH trpE trpE trpD trpD trpC trpC trpB trpB trpA trpA yciG yciG yciF yciF yciE yciE STM1731 STM1731 ompW ompW STM1733 STM1733 yciC yciC yciB yciB yciA yciA tonB tonB yciI yciI cls cls STM1741 STM1741 oppF oppF oppD oppD oppC oppC oppB oppB oppA oppA

-0,42 -1,88 -1,64 -1,66 -1,52 -0,13 0,75 -1,68 -1,07 -0,50 -0,50 -1,03 0,24 -0,86 -0,22 0,49 -1,83 -0,33 0,35 0,57 1,22 1,98 2,54 0,09 1,21 2,73 3,07 1,12 2,84 -0,48 0,38 -1,16 -0,44 -0,05 -0,13 -0,27 -0,49 0,16 0,11 -0,44 -0,47 -0,68 0,66 -0,20 0,85 -1,17 -0,16 0,23 2,51 -0,78 0,28 -1,54 -0,30 -0,09 0,22

0,83 -0,44 -0,48 -0,79 -0,90 -0,13 0,32 0,51 0,79 1,27 1,28 1,25 1,59 1,61 1,57 2,12 2,26 0,39 -0,14 2,73 2,92 -0,58 -0,79 1,05 0,76 1,09 -0,08 0,37 0,15 0,92 1,44 -0,19 -0,19 -0,29 0,09 -0,02 0,48 0,77 0,76 0,46 0,61 -0,11 0,24 0,10 -0,80 0,62 0,32 0,50 0,69 0,39 0,61 0,43 -0,31 2,34 2,82

0,45 -1,70 -2,10 -2,51 -1,80 -1,41 -1,08 -1,09 -0,36 0,24 0,40 -1,08 0,30 0,15 -0,76 0,77 0,19 0,49 1,37 9,56 9,94 4,65 5,82 4,92 5,32 3,42 3,70 0,88 1,86 -0,52 0,54 -1,17 -0,95 -0,45 -1,49 -1,24 -1,12 -0,88 -0,41 -1,05 -0,54 -0,55 0,04 -0,08 0,27 0,69 -0,15 -0,29 -0,18 0,03 -0,17 -1,47 -0,17 -0,15 -0,53

Anexo IV

STM1748 STM1748 STM1749 STM1749 STM1750 STM1750 STM1751 STM1751 STM1752 STM1752 STM1753 STM1753 STM1754 STM1754 STM1755 STM1755 STM1756 STM1756 STM1758 STM1758 STM1757 STM1759 STM1757 STM1759 STM1760 STM1760 STM1761 STM1761 STM1762 STM1762 STM1763 STM1763 STM1764 STM1764 STM1765 STM1765 STM1766 STM1766 STM1767 STM1767 STM1768 STM1768 STM1769 STM1769 STM1770 STM1770 STM1771 STM1771 STM1772 STM1772 STM1773 STM1773 STM1774 STM1774 STM1775

ychE ychE adhE adhE tdk tdk hns hns galU galU hnr hnr ychK ychK ychJ ychJ purU purU rtT rtT tyrT tyrV tyrT tyrV STM1760 STM1760 narI narI narJ narJ narH narH narG narG narK narK narX narX narL narL ychP ychP ychN ychN chaB chaB chaA chaA kdsA kdsA ychA ychA sirC sirC hemK

1,41 1,37 0,78 1,28 0,07 1,58 -0,46 0,31 -1,19 -0,21 -0,12 -0,03 -1,24 -0,79 -1,84 -1,31 -3,20 -1,49 -0,73 -1,06 -0,50 -0,49 0,27 -0,21 0,20 1,63 -0,15 0,29 0,84 1,54 -0,60 0,96 0,32 1,16 -1,17 0,17 -0,67 0,23 1,13 2,53 -1,11 -0,10 -0,76 0,05 -0,19 1,05 -0,18 -0,09 -0,97 -0,11 -2,33 -1,35 -2,26 -2,16 -1,74

-0,24 -0,58 0,78 1,15 -0,51 0,05 0,70 0,77 1,05 0,71 -0,46 -0,89 -0,74 -0,68 -0,68 -0,73 -1,06 -1,21 -1,83 -1,17 -1,65 -1,88 -1,01 -1,62 -0,73 -0,22 -0,10 -0,42 -0,25 -0,75 0,22 -0,47 -0,30 0,03 -0,06 -0,33 1,22 1,02 1,53 3,16 -0,43 0,75 0,97 0,72 1,84 1,40 -0,10 0,08 0,02 0,15 -1,31 -1,00 -1,66 -0,93 -1,75

1,60 -0,61 1,77 2,33 -0,74 0,16 -0,02 -0,03 -0,79 -0,56 -0,41 1,13 -0,95 0,32 -1,26 -0,87 -1,54 -1,41 -2,44 -1,78 -0,69 -0,10 -0,70 -0,63 0,61 0,70 -0,65 -0,56 -0,75 -0,06 -1,19 0,56 0,56 1,49 -1,08 0,06 -0,71 -0,56 0,71 3,57 0,53 -0,20 -0,07 0,60 3,22 3,59 -1,62 -0,83 -2,30 -0,85 -2,23 -2,30 -2,78 -2,51 -1,77

STM1775 STM1776 STM1776 STM1777 STM1777 STM1778 STM1778 STM1779 STM1779 STM1780 STM1780 STM1781 STM1781 STM1782 STM1782 STM1783,S STM1783,S STM1784 STM1784 STM1785 STM1785 STM1786 STM1786 STM1787 STM1787 STM1788 STM1788 STM1789 STM1789 STM1790 STM1790 STM1791 STM1791 STM1792 STM1792 STM1793 STM1793 STM1795 STM1795 STM1796 STM1796 STM1797 STM1797 STM1798 STM1798 STM1799 STM1799 STM1800 STM1800 STM1801 STM1801 STM1802 STM1802 STM1803 STM1803

255

hemK prfA prfA hemA hemA lolB lolB ipk ipk prsA prsA ychM ychM ychH ychH pth pth ychF ychF STM1785 STM1785 STM1786 STM1786 STM1787 STM1787 STM1788 STM1788 STM1789 STM1789 STM1790 STM1790 STM1791 STM1791 STM1792 STM1792 STM1793 STM1793 STM1795 STM1795 treA treA ymgE ymgE ycgR ycgR emtA emtA ycgQ ycgQ ycgO ycgO alr alr dadA dadA

-0,69 -0,79 0,39 -2,97 -2,25 -2,46 -1,10 -3,30 -2,98 -1,14 -0,22 -0,52 0,25 -0,16 0,07 -1,68 -0,93 0,29 1,41 -0,73 -0,23 2,72 4,66 0,70 0,93 -0,18 0,78 1,56 1,72 -0,29 1,87 0,11 0,59 -0,49 0,54 0,55 5,37 -0,19 -0,29 -0,31 0,97 0,19 0,61 -0,90 -0,52 -0,94 -0,61 -0,86 -1,21 0,72 1,80 -1,31 0,83 -0,81 -0,62

-1,73 -1,97 -1,47 -2,22 -1,85 -0,40 -0,07 -0,80 -0,58 0,11 0,68 -0,24 -0,47 0,38 0,10 -0,47 -0,69 -0,36 -0,34 -0,44 -0,50 0,99 0,49 -2,83 -2,49 -0,93 -0,04 1,74 0,26 -1,65 -0,79 -1,00 -1,13 -2,56 -1,06 0,07 0,16 0,88 1,29 1,44 1,67 1,05 0,58 -0,62 -0,89 -1,17 -1,00 0,30 -0,31 -0,03 -0,07 0,04 -0,25 1,27 1,15

-0,59 -2,45 -2,11 -2,28 -2,30 -1,84 -0,97 -4,11 -3,43 -1,96 -1,12 -0,69 0,55 0,16 1,20 -1,90 -0,98 0,80 2,35 -0,66 -0,10 3,40 4,27 -0,43 1,14 -0,36 0,56 2,45 2,36 -0,65 -1,43 -1,40 0,09 -1,28 -0,22 0,10 2,62 0,39 1,40 1,77 2,95 2,27 2,11 -1,03 -0,74 -0,52 -1,18 -0,03 -0,77 0,65 2,23 -0,67 0,70 0,87 0,66

Anexo IV

STM1804,S STM1804,S STM1806 STM1806 STM1807 STM1807 STM1808 STM1808 STM1810 STM1810 STM1811 STM1811 STM1812 STM1812 STM1813 STM1813 STM1814 STM1814 STM1815 STM1815 STM1816 STM1816 STM1817 STM1817 STM1819 STM1819 STM1820 STM1820 STM1821 STM1821 STM1822 STM1822 STM1823 STM1823 STM1824 STM1824 STM1825 STM1825 STM1826 STM1826 STM1827,S STM1827,S STM1828 STM1828 STM1830 STM1830 STM1831 STM1831 STM1832 STM1832 STM1833 STM1833 STM1834 STM1834 STM1835

ycgB ycgB nhaB nhaB dsbB dsbB STM1808 STM1808 STM1810 STM1810 ycgN ycgN ycgM ycgM ycgL ycgL minC minC minD minD minE minE rnd rnd slp slp yeaZ yeaZ yoaA yoaA yoaB yoaB yoaH yoaH pabB pabB yeaB yeaB sdaA sdaA STM1827,S STM1827,S yoaE yoaE manX manX manY manY manZ manZ STM1833 STM1833 yebN yebN rrmA

1,31 1,73 -0,03 0,07 -1,23 0,32 1,69 1,27 0,29 0,63 -1,30 -0,63 -1,02 0,55 -1,90 -0,78 -1,87 -1,14 -2,06 -1,08 -2,18 -1,39 -1,47 -1,12 -1,78 -1,71 -1,68 -1,39 -1,78 -0,92 -0,87 -2,06 -1,20 0,32 -1,85 -0,45 -0,49 -1,35 1,55 1,89 0,10 0,55 -0,30 0,23 -1,72 -0,44 -1,60 -1,27 -0,99 -0,34 -1,34 0,65 -0,35 0,30 -1,06

2,10 2,29 -0,10 -0,15 1,08 0,89 3,62 3,82 1,51 1,36 0,26 0,08 0,69 0,75 0,00 -0,28 -0,33 -0,19 -0,03 -0,04 -0,45 -1,14 -0,49 -1,23 -0,31 -1,07 -0,23 -0,07 -0,44 -1,38 0,22 0,04 -0,23 0,09 -0,01 -0,26 -1,44 -1,30 -0,24 -0,16 -0,57 -0,77 -0,71 -0,31 0,38 0,53 -0,26 0,48 -0,52 -0,45 -0,35 -0,21 0,25 0,11 -0,13

1,95 2,73 -1,56 -0,33 -0,72 0,19 1,28 2,60 3,97 4,45 0,11 -0,08 -0,43 -0,01 -0,13 0,24 -1,24 -1,11 -1,32 -0,21 -0,82 -0,27 -0,77 -0,95 -0,46 -2,47 -1,87 -1,29 -0,70 -1,68 -0,11 -0,45 -1,69 -0,83 -0,52 -1,70 -0,81 -3,16 -0,29 0,34 0,06 0,83 -0,10 0,62 -1,29 -0,80 -1,07 -0,76 -0,33 -0,90 -1,10 1,54 -0,44 -0,94 0,09

STM1835 STM1836 STM1836 STM1837 STM1837 STM1839 STM1839 STM1840 STM1840 STM1841 STM1841 STM1842 STM1842 STM1843 STM1843 STM1844 STM1844 STM1845 STM1845 STM1846 STM1846 STM1847 STM1847 STM1848 STM1848 STM1849 STM1849 STM1850 STM1850 STM1851 STM1851 STM1852 STM1852 STM1853 STM1853 STM1854 STM1854 STM1855 STM1855 STM1856 STM1856 STM1856,1N STM1856,1N STM1857 STM1857 STM1862 STM1862 STM1863 STM1863 STM1864 STM1864 STM1868 STM1868 STM1868,1N STM1868,1N

256

rrmA STM1836 STM1836 cspC cspC STM1839 STM1839 yobG yobG STM1841 STM1841 kdgR kdgR STM1843 STM1843 htpX htpX prc prc proQ proQ yebR yebR yebS yebS STM1849 STM1849 yebU yebU STM1851 STM1851 yebW yebW prpA prpA STM1854 STM1854 sopE2 sopE2 STM1856 STM1856 STM1856,1N STM1856,1N STM1857 STM1857 pagO pagO STM1863 STM1863 STM1864 STM1864 mig-3 mig-3 STM1868,1N STM1868,1N

0,02 -0,14 0,35 -3,63 -2,05 -0,87 1,03 -0,72 -0,97 -1,11 0,22 -2,08 -1,24 -0,85 0,34 1,05 1,79 0,65 1,89 -3,60 -2,90 -3,12 -1,95 -1,28 1,23 -0,08 1,27 -1,13 -1,30 -0,84 -0,30 -0,09 -0,48 -0,62 0,66 0,76 1,82 -1,15 1,04 0,00 0,62 -0,14 1,51 -1,14 -0,15 0,84 3,44 2,17 1,95 0,32 -0,03 3,84 4,72 1,84 2,79

0,00 0,19 -0,98 -1,15 -0,74 -1,00 -1,29 -0,79 -0,93 -1,17 -0,26 -0,17 -0,53 -0,20 0,88 2,34 1,91 0,52 -0,16 -1,51 -1,37 -1,50 -1,48 -0,97 -0,43 -0,13 0,38 -0,49 -0,48 0,47 0,25 0,97 1,25 0,10 -0,10 -0,99 -0,21 -0,60 -0,66 -1,25 0,72 -0,21 -0,23 0,67 0,64 -0,10 0,76 0,99 0,07 1,11 -1,09 2,56 2,15 1,73 1,75

-1,35 -0,48 0,46 -0,74 -0,50 0,12 -0,60 -0,14 -0,97 -0,19 -0,02 -1,42 -1,55 -0,23 0,14 1,48 2,60 -0,24 0,71 -3,56 -4,51 -2,67 -3,08 -0,07 1,44 -0,16 1,04 0,03 0,23 1,76 1,87 2,42 2,27 0,57 1,79 0,19 0,35 0,06 0,98 -0,01 -0,65 -1,39 -0,07 -0,83 -0,80 -0,49 1,78 2,63 3,80 0,09 -1,51 2,42 3,31 1,44 2,06

Anexo IV

STM1868A STM1868A STM1869 STM1869 STM1870 STM1870 STM1873 STM1873 STM1874 STM1874 STM1875 STM1875 STM1876 STM1876 STM1877 STM1877 STM1878 STM1878 STM1879 STM1879 STM1880 STM1880 STM1881 STM1881 STM1882 STM1882 STM1883 STM1883 STM1887 STM1887 STM1889 STM1889 STM1890 STM1890 STM1891 STM1891 STM1892,S STM1892,S STM1893 STM1893 STM1894 STM1894 STM1895 STM1895 STM1896 STM1896 STM1897 STM1897 STM1898 STM1898 STM1899 STM1899 STM1900 STM1900 STM1901

STM1868A STM1868A STM1869 STM1869 STM1870 STM1870 STM1873 STM1873 STM1874 STM1874 yobA yobA holE holE STM1877 STM1877 exoX exoX ptrB ptrB yebE yebE yebF yebF yebG yebG purT purT yebK yebK msbB msbB yebA yebA znuA znuA znuC znuC znuB znuB ruvB ruvB ruvA ruvA STM1896 STM1896 yebB yebB ruvC ruvC yebC yebC ntpA ntpA aspS

0,34 1,39 5,63 2,63 0,45 2,58 -0,95 -0,70 -1,12 -0,19 -0,14 1,02 -1,39 0,04 -0,13 0,06 0,53 0,23 -1,13 1,02 1,38 2,25 0,58 0,69 2,11 2,87 3,02 3,25 -0,95 0,33 -1,29 -0,13 -1,04 -0,74 -1,16 0,11 -0,80 -0,18 0,21 2,35 -0,66 0,66 -0,46 0,50 0,45 1,39 -1,08 -0,61 -1,31 -1,55 -1,97 -0,26 -2,75 -1,78 -2,35

4,42 3,97 2,60 2,26 -0,26 -0,11 0,16 -0,33 0,64 0,73 0,31 0,58 -0,39 1,30 -0,68 -0,64 1,68 1,24 1,03 0,99 3,49 3,44 2,43 2,28 2,46 2,70 1,13 0,43 0,40 0,04 -0,93 -0,30 -0,02 -0,47 0,77 0,96 0,12 -0,62 -0,40 0,19 -0,54 -0,09 0,36 0,40 -2,60 -2,49 -0,64 -0,61 -0,57 -0,26 -1,00 -0,79 -0,83 -0,76 -0,31

2,61 -0,10 2,47 2,91 0,63 3,19 -0,59 0,54 -1,04 -0,65 1,82 0,83 -0,08 0,64 -0,98 0,28 0,58 0,43 -0,69 0,55 2,72 3,37 1,09 1,59 1,09 1,97 4,00 4,70 0,08 0,86 -0,72 -0,09 -0,59 -1,28 -0,58 -0,06 -2,02 -0,78 -0,87 -1,00 -1,45 -0,81 -1,69 -1,32 -0,64 0,77 -2,09 -1,81 -1,46 -1,90 -2,69 -2,05 -2,80 -3,52 -3,70

STM1901 STM1902 STM1902 STM1903 STM1903 STM1904 STM1904 STM1905 STM1905 STM1906 STM1906 STM1907 STM1907 STM1908 STM1908 STM1909 STM1909 STM1910 STM1910 STM1911 STM1911 STM1912 STM1912 STM1924,S STM1924,S STM1925 STM1925 STM1927 STM1927 STM1928 STM1928 STM1929 STM1929 STM1931 STM1931 STM1932 STM1932 STM1933 STM1933 STM1934 STM1934 STM1935 STM1935 STM1936 STM1936 STM1937 STM1937 STM1938 STM1938 STM1939 STM1939 STM1940 STM1940 STM1941 STM1941

257

aspS yecD yecD yecE yecE yecN yecN yecO yecO yecP yecP cutC cutC yecM yecM argS argS STM1910 STM1910 STM1911 STM1911 flhE flhE flhC flhC flhD flhD yecG yecG otsA otsA otsB otsB araH araH ftnB ftnB STM1933 STM1933 STM1934 STM1934 ftn ftn yecH yecH tyrP tyrP yecA yecA STM1939 STM1939 STM1940 STM1940 STM1941 STM1941

-1,04 -1,10 0,28 -0,98 -0,10 -1,67 -1,01 -2,30 -2,20 -0,10 -0,12 0,16 0,93 -1,40 -1,25 -1,17 -0,74 0,11 1,34 -0,67 0,41 -1,39 -1,23 -2,57 -1,39 -1,46 -0,50 -0,25 0,06 2,06 1,50 0,90 1,83 -0,84 0,75 -0,04 1,83 0,82 1,45 -1,16 -0,75 -1,86 -1,04 -1,41 -1,30 -0,93 -0,35 0,34 1,37 0,28 0,87 0,00 1,06 -0,44 -1,34

-0,12 -0,40 -0,04 -1,03 -1,39 -0,97 -0,73 -0,97 -1,17 -0,13 -0,85 0,55 0,08 -0,31 -1,06 0,08 -0,56 -0,24 -0,21 0,31 0,20 -2,09 -1,98 -1,22 -1,64 0,39 0,55 0,06 0,05 -1,43 -1,54 2,95 2,74 -0,08 -1,00 0,80 0,91 0,46 0,56 -1,16 -1,55 -1,57 -1,32 -0,54 -1,97 0,25 -0,25 0,62 0,77 -0,96 -0,01 3,43 0,09 -0,93 -1,59

-3,29 -1,26 -0,40 -0,75 -0,12 -1,75 -1,90 -2,22 -2,13 0,18 -0,04 1,24 1,85 -1,41 -0,95 -0,88 -1,57 -0,18 2,03 1,26 0,72 -1,62 -1,82 -0,91 -0,77 -0,97 -1,18 0,66 1,19 1,63 1,89 3,51 5,27 2,36 3,04 0,06 1,24 0,76 1,28 -0,87 -1,31 -2,68 -2,24 -0,96 -2,75 -0,01 -1,33 -0,56 0,78 -1,94 -0,74 1,06 1,64 -1,47 -1,30

Anexo IV

STM1942 STM1942 STM1943 STM1943 STM4352 STM1944 STM4353 STM4354 STM4352 STM1944 STM4353 STM4354 STM1945 STM1945 STM1946 STM1946 STM1947 STM1947 STM1949 STM1949 STM1950 STM1950 STM1951 STM1951 STM1952 STM1952 STM1953 STM1953 STM1954 STM1954 STM1955 STM1955 STM1956 STM1956 STM1958 STM1958 STM1963 STM1963 STM1964 STM1964 STM1965 STM1965 STM1966 STM1966 STM1982 STM1982 STM1983 STM1983 STM1984 STM1984 STM1986 STM1986 STM1987 STM1987 STM1988,S

leuZ leuZ cysT cysT glyV glyW glyX glyY glyV glyW glyX glyY pgsA pgsA uvrC uvrC uvrY uvrY yecF yecF sdiA sdiA yecC yecC yecS yecS yedO yedO fliY fliY fliZ fliZ fliA fliA fliB fliB amyA amyA yedD yedD yedE yedE yedF yedF rcsA rcsA dsrB dsrB yodD yodD yedP yedP STM1987 STM1987 STM1988,S

-1,70 0,53 -2,80 -2,90 -1,85 -1,12 -0,65 -0,60 -0,24 -1,15 -0,26 0,10 -1,80 -1,86 1,75 -0,18 -1,84 -0,83 -0,22 1,36 -0,91 -0,15 -1,56 1,17 -1,15 0,46 0,33 1,57 -0,94 -0,46 -1,23 0,44 -2,64 -1,83 -2,57 -2,52 -0,95 0,67 -0,35 1,04 -2,05 -1,35 -0,89 0,53 0,27 0,53 -0,52 -0,08 -0,96 -0,33 -0,12 1,57 0,33 -0,06 0,99

-0,95 -1,15 -0,72 -0,99 -0,70 -0,34 -0,40 -0,12 0,12 -0,64 -0,03 -0,01 -0,70 -0,70 0,08 0,05 0,31 0,09 -1,17 -0,91 -0,79 -0,47 0,90 -0,91 0,50 0,92 0,56 -0,02 1,52 0,00 -1,22 -2,39 -2,82 -3,21 -2,53 -2,68 -0,62 -0,48 0,06 -0,64 -1,17 -1,80 -1,19 -0,94 -0,68 0,04 0,19 -0,22 -0,24 0,43 0,29 0,72 0,25 0,49 0,08

-0,07 0,41 2,92 3,12 0,49 0,23 0,59 0,88 0,85 0,32 0,59 1,06 -1,48 -1,00 0,62 1,71 -0,60 0,02 -1,07 -0,54 0,24 -0,62 0,11 -1,67 -0,29 0,81 -0,03 1,31 -0,05 0,74 -0,76 -1,34 -4,22 -3,91 -2,59 -2,65 -1,50 -0,31 -1,55 -0,18 -1,43 -1,01 -1,85 -1,31 0,77 0,80 1,33 1,41 3,72 3,96 0,28 2,38 1,18 1,39 2,85

STM1988,S STM1989 STM1989 STM1990 STM1990 STM1991 STM1991 STM1992 STM1992 STM1993 STM1993 STM1994 STM1994 STM1995 STM1995 STM1996 STM1996 STM1997 STM1997 STM1997 STM1997 STM1998 STM1998 STM1999 STM1999 STM2000 STM2000 STM2001 STM2001 STM2005 STM2005 STM2007 STM2007 STM2008 STM2008 STM2009 STM2009 STM2011 STM2011 STM2013 STM2013 STM2014 STM2002 STM2004 STM2012 STM2014 STM2002 STM2004 STM2012 STM2015 STM2015 STM2016 STM2016 STM2017 STM2017

258

STM1988,S yedI yedI yedA yedA vsr vsr dcm dcm yedJ yedJ STM1994 STM1994 ompS ompS cspB cspB umuC umuC umuC umuC umuD umuD STM1999 STM1999 serU serU yeeI yeeI STM2005 STM2005 STM2007 STM2007 STM2008 STM2008 amn amn STM2011 STM2011 yeeO yeeO asnU asnT asnT asnW asnU asnT asnT asnW erfK erfK cobT cobT cobS cobS

1,53 -0,36 -1,47 -1,21 -0,21 -0,03 1,26 0,07 0,77 0,12 0,03 -0,48 1,65 -1,04 -0,36 -0,41 -0,48 -0,54 0,69 0,38 1,33 -0,32 1,54 0,47 2,70 -1,84 -0,49 0,11 0,93 -1,23 -0,29 0,94 3,50 -0,34 -0,14 -0,70 -0,33 -0,46 0,20 0,67 -0,54 -1,06 0,77 -0,07 -0,43 0,49 1,37 0,30 0,49 -0,53 0,46 0,89 1,82 0,21 0,15

-0,48 0,42 -0,61 -0,02 -0,71 -0,21 -0,34 0,64 -0,60 -0,54 0,01 0,18 0,59 -1,70 -0,79 -0,70 -1,51 1,98 0,95 1,58 0,87 0,18 0,53 1,69 1,81 -0,17 0,12 -0,30 0,15 -0,23 -0,70 -0,55 -0,67 0,65 -0,20 0,19 1,29 0,67 0,13 -0,67 -0,60 -0,39 1,22 -0,12 0,06 -0,44 0,84 -0,18 -0,16 1,12 1,29 0,33 0,01 -1,30 -1,13

3,47 0,32 -0,02 -0,93 0,01 -0,97 0,12 -0,13 0,98 -1,62 -0,04 -1,05 0,83 -0,86 -0,73 -0,35 -0,33 0,53 -0,17 -0,20 0,19 0,06 0,36 0,30 1,35 0,49 1,17 0,14 -0,04 -1,48 0,01 0,80 2,06 0,36 0,47 -0,37 0,77 -0,34 0,19 0,66 0,50 0,39 3,67 0,75 0,69 1,21 4,48 1,02 1,24 0,40 1,07 0,21 0,77 0,33 -0,29

Anexo IV

STM2018 STM2018 STM2019 STM2019 STM2020 STM2020 STM2021 STM2021 STM2022 STM2022 STM2023 STM2023 STM2024 STM2024 STM2025 STM2025 STM2026 STM2026 STM2027 STM2027 STM2028 STM2028 STM2029 STM2029 STM2030 STM2030 STM2031 STM2031 STM2032 STM2032 STM2033 STM2033 STM2034 STM2034 STM2035 STM2035 STM2036 STM2036 STM2037 STM2037 STM2038 STM2038 STM2039 STM2039 STM2040 STM2040 STM2041 STM2041 STM2042 STM2042 STM2043 STM2043 STM2044 STM2044 STM2045

cobU cobU cbiP cbiP cbiO cbiO cbiQ cbiQ cbiN cbiN cbiM cbiM cbiL cbiL cbiK cbiK cbiJ cbiJ cbiH cbiH cbiG cbiG cbiF cbiF cbiT cbiT cbiE cbiE cbiD cbiD cbiC cbiC cobD cobD cbiA cbiA pocR pocR pduF pduF pduA pduA pudB pudB pduC pduC pduD pduD pduE pduE pduG pduG pduH pduH pduJ

1,86 1,94 -0,19 0,31 0,51 1,84 -0,31 1,35 0,05 0,50 0,25 0,38 -0,36 -0,32 -0,48 -0,06 -0,04 0,86 -0,02 1,31 -0,27 1,13 -0,39 1,91 0,47 0,89 0,67 -0,35 -1,22 0,67 -1,34 -1,15 0,45 1,65 -0,52 0,52 0,02 1,05 0,83 0,40 2,00 1,31 0,34 -0,02 0,82 3,56 0,85 1,62 -0,56 0,27 -0,15 1,04 -0,28 1,13 0,05

-1,22 -1,47 0,38 -0,10 0,88 0,92 0,27 0,47 -0,15 -0,61 -0,11 -0,01 0,01 -0,30 -0,84 -0,36 -0,92 -1,30 1,07 0,61 1,05 0,63 -1,15 -2,56 -0,08 -0,01 0,23 0,24 0,11 -0,36 0,05 -0,33 0,22 0,13 0,02 -0,14 1,51 -0,43 0,04 0,46 1,11 -0,86 -1,04 -1,81 -0,71 -0,36 -0,87 -2,33 -1,43 -1,58 -0,79 -0,80 -0,16 -0,44 -0,07

-1,51 -1,11 -0,78 0,04 0,83 0,73 -0,75 -0,16 -0,57 -0,19 0,23 -0,16 -0,96 0,24 -1,28 -0,52 -2,03 -0,52 0,59 0,21 0,13 0,08 -0,85 -0,43 -0,61 0,50 -0,96 -0,74 -1,08 -0,07 0,11 -0,28 0,51 2,01 -0,85 -0,61 0,15 0,13 -0,28 0,15 3,04 1,90 1,46 0,77 -0,35 0,69 0,76 -0,80 0,00 -0,07 0,05 1,73 0,12 0,98 -0,79

STM2045 STM2046 STM2046 STM2047 STM2047 STM2048 STM2048 STM2049 STM2049 STM2050 STM2050 STM2051 STM2051 STM2052 STM2052 STM2053 STM2053 STM2054 STM2054 STM2055 STM2055 STM2056 STM2056 STM2057 STM2057 STM2058 STM2058 STM2059 STM2059 STM2060 STM2060 STM2061 STM2061 STM2062 STM2062 STM2063 STM2063 STM2064 STM2064 STM2065 STM2065 STM2066 STM2066 STM2067 STM2067 STM2068 STM2068 STM2069 STM2069 STM2070 STM2070 STM2071 STM2071 STM2072 STM2072

259

pduJ pduK pduK pduL pduL pduM pduM pduN pduN pduO pduO pduP pduP pduQ pduQ pduS pduS pduT pduT pduU pduU pduV pduV pduW pduW pduX pduX yeeX yeeX yeeA yeeA sbmC sbmC dacD dacD phsC phsC phsB phsB phsA phsA sopA sopA sbcB sbcB yeeF yeeF yeeY yeeY yeeZ yeeZ hisG hisG hisD hisD

2,36 -0,45 0,66 0,37 0,85 -0,61 -0,29 0,50 -0,57 -0,22 1,54 -0,71 1,97 1,07 0,93 -0,46 -0,77 2,14 2,58 0,82 0,95 -0,79 -0,09 -0,43 -0,02 -1,67 0,76 -1,66 -1,76 -0,41 0,08 0,49 1,10 -1,14 0,06 0,15 0,42 -0,08 -0,18 0,26 1,63 -0,84 2,15 0,00 0,22 -2,76 -1,36 -1,00 -0,99 -1,38 -0,37 -1,23 -0,31 -0,84 0,22

-0,08 -0,43 -0,91 -0,54 -1,04 0,63 -1,11 -0,70 -0,72 0,42 -1,33 -0,59 -1,10 -1,42 -1,16 -0,69 -1,10 -1,10 -1,26 -1,95 -2,35 -0,61 -1,46 -0,67 0,46 0,11 -0,23 -0,33 0,12 0,97 0,60 1,76 1,47 0,02 -0,64 -0,45 -0,69 0,30 -0,43 0,52 -0,77 -0,76 -0,49 -1,01 -0,91 -1,56 -2,09 -0,54 -1,94 1,24 1,39 1,57 1,54 1,77 1,67

0,49 -0,81 0,29 -0,19 1,22 -0,61 -0,61 -0,25 -0,82 0,13 0,41 -1,24 -0,68 0,02 0,87 -0,69 -1,37 0,38 1,72 -0,11 0,89 0,20 0,47 -0,95 -0,03 -1,89 -0,91 -1,23 -1,25 0,03 0,13 2,91 3,67 -0,17 -0,04 -0,61 0,48 0,20 0,27 -0,79 0,67 -1,13 -0,08 0,26 0,85 -2,93 -2,10 1,35 0,64 2,26 2,72 -1,68 -1,59 -2,70 -1,04

Anexo IV

STM2073 STM2073 STM2074 STM2074 STM2075 STM2075 STM2076 STM2076 STM2077 STM2077 STM2078 STM2078 STM2079 STM2079 STM2080 STM2080 STM2082 STM2082 STM2083 STM2083 STM2084 STM2084 STM2085 STM2085 STM2086 STM2086 STM2087 STM2087 STM2088 STM2088 STM2089 STM2089 STM2090 STM2090 STM2091 STM2091 STM2092 STM2092 STM2093 STM2093 STM2094 STM2094 STM2095 STM2095 STM2096 STM2096 STM2097 STM2097 STM2098 STM2098 STM2099 STM2099 STM2100 STM2100 STM2101

hisC hisC hisB hisB hisH hisH hisA hisA hisF hisF hisI hisI wzzB wzzB udg udg rfbP rfbP rfbK rfbK rfbM rfbM rfbN rfbN rfbU rfbU rfbV rfbV rfbX rfbX rfbJ rfbJ rfbH rfbH rfbG rfbG rfbF rfbF rfbI rfbI rfbC rfbC rfbA rfbA rfbD rfbD rfbB rfbB galF galF wcaM wcaM wcaL wcaL wcaK

-1,36 -0,55 -1,62 -1,25 0,80 0,90 -2,18 -1,93 -1,99 -1,15 -0,11 0,26 -0,82 -0,24 -0,17 -0,18 -2,95 -3,06 -1,61 -1,06 0,40 1,25 -2,53 -3,93 -1,82 -2,60 -4,02 -2,75 -0,72 -0,89 -1,63 -2,89 -3,00 -2,89 -2,13 -1,48 -2,83 -1,30 -2,55 -1,49 -2,83 -3,04 -1,91 -1,50 -2,59 -1,35 0,38 0,84 -1,77 -0,32 -0,92 0,12 0,60 0,63 1,16

0,37 0,70 0,68 0,74 1,26 1,15 0,31 0,39 0,08 1,15 0,00 -0,07 0,59 0,41 1,11 0,06 -1,42 -1,21 -1,49 -1,32 -0,92 -0,80 -2,33 -2,26 -1,37 -1,85 -2,05 -2,14 -1,87 -2,23 -0,54 -0,42 -1,15 -1,35 -1,09 -0,79 -0,78 -0,58 -2,06 -1,93 -1,94 -1,43 -0,77 -1,02 -0,76 -0,83 -0,01 -0,16 -0,54 -0,55 -1,30 -1,67 0,49 -0,28 -0,98

-1,01 -1,24 -1,61 -2,72 -2,17 -0,88 -1,72 -2,73 -1,03 -1,07 -1,00 -0,70 0,47 0,93 -0,47 -3,03 -3,10 -2,29 -1,82 -1,68 -1,67 -0,75 -1,67 -2,87 -1,76 -2,03 -3,09 -5,12 -1,69 -0,84 -3,96 -3,99 -2,30 -3,75 -3,53 -3,15 -3,02 -2,29 -2,41 -2,33 -3,47 -3,75 -1,75 -2,22 -3,48 -2,80 1,51 2,02 -0,43 0,46 0,34 0,39 1,89 1,75 -0,23

STM2101 STM2102 STM2102 STM2103 STM2103 STM2104 STM2104 STM2105,S STM2105,S STM2106 STM2106 STM2107 STM2107 STM2108 STM2108 STM2109 STM2109 STM2110 STM2110 STM2111 STM2111 STM2112 STM2112 STM2113 STM2113 STM2114 STM2114 STM2115 STM2115 STM2116 STM2116 STM2117 STM2117 STM2118 STM2118 STM2119 STM2119 STM2120 STM2120 STM2121 STM2121 STM2122 STM2122 STM2123 STM2123 STM2124 STM2124 STM2125 STM2125 STM2126 STM2126 STM2127 STM2127 STM2128 STM2128

260

wcaK wzxC wzxC wcaJ wcaJ cpsG cpsG manC manC wcaI wcaI wcaH wcaH wcaG wcaG gmd gmd wcaF wcaF wcaE wcaE wcaD wcaD wcaC wcaC wcaB wcaB wcaA wcaA wzc wzc wzb wzb wza wza yegH yegH asmA asmA dcd dcd udk udk yegE yegE alkA alkA yegD yegD STM2126 STM2126 yegN yegN yegO yegO

1,76 0,05 0,58 0,13 1,14 2,17 1,87 1,07 1,46 -0,10 0,50 -0,37 0,70 -0,33 0,43 0,78 1,69 -0,32 -0,54 0,97 0,89 0,05 0,78 -0,50 -0,06 1,69 0,83 1,28 0,82 0,94 4,41 -0,27 0,59 0,02 0,19 -0,33 0,70 -0,43 0,46 -1,35 -0,50 -1,59 -2,68 -0,68 0,83 -0,67 -0,31 -0,52 -1,15 -0,37 0,64 0,37 0,85 -0,53 0,48

-0,56 -1,24 -0,34 0,47 0,58 0,03 -0,65 -0,95 -0,86 0,51 -0,30 -0,46 -1,38 0,33 1,17 0,74 0,67 -0,18 0,48 0,75 0,89 -0,55 -0,82 -0,12 -0,86 -0,64 -1,29 -2,91 -4,08 0,40 -0,78 1,54 -0,73 0,23 -0,06 0,96 0,77 0,71 0,64 0,26 -0,14 -1,12 -0,84 -0,56 0,22 -0,49 0,34 0,43 -1,19 -0,09 -0,67 -0,45 -0,54 0,46 -0,88

1,58 0,47 0,89 1,72 1,99 0,34 0,44 -0,21 1,07 0,78 0,51 -0,50 -1,84 0,34 0,29 -0,49 0,73 -0,80 -0,68 -0,15 1,05 -0,57 0,69 0,95 -0,94 0,44 -1,17 -1,73 -0,28 2,05 3,30 -0,48 -0,90 0,61 0,44 -0,18 0,02 -0,64 0,32 -1,92 -1,24 -1,56 -3,56 -0,10 0,88 -0,69 1,73 -0,92 -2,15 0,88 0,98 -0,38 0,64 -1,09 -0,16

Anexo IV

STM2129 STM2129 STM2130 STM2130 STM2131 STM2131 STM2133 STM2133 STM2134 STM2134 STM2135 STM2135 STM2136 STM2136 STM2138 STM2138 STM2139 STM2139 STM2139,2n STM2139,2n STM2140 STM2140 STM2142 STM2142 STM2143 STM2143 STM2144 STM2144 STM2145 STM2145 STM2146 STM2146 STM2147 STM2147 STM2148 STM2148 STM2153 STM2153 STM2154 STM2154 STM2155 STM2155 STM2156 STM2156 STM2156A STM2156A STM2157 STM2157 STM2158 STM2158 STM2159 STM2159 STM2160 STM2160 STM2162

yegB yegB baeS baeS baeR baeR STM2133 STM2133 STM2134 STM2134 STM2135 STM2135 yegQ yegQ STM2138 STM2138 STM2139 STM2139 STM2139,2n STM2139,2n yegS yegS yegT yegT yegU yegU yegV yegV yegW yegW thiD thiD thiM thiM STM2148 STM2148 yehE yehE mrp mrp metG metG yehR yehR STM2156A STM2156A yehS yehS yehT yehT yehU yehU yehV yehV yehW

-0,67 0,60 -1,20 -0,15 -0,26 1,34 0,46 0,81 -0,29 -0,28 -0,79 0,63 -1,39 -0,89 3,10 2,74 0,47 1,60 2,07 2,04 -0,70 0,83 -0,39 0,46 -0,33 1,00 -0,17 -1,93 -0,80 0,04 0,32 0,78 -0,58 1,13 -0,10 1,24 -1,14 -0,48 -1,07 -0,83 -0,64 -0,33 1,30 2,05 -0,84 -0,38 -1,12 0,74 -1,26 -1,11 -0,99 1,29 2,38 3,14 -1,14

0,71 0,31 -0,58 -0,19 -0,22 0,07 0,17 -1,09 -0,29 -0,34 -1,77 -1,15 -1,19 -1,12 5,10 4,83 5,91 5,91 1,13 1,76 1,27 1,18 0,18 0,18 -0,66 -0,71 -0,18 -0,31 0,68 1,07 3,93 3,74 3,28 3,42 0,16 0,12 -0,41 -0,37 -0,47 -0,34 -0,63 -1,10 0,05 -0,09 0,06 -0,48 -0,65 -0,81 -0,32 -0,84 -0,43 -0,84 1,25 1,44 -0,14

0,40 0,42 0,05 -0,68 -0,69 0,16 0,53 0,45 -0,42 -1,14 -1,33 -0,61 -2,18 -1,41 3,01 2,60 0,53 0,71 1,79 2,45 1,76 2,59 0,53 0,83 -1,32 -0,58 0,94 -1,50 -0,39 -0,43 0,01 1,21 -0,35 -0,39 -0,27 0,49 -0,23 -0,75 -0,89 -0,82 0,20 -1,10 1,77 2,19 -0,66 -0,32 -1,47 -1,26 -0,43 -0,33 -1,40 -0,08 2,46 3,12 0,97

STM2162 STM2163 STM2163 STM2164 STM2164 STM2165 STM2165 STM2166 STM2166 STM2167 STM2167 STM2168 STM2168 STM2169 STM2169 STM2170 STM2170 STM2171 STM2171 STM2172 STM2172 STM2174 STM2174 STM2175 STM2175 STM2176 STM2176 STM2177 STM2177 STM2178 STM2178 STM2179 STM2179 STM2180 STM2180 STM2181 STM2181 STM2182 STM2182 STM2183 STM2183 STM2184 STM2184 STM2185 STM2185 STM2186 STM2186 STM2187 STM2187 STM2188 STM2188 STM2189 STM2189 STM2190 STM2190

261

yehW yehX yehX yehY yehY yehZ yehZ bglX bglX dld dld pbpG pbpG yohC yohC yohD yohD yohF yohF yohG yohG yohI yohI STM2175 STM2175 STM2176 STM2176 STM2177 STM2177 STM2178 STM2178 STM2179 STM2179 STM2180 STM2180 yohJ yohJ yohK yohK cdd cdd sanA sanA b2145 b2145 STM2186 STM2186 yeiA yeiA mglC mglC mglA mglA mglB mglB

-0,12 0,46 0,99 -0,78 0,11 0,08 1,28 -1,01 -0,06 -0,60 1,22 -0,42 -0,60 -0,78 0,16 0,62 1,31 0,06 2,23 -0,35 1,64 0,72 1,15 -0,92 -0,86 -0,68 0,74 0,34 0,30 0,05 0,24 -0,11 2,23 0,47 2,07 0,15 0,41 -0,27 0,48 -0,56 -0,53 -1,22 -0,61 -0,58 -1,04 -0,74 0,58 0,15 0,71 0,47 2,28 0,08 1,61 -0,12 0,26

0,86 -0,72 -0,02 -0,12 0,15 2,15 2,04 -1,02 -1,26 0,19 -0,48 -1,28 -1,20 0,42 0,55 1,27 -0,40 0,90 1,09 0,72 -1,16 0,40 -0,48 0,24 -0,67 0,27 1,82 -0,03 -0,20 0,38 0,56 -0,37 -0,62 -0,21 -0,47 1,04 0,88 0,50 0,43 -0,64 -1,30 -0,72 -1,09 -1,23 -1,20 -0,65 -0,94 0,98 -0,11 -0,01 -1,20 0,44 0,66 1,89 1,79

1,34 -0,69 -0,16 -0,75 0,11 1,16 2,78 0,02 0,51 -0,08 0,46 -1,06 -1,44 4,10 4,57 1,36 -0,16 2,62 3,73 1,42 -0,57 1,16 1,75 -0,55 0,90 -0,47 0,58 -0,20 0,99 0,67 0,82 -0,68 1,31 0,68 0,93 0,78 0,96 -0,67 0,38 -1,66 -1,17 -1,18 -0,78 -0,78 -0,17 -0,82 0,32 1,56 -0,55 -0,16 0,32 0,31 0,82 0,21 0,90

Anexo IV

STM2191 STM2191 STM2192 STM2192 STM2193 STM2193 STM2194 STM2194 STM2195 STM2195 STM2196 STM2196 STM2197 STM2197 STM2198 STM2198 STM2199 STM2199 STM2200 STM2200 STM2201 STM2201 STM2202 STM2202 STM2203 STM2203 STM2204 STM2204 STM2205 STM2205 STM2206 STM2206 STM2207 STM2207 STM2208 STM2208 STM2209 STM2209 STM2211,S STM2211,S STM2212 STM2212 STM2213 STM2213 STM2214 STM2214 STM2215 STM2215 STM2216 STM2216 STM2217 STM2217 STM2218 STM2218 STM2219

galS galS yeiB yeiB folE folE yeiG yeiG STM2195 STM2195 STM2196 STM2196 STM2197 STM2197 STM2198 STM2198 cirA cirA lysP lysP yeiE yeiE yeiH yeiH nfo nfo fruA fruA fruK fruK fruF fruF setB setB STM2208 STM2208 STM2209 STM2209 yeiP yeiP yeiR yeiR yeiU yeiU spr spr rtn rtn yejA yejA yejB yejB yejE yejE yejF

0,23 1,43 -0,48 -0,32 -1,70 -0,73 -0,43 0,50 -0,51 0,32 -0,35 1,21 0,34 1,57 0,45 0,98 -0,54 0,81 -2,02 -1,05 0,03 -0,16 -1,08 -0,46 -2,15 -1,51 -1,47 -0,49 -2,52 -2,00 -2,48 -2,35 -0,68 -0,08 -0,18 1,00 -0,38 0,32 -1,07 -0,27 -1,01 0,38 -1,61 -1,89 -2,26 -1,82 -0,80 0,11 -0,23 -0,17 -1,50 0,31 -0,52 -0,49 -0,05

0,93 1,24 0,08 -0,45 0,23 0,05 -0,09 0,81 -0,45 0,27 0,72 0,23 1,16 -0,58 1,93 2,19 2,25 2,06 -0,20 -0,91 0,24 0,41 -1,74 -0,72 -1,06 -1,61 -1,01 -1,59 -1,18 -1,25 -1,94 -1,49 -0,06 -1,26 0,45 -0,24 0,23 -0,70 -1,23 -1,54 -0,25 -0,33 -0,12 -0,80 -1,20 -0,64 -0,59 -0,83 0,28 -0,29 -0,58 -0,48 -0,88 -0,62 0,34

-0,66 1,41 -0,18 -0,10 -0,35 -0,70 -0,02 -0,04 -1,04 -0,61 -0,08 -0,47 1,08 1,41 -0,20 0,62 -0,69 1,35 -0,96 0,34 0,83 -0,31 -2,01 -1,42 -1,88 -2,18 -3,19 -2,65 -2,14 -2,72 -4,32 -3,15 -1,09 -0,29 -0,24 -1,25 0,32 -0,03 -1,77 -1,00 -0,55 0,39 -2,36 -2,65 -2,37 -1,93 -0,28 0,70 -0,31 0,50 -0,76 -0,14 -0,59 -0,03 -1,41

STM2219 STM2220 STM2220 STM2221 STM2221 STM2222 STM2222 STM2223 STM2223 STM2224 STM2224 STM2225 STM2225 STM2226 STM2226 STM2227 STM2227 STM2228 STM2228 STM2229 STM2229 STM2231 STM2231 STM2232 STM2232 STM2233 STM2233 STM2234 STM2234 STM2235 STM2235 STM2236 STM2236 STM2237 STM2237 STM2238 STM2238 STM2240 STM2240 STM2240 STM2240 STM2242 STM2242 STM2243 STM2243 STM2245 STM2245 STM2246 STM2246 STM2247 STM2247 STM3819 STM2254 STM3819 STM2254

262

yejF yejG yejG bcr bcr rsuA rsuA yejH yejH rplY rplY STM2225 STM2225 yejK yejK yejL yejL yejM yejM tRNAPro2 tRNAPro2 STM2231 STM2231 oafA oafA STM2233 STM2233 STM2234 STM2234 STM2235 STM2235 STM2236 STM2236 STM2237 STM2237 STM2238 STM2238 STM2240 STM2240 STM2240 STM2240 STM2242 STM2242 STM2243 STM2243 STM2245 STM2245 narP narP ccmH ccmH ccmA ccmA ccmA ccmA

1,43 -0,34 0,40 -1,08 -0,89 -0,55 -1,04 -0,26 -0,20 -0,75 0,06 -1,77 -0,48 1,52 2,95 -2,27 -2,20 -0,72 -1,29 -0,11 0,22 -0,60 0,35 -1,24 -2,34 -0,58 0,53 -1,26 -0,12 -0,55 -1,31 0,90 1,94 0,83 1,93 0,53 0,80 -0,33 0,37 -0,15 0,43 1,71 2,23 0,83 1,11 0,91 2,94 -0,27 0,79 -0,64 0,21 -0,76 0,23 0,45 0,96

-0,04 0,33 0,17 -0,31 -0,60 -1,13 -0,89 -0,36 -0,66 -0,79 -0,84 -0,32 -0,35 -0,11 -0,51 -1,27 -1,05 -0,55 -0,33 0,41 -0,95 -1,49 -1,10 -1,11 -1,35 2,36 2,15 3,67 4,21 2,02 1,00 4,74 4,83 3,79 4,01 -1,05 -0,73 2,19 2,38 1,54 2,96 3,09 2,85 0,73 0,83 0,06 -0,95 -0,70 0,23 0,02 -1,85 -0,62 -1,13 -1,23 -0,79

-0,55 -0,79 -0,48 -0,22 -0,70 -1,44 -1,51 -0,97 -1,41 -3,73 -2,10 -0,52 -0,34 -0,26 -1,01 -2,29 -1,79 0,39 -0,33 2,75 2,71 -0,25 0,11 -0,50 -0,90 -0,49 0,00 -1,02 -0,07 2,27 1,52 -0,17 0,00 -1,45 0,54 0,39 1,24 -0,45 -0,53 -1,01 0,61 0,35 1,41 -1,05 0,52 0,83 0,99 -1,05 -1,27 -1,12 0,63 -1,05 -1,70 -0,76 -0,27

Anexo IV

STM2255 STM2255 STM2256 STM2256 STM2257 STM2257 STM2258 STM2258 STM2259 STM2259 STM2260 STM2260 STM2262 STM2262 STM2263 STM2263 STM2264 STM2264 STM2265 STM2265 STM2266 STM2266 STM2267 STM2267 STM2269 STM2269 STM2270 STM2270 STM2271 STM2271 STM2272 STM2272 STM2273 STM2273 STM2274 STM2274 STM2275 STM2275 STM2276 STM2276 STM2277 STM2277 STM2278 STM2278 STM2279 STM2279 STM2280 STM2280 STM2281 STM2281 STM2282 STM2282 STM2283 STM2283 STM2284

napC napC napB napB napH napH napG napG napA napA napD napD eco eco yojI yojI alkB alkB ada ada apbE apbE ompC ompC yojN yojN rcsB rcsB rcsC rcsC gyrA gyrA STM2273 STM2273 STM2274 STM2274 STM2275 STM2275 ubiG ubiG nrdA nrdA nrdB nrdB yfaE yfaE STM2280 STM2280 STM2281 STM2281 glpQ glpQ glpT glpT glpA

-1,00 0,32 -0,17 0,33 -0,34 1,91 0,96 0,91 -1,84 -1,60 -0,62 1,11 -0,32 0,19 -0,96 0,21 -0,03 -0,20 -1,15 -0,09 -1,27 -0,50 -4,48 -3,54 -1,40 -0,80 -1,13 0,11 -0,99 -0,11 -0,25 0,37 0,14 0,70 -1,22 -0,74 -1,15 1,94 -1,73 1,18 -2,18 -1,79 -2,14 -0,82 -2,01 -1,04 -1,48 -0,31 1,06 -0,07 0,98 -0,38 -1,42 -0,53 -0,60

-0,24 -0,47 -1,38 -1,82 -0,56 -0,54 -1,57 -1,27 -0,64 -1,38 -0,48 -0,94 0,79 0,17 -0,21 -0,37 -0,58 -0,37 -0,30 -0,89 -0,99 -1,06 -1,61 -0,90 0,37 0,00 -0,36 -0,09 -0,45 -0,63 -0,30 -0,43 -0,26 -0,39 -1,31 -0,85 -0,38 -0,72 -1,14 -0,92 -1,34 -1,08 -0,65 -0,67 -1,68 -1,10 -0,96 -0,99 0,25 0,35 1,24 0,33 -0,15 0,20 0,61

-1,26 -0,39 -1,14 0,18 0,69 0,51 -1,06 -0,25 -1,47 -0,34 -0,13 0,30 0,60 1,82 -1,32 -0,55 -1,01 1,53 -0,73 -0,31 -1,45 -1,44 -3,81 -4,71 -0,58 -0,40 -1,56 -0,94 -1,07 -0,27 -1,30 -0,31 0,40 0,50 -0,09 -0,03 -0,59 -0,29 -0,86 -0,89 -3,59 -3,42 -3,07 -1,85 -2,57 -1,72 -3,51 -0,67 1,59 0,56 0,40 -2,40 -0,57 -0,92 0,91

STM2284 STM2285 STM2285 STM2286 STM2286 STM2288 STM2288 STM2289 STM2289 STM2290 STM2290 STM2291 STM2291 STM2292 STM2292 STM2293 STM2293 STM2294 STM2294 STM2295 STM2295 STM2296 STM2296 STM2297 STM2297 STM2298 STM2298 STM2299 STM2299 STM2300 STM2300 STM2301 STM2301 STM2302 STM2302 STM2303 STM2303 STM2304 STM2304 STM2305 STM2305 STM2306 STM2306 STM2307 STM2307 STM2308 STM2308 STM2309 STM2309 STM2310 STM2310 STM2311 STM2311 STM2312 STM2312

263

glpA glpB glpB glpC glpC STM2288 STM2288 STM2289 STM2289 yfaV yfaV yfaW yfaW yfaX yfaX STM2293 STM2293 yfaZ yfaZ yfaO yfaO ais ais yfbE yfbE pmrF pmrF yfbG yfbG STM2300 STM2300 pqaB pqaB STM2302 STM2302 STM2303 STM2303 pmrD pmrD menE menE menC menC menB menB yfbB yfbB menD menD menF menF elaB elaB elaA elaA

1,44 2,05 2,35 0,03 1,25 -0,42 0,38 -0,45 1,16 0,03 0,51 2,16 1,10 -0,04 1,11 0,45 1,14 -2,83 0,68 -0,73 -0,24 -1,40 -1,23 -1,41 -0,35 -0,52 0,94 -1,33 -1,20 1,02 1,16 -0,44 1,03 0,71 1,49 0,37 1,25 1,09 0,70 -0,29 -0,13 -1,90 -0,81 -1,47 0,23 -1,32 0,40 -1,55 -1,29 0,05 1,47 0,47 0,92 -0,43 0,47

1,09 1,08 0,90 1,55 1,26 3,63 3,42 2,47 2,39 0,00 -0,36 0,38 0,24 0,09 0,33 3,12 3,70 -2,13 -2,49 -0,02 -0,03 1,11 -0,48 0,01 -0,04 -0,02 -0,56 -1,15 -0,30 -1,22 -1,46 0,27 -0,05 -0,50 -1,03 -0,52 -0,54 0,51 -0,36 0,11 -0,10 -0,77 -1,33 -0,33 -0,50 -0,02 0,43 -2,41 -2,23 0,41 -2,41 2,36 2,31 0,66 1,23

2,62 0,49 0,70 1,14 1,62 0,37 -0,07 0,19 0,70 -1,00 -0,20 1,52 1,14 1,44 1,33 -0,23 -0,46 -3,34 -0,67 -0,74 -1,17 -0,43 -2,89 -2,25 -1,50 -0,54 -0,83 -2,74 -1,77 -0,83 -0,57 -0,99 0,01 -0,87 0,61 -1,57 -0,45 -0,24 -2,94 0,52 0,16 -0,81 -1,16 -2,15 -1,46 -1,37 -0,18 -1,25 -2,03 0,42 0,70 3,92 4,30 1,18 2,10

Anexo IV

STM2313 STM2313 STM2315 STM2315 STM2316,S STM2316,S STM2317 STM2317 STM2318 STM2318 STM2319 STM2319 STM2320 STM2320 STM2321 STM2321 STM2322 STM2322 STM2323,S STM2323,S STM2324 STM2324 STM2325 STM2325 STM2326 STM2326 STM2327 STM2327 STM2328 STM2328 STM2329 STM2329 STM2330 STM2330 STM2331 STM2331 STM2332 STM2332 STM2333 STM2333 STM2334 STM2334 STM2335 STM2335 STM2336 STM2336 STM2339 STM2339 STM2340 STM2340 STM2341 STM2341 STM2342 STM2342 STM2343

elaC elaC yfbK yfbK nuoN nuoN nuoM nuoM nuoL nuoL nuoK nuoK nuoJ nuoJ nuoI nuoI nuoH nuoH nuoG nuoG nuoF nuoF nuoE nuoE nuoC nuoC nuoB nuoB nuoA nuoA STM2329 STM2329 lrhA lrhA yfbQ yfbQ STM2332 STM2332 yfbS yfbS yfbT yfbT yfbU yfbU STM2336 STM2336 yfcC yfcC STM2340 STM2340 STM2341 STM2341 ulaA ulaA STM2343

-0,94 -0,06 -0,89 -1,83 -1,89 -0,85 -3,91 -4,87 -3,74 -2,24 -3,43 -2,16 0,76 0,72 -1,38 -0,19 -3,58 -2,48 -2,12 -2,08 -3,95 -2,69 -4,29 -2,49 -3,52 -3,47 -3,50 -2,21 -3,78 -2,67 -2,24 -1,22 -1,49 -0,06 -0,54 -0,03 -0,12 0,95 -0,11 -0,12 -0,82 -0,06 -1,63 -0,42 -1,53 -0,78 -1,22 -0,52 -0,41 1,38 -0,29 0,77 0,98 1,93 0,34

-0,88 -0,83 -1,63 -0,86 -2,51 -2,61 -3,69 -3,85 -3,72 -3,42 -3,51 -3,41 -1,74 -2,79 -3,40 -3,45 -4,23 -4,18 -3,11 -4,03 -3,73 -3,21 -3,47 -3,32 -3,80 -3,94 -3,60 -3,28 -3,60 -3,94 -0,42 -1,67 -1,09 -0,75 -0,88 -0,69 0,33 0,24 0,47 -0,58 -0,15 -0,05 -0,02 0,39 -0,67 -0,38 0,00 -0,33 0,24 1,35 0,46 0,16 0,68 0,86 0,34

-0,53 -0,26 -1,21 -0,18 -3,08 -1,89 -4,07 -4,77 -4,25 -4,10 -3,01 -3,40 -2,77 -2,51 -1,64 -0,94 -3,91 -2,48 -2,55 -2,06 -4,18 -3,38 -3,69 -3,64 -3,32 -3,33 -3,75 -3,33 -2,77 -2,90 -2,09 -1,66 -1,10 -0,86 -1,70 -0,66 -0,64 -0,02 -0,95 -0,62 -0,44 0,23 -0,71 -0,47 0,30 0,26 -0,47 -1,31 0,92 3,16 -0,31 0,43 1,56 2,41 0,24

STM2343 STM2344 STM2344 STM2345 STM2345 STM2346 STM2346 STM2347 STM2347 STM2348 STM2348 STM2349 STM2349 STM2350 STM2350 STM2351 STM2351 STM2352 STM2352 STM2353 STM2353 STM2354 STM2354 STM2355 STM2355 STM2356 STM2356 STM2357 STM2357 STM2358 STM2358 STM2359 STM2359 STM2360 STM2360 STM2361 STM2361 STM2362 STM2362 STM2363 STM2363 STM2364 STM2364 STM2365 STM2365 STM2366 STM2366 STM2367 STM2367 STM2368 STM2368 STM2369 STM2369 STM2370 STM2370

264

STM2343 STM2344 STM2344 STM2345 STM2345 STM2346 STM2346 yfcE yfcE yfcF yfcF yfcG yfcG yfcH yfcH hisP hisP hisM hisM hisQ hisQ hisJ hisJ argT argT ubiX ubiX STM2357 STM2357 STM2358 STM2358 STM2359 STM2359 STM2360 STM2360 STM2361 STM2361 purF purF cvpA cvpA dedD dedD folC folC accD accD dedA dedA truA truA usg usg pdxB pdxB

0,73 0,96 1,58 -0,28 0,20 0,82 2,48 -0,34 -0,43 -0,96 0,32 -1,06 -0,60 -0,04 1,90 1,58 2,37 -1,21 -0,28 -0,27 2,05 -1,31 -0,02 -0,72 0,23 -0,74 0,35 -1,34 -0,03 -0,50 1,19 0,29 1,46 -0,06 0,59 0,88 0,36 -0,96 0,19 -1,86 -1,25 -0,94 -0,87 -0,79 -0,02 -1,19 0,01 -1,68 -2,03 -1,04 -0,68 -0,81 -0,43 -3,42 -3,34

0,90 0,59 -0,04 -0,24 0,11 -0,23 0,04 0,21 0,23 0,23 -0,40 0,38 -0,30 0,58 0,67 -0,62 -0,80 -0,09 0,10 0,28 -0,74 1,34 1,30 2,13 1,49 -0,35 -0,33 0,15 0,34 -0,48 -0,46 0,26 0,38 -0,32 0,49 0,69 1,04 0,63 1,12 0,10 -0,01 -0,69 -0,01 0,35 0,30 -1,49 -0,52 -0,34 -1,17 -0,34 -0,28 -0,19 -0,22 -1,99 -2,47

0,03 -0,17 1,51 -0,48 0,67 -1,57 -1,00 2,00 2,14 0,46 0,60 1,40 1,90 0,78 1,45 -0,12 1,77 -1,59 0,45 -0,14 0,04 -0,89 -0,66 1,05 1,29 0,19 0,91 -0,37 0,20 0,72 -0,29 -0,42 0,48 0,07 0,26 1,88 0,99 0,60 0,73 -2,27 -2,71 -0,91 -1,52 -1,68 -0,86 -3,27 -3,27 -1,00 -2,56 -1,67 -1,79 -2,08 -2,14 -3,46 -4,11

Anexo IV

STM2371 STM2371 STM2372 STM2372 STM2373 STM2373 STM2374 STM2374 STM2375 STM2375 STM2376 STM2376 STM2377 STM2377 STM2378 STM2378 STM2379 STM2379 STM2380 STM2380 STM2381 STM2381 STM2382 STM2382 STM2383 STM2383 STM2384 STM2384 STM2385 STM2385 STM2386 STM2386 STM2387 STM2387 STM2390 STM2390 STM2392 STM2392 STM2393 STM2393 STM2394 STM2394 STM2395 STM2395 STM2396 STM2396 STM2397 STM2397 STM2398 STM2398 STM2399 STM2399 STM2400 STM2400 STM2401

flk flk STM2372 STM2372 STM2373 STM2373 STM2374 STM2374 STM2375 STM2375 STM2376 STM2376 STM2377 STM2377 fabB fabB STM2379 STM2379 yfcL yfcL yfcM yfcM yfcA yfcA mepA mepA aroC aroC yfcB yfcB yfcN yfcN sixA sixA yfcZ yfcZ vacJ vacJ yfdC yfdC argW argW pgtE pgtE pgtA pgtA pgtB pgtB pgtC pgtC pgtP pgtP STM2400 STM2400 ddg

-0,70 0,28 -0,85 -0,21 -0,41 1,11 -0,84 0,83 -0,27 0,11 -1,02 0,38 -0,93 -0,70 -1,62 -1,06 -0,58 -1,71 -0,83 -1,80 -0,62 0,17 -1,93 -0,69 2,04 2,20 -1,25 -0,70 -2,09 -1,72 -0,62 -0,11 -1,05 0,04 0,29 -1,41 -0,89 -0,04 4,12 3,08 -0,02 -0,16 0,63 1,30 1,63 0,84 -1,66 -0,91 0,61 2,80 -0,36 1,32 -0,10 1,41 -0,46

0,46 0,57 0,94 1,20 -0,77 -0,33 -0,35 -0,79 -0,83 -0,90 -0,81 -0,92 -0,83 -0,95 -0,74 -0,34 -0,36 -1,35 -1,17 -0,96 -0,60 -0,78 -1,38 -1,93 1,15 1,32 -0,33 -0,38 -0,80 -0,88 0,47 0,92 0,65 0,97 -1,52 -0,19 -0,61 -0,80 -1,43 -2,07 0,73 -0,35 -0,26 0,12 0,70 0,74 -0,24 -0,29 0,80 0,69 0,02 -0,59 -0,24 0,13 -0,13

-1,46 -1,33 -1,76 -0,93 -0,49 1,06 -0,33 0,13 -1,30 -0,02 -0,84 -1,42 -0,40 0,00 -2,04 -1,76 -0,18 -0,76 -1,48 -1,44 -2,02 -0,40 -2,34 -1,51 -1,24 -1,07 -2,09 -1,71 -2,44 -2,32 -0,56 -0,46 -0,07 0,55 -0,80 -0,55 -0,91 0,03 2,10 2,60 0,83 -1,88 -0,25 2,10 -0,57 0,10 -1,17 0,08 0,49 1,71 -0,26 -0,37 1,41 2,26 -1,12

STM2401 STM2402 STM2402 STM2404 STM2404 STM2405 STM2405 STM2406 STM2406 STM2407 STM2407 STM2409 STM2409 STM2410 STM2410 STM2412 STM2411 STM2412 STM2411 STM2413 STM2413 STM2414 STM2414 STM2415 STM2415 STM2416 STM2417 STM2418 STM0752 STM2416 STM2417 STM2418 STM0752 STM0753 STM0751 STM0755 STM2419 STM0754 STM0753 STM0751 STM0755 STM2419 STM0754 STM2420 STM2420 STM2420,1n STM2420,1n STM2421 STM2421 STM2423 STM2423 STM2424 STM2424 STM2425 STM2425

265

ddg yfdZ yfdZ STM2404 STM2404 STM2405 STM2405 STM2406 STM2406 ypeC ypeC nupC nupC yfeA yfeA alaW alaX alaW alaX yfeC yfeC yfeD yfeD gltX gltX valU valX valY valT valU valX valY valT lysW lysT lysZ lysV lysY lysW lysT lysZ lysV lysY xapR xapR STM2420,1n STM2420,1n xapB xapB yfeN yfeN yfeR yfeR yfeH yfeH

0,47 -0,35 0,05 -0,69 -0,07 -0,78 0,79 -0,67 0,03 0,41 0,22 -1,90 -1,39 -0,15 0,84 1,13 1,60 1,96 2,09 -1,15 -0,29 0,08 0,56 -1,17 -0,34 -1,09 -1,22 0,39 -1,21 -0,91 -0,88 0,33 -0,86 -2,29 -1,40 -2,01 -1,38 -2,17 -1,01 -0,03 -1,00 -0,83 -1,00 -0,98 -2,10 -1,03 -0,65 -1,05 -1,25 -0,43 -0,87 0,92 1,84 -0,87 -0,65

-0,08 0,13 0,39 0,36 0,77 0,71 0,81 0,36 0,31 1,14 0,60 -1,24 -1,69 -0,66 -1,29 0,85 1,11 0,94 1,14 -0,88 -0,74 -0,58 -0,57 -1,21 -1,23 -0,80 -1,27 -1,21 -1,25 -1,00 -1,21 -1,14 -1,29 -1,19 -1,14 -0,81 -1,09 -1,49 -1,27 -1,01 -0,56 -1,01 -1,33 -1,49 -2,09 -1,22 -1,48 -1,22 -1,81 0,10 0,33 -0,10 -1,15 -0,01 -0,11

-0,43 -0,49 0,07 2,11 2,04 2,07 3,22 0,23 0,44 1,43 1,33 -0,98 -0,90 -0,90 -0,13 0,72 1,01 1,32 1,41 -0,32 -0,09 -0,93 -0,71 -0,93 -0,92 -1,02 -1,00 -0,79 -1,16 -1,35 -0,96 -0,64 -0,95 0,33 0,17 0,09 0,60 -0,56 0,26 0,15 0,41 0,27 -0,03 -1,77 -1,99 -0,86 -0,55 -0,99 -0,68 0,02 -0,27 -0,91 0,31 -0,46 -0,05

Anexo IV

STM2426 STM2426 STM2427 STM2427 STM2428 STM2428 STM2429 STM2429 STM2430 STM2430 STM2431 STM2431 STM2432 STM2432 STM2433 STM2433 STM2434 STM2434 STM2435 STM2435 STM2436 STM2436 STM2437 STM2437 STM2438 STM2438 STM2439 STM2439 STM2440 STM2440 STM2441 STM2441 STM2442 STM2442 STM2443 STM2443 STM2444 STM2444 STM2445 STM2445 STM2446 STM2446 STM2447 STM2447 STM2448 STM2448 STM2449,S STM2449,S STM2450 STM2450 STM2451 STM2451 STM2452 STM2452 STM2453

STM2426 STM2426 lig lig zipA zipA cysZ cysZ cysK cysK ptsH ptsH ptsI ptsI crr crr STM2434 STM2434 pdxK pdxK ptsJ ptsJ yfeJ yfeJ yfeK yfeK yfeL yfeL cysM cysM cysA cysA cysW cysW cysU cysU cysP cysP ucpA ucpA STM2446 STM2446 STM2447 STM2447 yfeZ yfeZ STM2449,S STM2449,S amiA amiA hemF hemF STM2452 STM2452 STM2453

-0,89 -0,53 -1,51 -1,52 -0,88 -0,49 -1,57 -1,10 -1,90 -0,90 -3,58 -1,74 -2,90 -2,12 -2,15 -1,74 -1,06 0,58 -0,05 0,28 0,60 0,17 -0,64 1,13 -0,52 -1,20 -1,08 -0,32 -1,49 -0,21 -0,05 1,13 1,04 2,92 -0,84 2,01 -0,36 1,05 -0,83 -0,34 -1,10 1,19 -1,16 0,33 -0,39 0,90 -0,56 -0,15 -0,43 -1,89 -1,10 0,90 0,02 -2,01 0,88

0,16 -0,94 -0,28 -0,50 -0,28 -0,28 -0,03 -0,30 0,80 1,03 -0,17 -0,05 0,26 0,15 -0,37 -0,23 -0,14 -0,25 -0,13 -0,20 -2,74 -3,45 0,08 -0,01 1,00 -0,52 0,24 0,11 -0,82 -0,94 -0,59 0,30 0,92 0,48 -0,03 0,20 -0,56 -0,98 -0,52 -0,41 -0,16 -0,16 -0,07 0,24 0,25 0,24 -0,01 0,41 -1,33 -1,54 -1,05 -1,35 -1,97 -1,96 -0,10

-0,94 -3,31 -0,85 -1,62 -0,96 -0,40 -1,43 -1,28 -1,51 -0,95 -1,18 -0,38 0,16 0,51 0,25 0,67 -0,11 -0,49 -0,67 -0,25 -0,50 -0,68 -1,22 0,20 -0,68 -0,06 -0,52 0,12 -1,64 -1,14 -1,30 0,04 1,92 2,91 -1,70 0,19 -2,41 -1,50 -0,58 0,27 -1,26 -0,65 0,23 -0,62 -1,16 0,25 -1,22 0,13 -2,12 -1,99 -3,06 -1,46 -0,68 -1,34 -0,29

STM2453 STM2454 STM2454 STM2455 STM2455 STM2456 STM2456 STM2457 STM2457 STM2458 STM2458 STM2459 STM2459 STM2460 STM2460 STM2461 STM2461 STM2462 STM2462 STM2463 STM2463 STM2464 STM2464 STM2465 STM2465 STM2466 STM2466 STM2467 STM2467 STM2468 STM2468 STM2469 STM2469 STM2470 STM2470 STM2473 STM2473 STM2475 STM2475 STM2476 STM2476 STM2477 STM2477 STM2478 STM2478 STM2479 STM2479 STM2480 STM2480 STM2481 STM2481 STM2482 STM2482 STM2483 STM2483

266

STM2453 eutR eutR eutK eutK eutL eutL eutC eutC eutB eutB eutA eutA eutH eutH eutG eutG eutJ eutJ eutE eutE eutN eutN eutM eutM eutD eutD eutT eutT eutQ eutQ eutP eutP eutS eutS talA talA STM2475 STM2475 ypfG ypfG yffH yffH STM2478 STM2478 aegA aegA narQ narQ acrD acrD yffB yffB dapE dapE

2,29 -1,92 -0,08 0,46 0,68 -0,18 1,38 0,14 1,79 1,23 2,69 0,59 0,60 0,99 2,53 3,30 3,18 0,40 1,56 -0,16 1,01 0,64 1,49 0,89 1,27 -0,16 0,88 -1,19 -0,17 -0,37 -0,31 0,55 2,03 4,11 4,65 -0,91 0,14 5,91 7,10 0,70 1,14 -0,57 0,04 0,32 1,35 -0,03 1,61 0,72 2,60 0,86 0,64 -1,90 -1,82 -2,44 -1,22

-0,25 -0,49 -0,70 1,15 1,98 0,45 0,09 1,02 0,95 0,21 -0,70 0,23 -0,04 0,94 -0,76 -0,54 0,04 -0,69 -0,35 0,24 0,00 -0,06 -0,84 0,06 -0,34 -0,15 -0,85 -0,94 -0,61 -0,77 -1,16 0,91 0,87 -0,12 -0,75 2,54 2,74 1,66 1,63 -0,32 -0,19 -0,26 0,44 1,26 1,75 0,44 0,27 -0,13 -0,71 0,44 -0,58 -1,30 -1,52 -0,17 -0,10

1,83 -0,22 0,01 0,08 1,05 0,25 0,93 1,43 1,37 0,38 1,47 -0,25 0,01 0,49 0,62 0,68 1,43 0,06 0,19 -1,27 -0,07 -0,22 -0,12 0,08 -0,12 0,20 2,21 -0,24 -0,16 0,63 -0,38 1,13 1,30 -0,51 1,56 2,92 3,97 5,30 4,63 -0,12 1,31 -0,38 -0,22 0,98 1,66 0,53 0,23 0,01 1,18 2,83 0,26 -2,13 -2,48 0,26 0,49

Anexo IV

STM2484 STM2484 STM2485 STM2485 STM2486 STM2486 STM2487 STM2487 STM2488 STM2488 STM2489 STM2489 STM2490 STM2490 STM2491 STM2491 STM2492 STM2492 STM2493 STM2493 STM2494 STM2494 STM2495 STM2495 STM2496 STM2496 STM2497 STM2497 STM2498 STM2498 STM2499,S STM2499,S STM2500 STM2500 STM2501 STM2501 STM2502 STM2502 STM2503 STM2503 STM2506 STM2506 STM2509 STM2509 STM2510 STM2510 STM2511 STM2511 STM2512 STM2512 STM2513 STM2513 STM2514 STM2514 STM2515

STM2484 STM2484 ypfI ypfI STM2486 STM2486 purC purC nlpB nlpB dapA dapA gcvR gcvR bcp bcp STM2492 STM2492 perM perM STM2494 STM2494 yfgD yfgD yfgE yfgE uraA uraA upp upp purM purM purN purN ppk ppk ppx ppx STM2503 STM2503 STM2506 STM2506 STM2509 STM2509 guaA guaA guaB guaB xseA xseA shdA shdA ratB ratB ratA

-0,63 0,18 -1,63 -0,10 -0,47 -0,08 -1,23 -1,26 -1,50 -0,30 -2,91 -3,32 -1,74 -0,92 -1,08 0,51 0,14 -0,47 -1,56 -0,13 -0,27 -0,54 -0,95 -0,50 -1,22 0,08 0,27 1,27 -0,41 -0,76 0,57 1,14 -0,90 -0,27 -2,45 -1,18 -0,74 0,19 -0,36 -0,01 0,58 1,36 1,07 2,50 -1,76 -0,67 -1,63 -1,52 -0,33 0,63 -0,31 0,55 0,66 1,99 -0,22

0,49 0,02 -1,45 -0,35 0,59 1,05 0,73 0,97 -0,78 0,06 -1,66 -0,59 0,09 0,12 -0,12 -0,12 0,42 0,32 -0,32 -0,60 1,27 1,02 0,25 0,72 0,82 0,60 -1,23 -0,50 -0,47 -1,00 1,73 1,65 0,06 -0,18 -0,25 -0,69 -0,53 -0,55 0,58 -0,84 2,08 1,82 0,49 0,47 -0,58 -0,39 0,05 0,47 -0,80 -0,96 -0,52 -0,45 -1,13 0,29 0,22

1,06 1,56 -0,17 -0,23 0,57 1,38 -1,87 -0,84 -3,20 -2,56 -3,02 -4,40 -1,92 -1,43 -0,62 -0,47 -1,71 -0,06 -1,05 -1,04 -0,39 0,35 0,49 -0,68 -1,16 0,16 -1,03 -0,29 1,15 -2,85 1,03 1,89 1,46 0,77 -1,63 -0,72 -1,53 -0,73 -0,35 -0,99 1,10 2,22 0,52 1,77 -1,74 -1,22 -1,22 -1,65 -0,10 0,49 0,83 -0,89 2,84 1,20 -0,23

STM2515 STM2516 STM2516 STM2517 STM2517 STM2518 STM2518 STM2519 STM2519 STM2520 STM2520 STM2521 STM2521 STM2522 STM2522 STM2523 STM2523 STM2524 STM2524 STM2525 STM2525 STM2526 STM2526 STM2527 STM2527 STM2528 STM2528 STM2529 STM2529 STM2530 STM2530 STM2531 STM2531 STM2532 STM2532 STM2533 STM2533 STM2534 STM2534 STM2535 STM2535 STM2536 STM2536 STM2537 STM2537 STM2538 STM2538 STM2539 STM2539 STM2540 STM2540 STM2541 STM2541 STM2542 STM2542

267

ratA sinI sinI sinH sinH yfgJ yfgJ engA engA yfgL yfgL yfgM yfgM hisS hisS gcpE gcpE yfgA yfgA yfgB yfgB ndk ndk STM2527 STM2527 STM2528 STM2528 STM2529 STM2529 STM2530 STM2530 pbpC pbpC STM2532 STM2532 sseA sseA STM2534 STM2534 sseB sseB pepB pepB yfhJ yfhJ fdx fdx hscA hscA hscB hscB iscA iscA nifU nifU

0,21 0,42 0,99 1,09 0,95 -1,01 0,06 0,36 0,95 -2,42 -2,40 -2,80 -1,55 -2,23 -1,04 -3,06 -2,14 -1,52 -0,44 -2,51 -2,54 -2,91 -2,00 -0,98 0,01 0,33 -0,67 -0,10 -1,24 0,28 1,35 0,12 1,11 -1,16 -0,19 -1,29 -0,30 -0,81 0,03 -1,15 -0,66 -1,87 -1,81 -3,52 -4,72 -3,00 -1,86 -3,00 -1,99 -2,82 -0,98 -1,70 -1,08 -1,37 -0,41

0,28 -1,30 -0,91 1,29 0,08 -0,57 -0,92 -0,03 -0,39 -1,83 -1,70 -0,83 -1,10 -1,12 -0,69 -1,41 -0,93 0,01 -0,16 -1,66 -1,36 -2,64 -2,65 -1,50 -1,20 -0,46 -2,12 -0,38 -0,69 -0,61 -0,76 -0,42 -0,56 -0,80 -0,22 -0,63 -0,47 0,14 -0,28 -1,27 -1,28 -1,82 -2,21 -1,99 -1,89 -1,82 -1,75 -1,67 -1,44 -0,96 -0,59 -0,13 -0,41 -0,21 0,16

0,00 0,22 0,51 1,39 1,54 -0,99 -0,78 -0,22 0,61 -2,13 -2,27 -2,69 -2,08 -3,10 -2,72 -0,98 -0,68 -1,01 -0,31 -3,22 -3,07 -3,46 -3,03 -1,40 1,82 -1,13 -0,84 0,16 -0,41 0,97 1,64 -0,80 0,25 -0,98 -0,54 -0,10 0,50 0,48 0,93 -1,09 -2,19 -3,40 -2,90 -2,27 -3,65 -4,22 -3,60 -3,78 -2,74 -2,34 -2,54 -1,24 -0,86 -0,93 -0,33

Anexo IV

STM2543 STM2543 STM2544 STM2544 STM2545 STM2545 STM2546 STM2546 STM2547 STM2547 STM2548 STM2548 STM2549 STM2549 STM2550 STM2550 STM2551 STM2551 STM2552 STM2552 STM2553 STM2553 STM2554 STM2554 STM2555 STM2555 STM2556 STM2556 STM2557 STM2557 STM2558 STM2558 STM2559 STM2559 STM2560 STM2560 STM2561 STM2561 STM2562 STM2562 STM2563 STM2563 STM2564 STM2564 STM2565 STM2565 STM2567 STM2567 STM2568 STM2568 STM2569 STM2569 STM2570 STM2570 STM2571

nifS nifS yfhP yfhP STM2545 STM2545 suhB suhB STM2547 STM2547 asrA asrA asrB asrB asrC asrC STM2551 STM2551 STM2552 STM2552 csiE csiE hcaT hcaT glyA glyA hmpA hmpA cadC cadC cadB cadB cadA cadA yjdL yjdL glnB glnB yfhA yfhA yfhG yfhG yfhK yfhK purG purG yfhD yfhD yfhC yfhC yfhB yfhB STM2570 STM2570 STM2571

-2,64 -2,10 -1,35 -0,35 -0,39 -0,37 2,31 -0,43 -1,03 -0,11 0,70 1,19 0,43 1,40 -0,20 0,73 -0,78 -1,31 1,16 1,49 0,42 0,00 -1,12 -1,01 -1,74 0,38 -0,26 0,22 -1,69 -1,82 -0,43 1,02 0,49 0,81 0,18 -0,31 -1,31 -0,18 -0,56 0,05 -1,18 -0,14 -1,18 -0,12 0,12 1,33 -0,59 0,53 0,47 1,06 -0,78 -0,23 -0,80 -0,18 0,28

-1,18 -0,59 1,27 1,34 0,84 0,52 1,33 0,03 -1,13 -0,87 -0,79 -1,37 0,13 0,24 0,12 0,33 0,03 -0,70 0,60 -0,02 0,57 0,18 0,13 -0,17 0,49 0,90 3,93 3,51 0,13 -0,46 -0,47 -0,63 0,63 0,79 0,56 0,16 -0,25 0,75 0,75 0,72 -0,59 0,02 0,24 0,46 2,51 2,15 -0,45 -0,25 -1,00 -0,97 0,06 -0,23 0,11 0,26 -0,81

-1,54 -0,98 -0,13 0,27 -1,49 -1,20 3,90 2,33 -1,43 -0,52 -1,13 0,24 -0,25 0,35 -1,07 -0,35 -0,57 0,58 -0,44 0,55 1,39 1,80 0,20 -0,75 -1,87 -0,92 -1,01 -0,38 -0,08 -0,80 -0,44 0,71 1,06 -0,14 -0,63 1,87 -2,20 -2,18 -0,54 -0,63 -0,90 -0,74 -0,51 -0,72 -1,63 -0,15 -0,17 0,95 -1,56 -1,04 0,09 0,94 0,44 0,50 -0,85

STM2571 STM2572 STM2572 STM2573 STM2573 STM2574 STM2574 STM2575 STM2575 STM2576 STM2576 STM2577 STM2577 STM2578 STM2578 STM2579 STM2579 STM2580 STM2580 STM2581 STM2581 STM2582 STM2582 STM2583 STM2583 STM2586 STM2586 STM2587 STM2587 STM2588 STM2588 STM2589 STM2589 STM2590 STM2590 STM2591 STM2591 STM2592 STM2592 STM2593 STM2593 STM2594 STM2594 STM2595 STM2595 STM2596 STM2596 STM2598 STM2598 STM2599 STM2599 STM2600 STM2600 STM2601 STM2601

268

STM2571 yfhH yfhH STM2573 STM2573 STM2574 STM2574 STM2575 STM2575 yfhL yfhL acpS acpS pdxJ pdxJ recO recO era era rncS rncS lepB lepB lepA lepA STM2586 STM2586 STM2587 STM2587 STM2588 STM2588 STM2589 STM2589 STM2590 STM2590 STM2591 STM2591 STM2592 STM2592 STM2593 STM2593 STM2594 STM2594 STM2595 STM2595 STM2596 STM2596 STM2598 STM2598 STM2599 STM2599 STM2600 STM2600 STM2601 STM2601

0,43 -0,17 0,94 -0,42 -0,37 -0,43 -0,72 0,93 0,92 -1,65 -0,61 -0,74 -1,18 -2,42 -1,49 -0,33 -0,36 -1,58 -1,90 -2,51 -1,92 -1,90 -0,54 -2,29 -1,36 2,23 3,39 0,42 2,50 1,43 2,30 1,20 2,22 1,05 2,10 1,23 1,83 0,12 4,16 0,02 0,58 0,69 2,42 1,01 2,14 0,89 0,41 0,70 2,14 -0,87 -1,62 -0,54 0,41 1,77 2,06

-0,60 -0,86 -0,62 0,07 0,28 -0,68 -1,08 0,28 -0,21 -0,30 -0,28 -0,61 -0,29 -0,31 -1,18 -0,64 -1,34 -1,62 -1,61 -0,94 -1,19 -0,89 -0,40 -1,30 -1,00 1,95 1,82 1,77 1,20 1,29 1,29 0,94 0,73 -0,21 -0,84 0,67 0,51 0,60 0,44 0,42 0,18 0,73 -0,15 1,56 0,99 1,39 0,00 1,16 0,74 0,75 0,30 -0,04 0,30 0,45 0,25

0,02 -0,88 -0,20 -0,98 -0,25 -0,96 -0,84 0,12 0,65 -1,79 -2,08 -1,34 0,35 -2,00 -2,29 -1,10 -1,30 -2,62 -1,97 -2,55 -2,14 -1,47 -1,05 -2,44 -2,54 0,20 2,96 0,59 1,42 0,86 0,93 1,50 0,59 1,17 1,49 0,42 0,08 -0,47 0,92 -0,62 0,57 0,95 1,24 -0,22 0,69 0,90 0,96 1,46 1,87 -0,03 -0,91 0,10 -0,11 0,79 1,09

Anexo IV

STM2602 STM2602 STM2603 STM2603 STM2604 STM2604 STM2605 STM2605 STM2606 STM2606 STM2607 STM2607 STM2608 STM2608 STM2609 STM2609 STM2610 STM2610 STM2611,S STM2611,S STM2612 STM2612 STM2613 STM2613 STM2613 STM2613 STM2614 STM2614 STM2614 STM2614 STM2615 STM2615 STM2616 STM2616 STM2617 STM2617 STM2619 STM2619 STM2621 STM2621 STM2621 STM2621 STM2622 STM2622 STM2623 STM2623 STM2624 STM2624 STM2625 STM2625 STM2626 STM2626 STM2630 STM2630 STM2632

STM2602 STM2602 STM2603 STM2603 STM2604 STM2604 STM2605 STM2605 STM2606 STM2606 STM2607 STM2607 STM2608 STM2608 STM2609 STM2609 STM2610 STM2610 STM2611,S STM2611,S STM2612 STM2612 STM2613 STM2613 STM2613 STM2613 STM2614 STM2614 STM2614 STM2614 STM2616 STM2616 STM2617 STM2617 STM2619 STM2619 STM2621 STM2621 STM2621 STM2621 STM2622 STM2622 STM2623 STM2623 STM2624 STM2624 STM2625 STM2625 STM2626 STM2626 STM2630 STM2630 STM2632

0,61 1,74 -0,34 0,95 -0,03 0,06 0,84 1,22 0,98 0,90 -0,13 1,52 0,54 2,86 0,11 0,52 -0,14 0,53 3,65 3,14 0,86 1,68 0,11 0,79 1,80 1,24 0,53 1,00 0,61 3,78 -0,40 0,40 -0,13 1,02 -0,69 0,03 0,67 2,28 2,42 0,12 2,64 0,48 -0,92 0,05 -0,34 0,51 1,96 2,84 -1,17 -0,13 -0,62 0,97 -0,83 0,48 2,70

1,05 1,08 0,75 1,14 1,53 0,82 2,18 1,56 -0,65 -2,33 0,09 0,45 0,50 1,42 2,05 0,06 0,57 1,08 1,24 1,18 -0,23 -0,24 0,01 -0,17 -0,23 -0,49 1,25 0,63 -0,06 0,59 2,64 2,28 -0,67 -0,86 1,13 -0,59 1,06 -0,01 2,29 1,72 2,44 1,36 0,78 0,73 0,73 0,67 -0,69 -1,48 -0,29 -0,46 1,51 -0,92 0,46 0,59 0,27

-0,29 0,75 -0,42 0,19 0,31 -1,43 0,30 2,25 1,20 1,05 -0,44 0,50 1,16 2,12 1,55 1,84 0,38 0,79 2,25 2,30 -0,26 0,30 -0,60 0,20 0,70 0,77 -0,84 1,24 -1,15 2,49 2,23 2,18 -1,17 -0,36 -0,63 -0,66 0,26 0,16 1,40 -0,42 3,44 0,26 -0,37 0,16 -1,21 -0,97 1,08 1,94 -0,38 -0,17 -1,63 0,87 0,06 -0,03 1,57

STM2632 STM2634 STM2634 STM2634 STM2634 STM2634 STM2634 STM2636 STM2636 STM2637 STM2637 STM2638 STM2638 STM2639 STM2639 STM2640 STM2640 STM2641 STM2641 STM2642 STM2642 STM2643 STM2643 STM2644 STM2644 STM2645 STM2645 STM2646 STM2646 STM2647 STM2647 STM2648 STM2648 STM2649 STM2649 STM2650 STM2650 STM2651 STM2651 STM2652 STM2652 STM2653 STM2653 STM2654 STM2654 STM2655 STM2655 STM2657 STM2657 STM2660 STM2660 STM2661 STM2661 STM2662 STM2662

269

STM2632 STM2634 STM2634 STM2634 STM2634 STM2634 STM2634 STM2636 STM2636 rseC rseC rseB rseB rseA rseA rpoE rpoE nadB nadB yfiC yfiC srmB srmB yfiE yfiE yfiK yfiK yfiD yfiD ung ung yfiF yfiF trxC trxC yfiP yfiP yfiQ yfiQ pssA pssA yfiM yfiM kgtP kgtP STM2655 STM2655 rrlG rrlG clpB clpB yfiH yfiH rluD rluD

3,82 0,69 0,59 1,42 1,97 2,37 2,46 -0,93 0,66 -0,18 -0,27 -1,46 -0,30 0,90 0,72 0,12 1,52 1,44 1,02 0,69 0,95 0,36 1,58 -2,02 -0,87 -0,01 0,63 0,07 1,16 -1,00 0,82 -1,69 -0,62 -1,64 -1,49 -0,98 0,25 -1,79 -0,97 -0,32 -0,10 -2,39 0,26 -0,70 0,04 0,77 0,23 -0,70 -0,97 -1,81 -0,80 -0,31 -0,54 -2,17 -0,91

-0,43 0,94 0,54 1,05 0,59 0,74 1,33 0,25 -0,81 -0,85 -0,49 0,11 0,13 0,67 0,15 2,15 1,97 -0,14 -0,15 -0,44 -0,70 -0,07 -0,57 -0,67 -0,80 -0,42 -0,36 -0,34 -0,20 -0,79 -0,44 -1,15 -1,04 -1,09 -1,42 -0,42 -0,55 -0,10 -0,56 -1,28 -1,37 -1,24 -2,16 -1,54 -1,22 0,06 -0,17 1,05 1,34 0,44 0,81 0,28 0,20 -1,44 -1,51

4,12 0,93 0,67 1,54 0,39 0,80 1,32 -0,10 0,17 -0,26 -1,77 -0,56 -0,71 0,78 1,14 2,42 2,67 -0,83 -0,42 -1,08 0,16 0,84 2,00 -0,88 -1,13 -0,25 0,45 -1,18 -0,02 -0,66 0,13 -1,51 -0,49 -0,32 0,30 -1,09 -0,41 0,33 0,69 -0,50 0,39 -0,41 -0,95 -0,46 0,05 0,78 1,68 1,85 0,33 1,58 1,27 -0,67 -0,54 -1,79 -1,52

Anexo IV

STM2663 STM2663 STM2665 STM2665 STM2667 STM2667 STM2668 STM2668 STM2669 STM2669 STM2670 STM2670 STM2671 STM2671 STM2672 STM2672 STM2673 STM2673 STM2674 STM2674 STM2675 STM2675 STM2676 STM2676 STM2677 STM2677 STM2678 STM2678 STM2679 STM2679 STM2680 STM2680 STM2681 STM2681 STM2683 STM2683 STM2684 STM2684 STM2685 STM2685 STM2686 STM2686 STM2687 STM2687 STM2688 STM2688 STM2690 STM2690 STM2691 STM2691 STM2692 STM2692 STM2695 STM2695 STM2696

yfiO yfiO yfiA yfiA pheA pheA STM2668 STM2668 tyrA tyrA aroF aroF yfiR yfiR yfiN yfiN rplS rplS trmD trmD rimM rimM rpsP rpsP ffh ffh corE corE yfjD yfjD STM2680 STM2680 grpE grpE ppnK ppnK recN recN smpA smpA yfjF yfjF yfjG yfjG smpB smpB STM2690 STM2690 STM2691 STM2691 STM2692 STM2692 STM2695 STM2695 STM2696

-0,54 0,12 1,56 1,92 -0,32 0,02 -1,09 -0,03 -0,82 0,68 -1,04 -0,39 -0,80 -0,60 0,50 1,72 -3,44 -2,54 -1,94 -1,42 -2,49 -1,58 -2,41 -1,79 -0,84 0,11 0,91 0,57 1,74 2,41 0,42 1,39 -0,05 0,42 -0,02 -0,02 0,70 1,08 -1,94 -1,06 -0,04 -0,98 -0,37 0,28 1,25 1,24 -0,25 2,77 -0,15 0,93 -0,63 0,37 -1,12 1,25 -0,99

-0,06 -0,34 3,36 3,21 -0,05 0,22 -0,04 0,36 0,53 0,95 1,75 1,70 0,87 0,34 -0,05 -0,08 -1,24 -0,67 -0,26 -0,12 -0,69 -0,70 -1,46 -1,40 -0,34 0,18 -0,59 -0,46 0,48 0,23 1,04 1,29 0,44 1,15 -0,14 -0,45 0,09 -0,08 0,07 0,46 0,53 0,42 1,09 0,74 0,21 0,03 -0,07 -0,30 0,02 0,20 1,49 2,11 1,80 2,00 -0,23

-0,57 -0,68 4,96 5,62 -0,38 -0,11 -0,49 -0,05 -0,24 0,88 -0,21 -0,65 -0,17 -0,16 1,08 1,71 -2,58 -4,03 -3,39 -3,03 -4,55 -4,08 -4,95 -4,54 -1,98 -1,44 -1,75 -1,17 1,88 2,50 1,37 1,17 -0,74 0,14 -0,81 -0,06 -0,64 0,29 -1,76 -0,22 -0,97 -0,83 -0,18 1,51 1,50 2,04 0,53 1,22 1,31 1,21 2,40 2,95 2,55 2,87 0,33

STM2696 STM2697 STM2697 STM2698 STM2698 STM2699 STM2699 STM2700 STM2700 STM2701 STM2701 STM2704 STM2704 STM2705 STM2705 STM2707 STM2707 STM2708 STM2708 STM2709 STM2709 STM2710 STM2710 STM2711 STM2711 STM2712 STM2712 STM2714 STM2714 STM2715,S STM2715,S STM2716 STM2716 STM2717 STM2717 STM2718 STM2718 STM2719 STM2719 STM2720 STM2720 STM2721 STM2721 STM2722 STM2722 STM2723 STM2723 STM2727 STM2727 STM2729 STM2729 STM2730 STM2730 STM2732 STM2732

270

STM2696 STM2697 STM2697 STM2698 STM2698 STM2699 STM2699 STM2700 STM2700 STM2701 STM2701 STM2704 STM2704 STM2705 STM2705 STM2707 STM2707 STM2708 STM2708 STM2709 STM2709 STM2710 STM2710 STM2711 STM2711 STM2712 STM2712 STM2714 STM2714 STM2715,S STM2715,S STM2716 STM2716 STM2717 STM2717 STM2718 STM2718 STM2719 STM2719 STM2720 STM2720 STM2721 STM2721 STM2722 STM2722 STM2723 STM2723 STM2727 STM2727 STM2729 STM2729 STM2730 STM2730 STM2732 STM2732

0,28 0,72 1,24 0,78 0,15 0,26 1,40 0,09 1,61 -0,17 0,46 0,50 1,88 0,10 2,39 2,37 1,38 -0,22 1,03 3,14 1,38 1,30 1,87 0,59 1,64 -0,19 0,00 -0,96 0,94 1,29 2,14 0,34 0,81 -0,22 0,54 0,37 0,70 0,80 1,67 1,41 2,20 0,12 1,50 0,03 1,19 -0,82 -0,22 1,71 2,15 1,04 4,12 0,24 0,42 0,02 2,13

-0,53 1,56 1,27 -0,75 -1,76 -0,52 -0,35 0,15 -0,41 -0,32 -0,56 0,62 0,58 3,46 2,33 0,13 -1,20 -1,30 -1,58 0,33 -0,78 0,29 -1,49 -0,68 -1,04 -0,06 -0,79 -1,51 -1,72 -1,53 -1,90 -1,32 -0,78 -0,35 -0,90 -3,77 -2,92 1,16 -1,20 -0,29 -1,15 -0,87 -1,14 0,50 -0,14 -0,24 -0,27 -0,45 -1,06 0,04 -0,25 0,97 -1,75 0,07 -0,48

1,20 2,90 2,54 -0,51 -0,05 -0,92 0,29 0,30 0,95 -0,23 0,16 0,14 1,01 -0,13 -0,33 0,30 -1,08 0,02 -0,27 3,30 1,55 1,63 1,56 -0,88 0,51 0,07 -0,69 -1,45 -0,64 1,59 2,86 -0,97 0,11 1,39 0,62 -1,60 0,16 1,56 1,75 0,49 1,46 -0,32 1,01 -0,32 0,04 -0,54 0,22 1,02 1,50 1,04 1,45 0,97 -0,36 -0,70 1,20

Anexo IV

STM2733 STM2733 STM2735 STM2735 STM2736 STM2736 STM2737 STM2737 STM2739 STM2739 STM2740 STM2740 STM2740,1N STM2740,1N STM2741 STM2741 STM2742 STM2742 STM2743 STM2743 STM2744 STM2744 STM2745 STM2745 STM2746 STM2746 STM2747 STM2747 STM2748 STM2748 STM2749 STM2749 STM2750 STM2750 STM2751 STM2751 STM2752 STM2752 STM2753 STM2753 STM2754 STM2754 STM2755 STM2755 STM2756 STM2756 STM2757 STM2757 STM2758 STM2758 STM2759 STM2759 STM2760 STM2760 STM2761

STM2733 STM2733 STM2735 STM2735 STM2736 STM2736 STM2737 STM2737 STM2739 STM2739 STM2740 STM2740 STM2740,1N STM2740,1N STM2741 STM2741 STM2742 STM2742 STM2743 STM2743 STM2744 STM2744 STM2745 STM2745 STM2746 STM2746 STM2747 STM2747 STM2748 STM2748 STM2749 STM2749 STM2750 STM2750 STM2751 STM2751 STM2752 STM2752 STM2753 STM2753 STM2754 STM2754 STM2755 STM2755 STM2756 STM2756 STM2757 STM2757 STM2758 STM2758 STM2759 STM2759 STM2760 STM2760 STM2761

1,08 2,12 2,22 4,05 1,85 0,81 -1,07 0,35 -0,66 -0,07 0,81 1,62 -0,19 1,67 -0,65 0,15 -0,53 0,99 2,24 1,95 0,51 3,28 -0,98 1,19 0,60 0,50 -1,45 -1,32 1,96 -0,37 0,71 3,31 0,43 2,22 2,69 1,65 0,41 1,85 0,86 1,33 -0,38 0,66 0,21 -0,04 -0,16 0,95 -0,32 0,59 0,03 -0,18 -0,81 0,74 0,50 1,86 -0,47

-0,36 -0,26 0,06 -0,06 -0,31 -1,21 -0,66 -1,00 0,22 0,58 1,39 1,10 1,25 0,49 -0,68 -1,14 -0,10 -0,44 0,24 1,22 -1,93 -1,30 -0,60 -1,07 -0,67 -0,67 0,08 -0,35 -0,56 -0,53 2,27 1,49 0,30 -0,65 -1,22 -1,65 -0,26 0,52 0,59 0,60 0,02 -0,87 0,17 -0,63 -0,75 -0,98 -0,79 -1,10 -0,88 -0,40 0,11 -0,94 -0,21 -1,09 0,83

-0,80 1,92 0,64 2,37 0,35 1,37 -1,24 0,18 0,00 0,31 0,98 1,99 -0,20 1,24 -0,01 -0,05 -1,02 0,71 2,15 1,90 0,12 1,87 -0,99 0,99 0,19 2,07 -0,65 -0,82 -0,17 -1,00 0,04 2,86 -0,28 0,26 -0,61 0,64 0,11 0,13 -1,59 0,09 0,69 0,53 -0,97 -0,69 -0,35 1,40 -0,79 0,32 -0,29 0,03 0,19 1,67 -0,37 0,69 0,30

STM2761 STM2762 STM2762 STM2765 STM2765 STM2767 STM2767 STM2768 STM2768 STM2769 STM2769 STM2770 STM2770 STM2772 STM2772 STM2781 STM2781 STM2782 STM2782 STM2783 STM2783 STM2784 STM2784 STM2785 STM2785 STM2786 STM2786 STM2787 STM2787 STM2788 STM2788 STM2789 STM2789 STM2790 STM2790 STM2791 STM2791 STM2792 STM2792 STM2793 STM2793 STM2794 STM2794 STM2795 STM2795 STM2796 STM2796 STM2797 STM2797 STM2798 STM2798 STM2799 STM2799 STM2800 STM2800

271

STM2761 STM2762 STM2762 STM2765 STM2765 STM2767 STM2767 STM2768 STM2768 STM2769 STM2769 fljA fljA hin hin virK virK mig-14 mig-14 nixA nixA tctE tctE tctD tctD STM2786 STM2786 STM2787 STM2787 STM2788 STM2788 STM2789 STM2789 ygaF ygaF gabD gabD gabT gabT gabP gabP ygaE ygaE ygaU ygaU yqaE yqaE STM2797 STM2797 ygaP ygaP stpA stpA STM2800 STM2800

0,22 0,16 1,37 0,74 1,03 -2,24 -2,24 0,30 -0,18 1,69 1,25 -2,82 -2,43 -1,16 -0,37 1,05 2,43 0,80 2,28 -0,15 -0,29 0,28 0,15 0,69 1,58 1,96 2,47 1,54 1,88 -0,54 1,54 0,56 1,63 -1,05 2,45 -0,60 -0,70 -0,28 0,37 1,72 2,70 -1,55 -0,39 0,46 1,61 -0,17 0,52 1,00 1,40 0,38 1,21 -1,82 -1,09 -1,13 -1,80

-1,12 0,66 -0,33 1,26 -0,12 -0,52 -0,61 -0,70 -1,40 -0,59 -0,99 -3,53 -2,58 -1,10 -1,01 2,05 1,83 0,59 -0,46 0,50 -0,09 -0,38 -0,04 0,59 0,45 2,78 3,49 1,53 1,78 0,82 0,76 3,17 3,55 0,17 2,74 1,90 1,77 1,51 3,67 1,00 0,77 -0,10 0,60 2,68 2,99 1,15 1,53 3,22 3,39 2,82 2,80 -0,42 0,02 -0,02 -0,72

0,28 1,46 0,71 2,29 1,46 -1,91 -2,25 -0,02 -0,24 -0,33 0,46 -3,01 -2,05 -1,08 -0,50 -0,33 2,01 -0,75 1,35 1,27 -0,49 0,28 -1,29 -0,17 1,16 2,19 2,24 -0,88 0,38 0,20 -0,37 0,40 1,39 2,01 2,43 0,65 1,27 1,22 1,27 -0,03 1,69 2,12 2,87 4,46 5,50 5,62 5,09 1,62 2,43 -0,14 0,14 -3,15 -2,85 0,47 -0,84

Anexo IV

STM2801 STM2801 STM2802 STM2802 STM2803 STM2803 STM2804 STM2804 STM2805 STM2805 STM2806 STM2806 STM2807 STM2807 STM2808 STM2808 STM2809 STM2809 STM2810 STM2810 STM2811 STM2811 STM2812 STM2812 STM2813 STM2813 STM2814 STM2814 STM2815 STM2815 STM2816 STM2816 STM2817 STM2817 STM2818 STM2818 STM2819 STM2819 STM2820 STM2820 STM2824 STM2823 STM2821 STM2822 STM2824 STM2823 STM2821 STM2822 STM2825 STM2825 STM2826 STM2826 STM2827 STM2827 STM2828

ygaC ygaC ygaM ygaM STM2803 STM2803 STM2804 STM2804 nrdH nrdH nrdI nrdI nrdE nrdE nrdF nrdF proV proV proW proW proX proX STM2812 STM2812 emrR emrR emrA emrA emrB emrB STM2816 STM2816 luxS luxS gshA gshA yqaA yqaA yqaB yqaB csrA csrA alaS alaS recX

-0,88 0,19 -0,05 2,35 0,80 -0,20 -0,12 0,92 0,89 1,95 1,12 2,00 -0,14 0,89 -0,23 0,80 -0,80 -0,75 -0,50 -0,94 0,24 0,55 -0,73 -0,49 -1,61 -0,12 0,22 0,03 -0,11 0,39 1,83 2,77 -1,81 -0,70 -0,77 -0,39 -0,81 0,57 1,12 0,92 -2,83 -2,61 -1,69 -2,01 -1,47 -1,50 -1,25 -1,13 -2,25 -1,29 -2,40 -2,47 -2,66 -1,99 -1,50

0,81 0,40 0,23 0,31 -0,54 0,17 2,08 2,09 4,36 4,68 4,85 4,35 3,45 3,97 3,92 3,97 1,00 1,75 0,54 1,02 1,07 0,17 -0,34 -1,12 -1,10 -1,00 -0,70 -1,24 -0,14 -0,36 -0,17 0,02 0,81 1,28 -0,29 0,20 -0,55 -0,38 0,05 -0,06 -2,43 -2,45 -1,80 -2,14 -2,24 -2,16 -1,99 -2,27 -1,89 -1,46 -1,30 -1,06 -0,43 -0,66 -0,29

0,36 1,03 4,25 4,95 1,97 2,94 -0,28 0,63 0,62 0,66 1,02 1,51 -0,68 0,08 -0,65 -0,13 0,24 -0,21 -0,60 -1,06 -0,40 -2,13 -0,52 -0,70 -3,53 -3,44 -2,40 -2,97 -0,74 -0,03 0,38 1,45 0,60 1,49 -0,81 -0,31 -1,40 -0,24 -1,91 -1,59 -2,60 -2,64 -2,15 -2,74 -2,20 -2,27 -2,05 -2,53 0,02 -0,09 -0,71 -0,43 -2,73 -1,79 -2,58

STM2828 STM2829 STM2829 STM2830 STM2830 STM2831 STM2831 STM2832 STM2832 STM2833 STM2833 STM2834 STM2834 STM2835 STM2835 STM2836 STM2836 STM2837 STM2837 STM2838,S STM2838,S STM2839 STM2839 STM2840 STM2840 STM2841 STM2841 STM2842 STM2842 STM2843 STM2843 STM2844 STM2844 STM2845 STM2845 STM2846 STM2846 STM2847 STM2847 STM2848 STM2848 STM2849 STM2849 STM2850 STM2850 STM2851 STM2851 STM2852 STM2852 STM2853 STM2853 STM2854 STM2854 STM2855 STM2855

272

recX recA recA ygaD ygaD mltB mltB srlA srlA srlE srlE slrB slrB srlD srlD gutM gutM srlR srlR gutQ gutQ ygaA ygaA STM2840 STM2840 ygbD ygbD hypF hypF hydN hydN STM2844 STM2844 hycI hycI hycH hycH hycG hycG hycF hycF hycE hycE hycD hycD hycC hycC hycB hycB hycA hycA hypA hypA hypB hypB

-0,55 0,51 1,20 -0,92 -0,43 -1,80 -1,07 -0,52 -0,75 -0,18 0,32 0,33 1,82 -0,41 0,28 -0,63 1,52 1,14 1,90 0,05 0,57 0,01 0,36 1,40 1,54 -0,08 0,89 1,38 0,33 -0,23 0,45 -0,17 0,03 -0,21 0,85 -0,75 2,02 -0,35 1,17 -0,97 0,75 0,38 1,77 -0,02 0,76 0,85 1,16 -0,57 -1,14 -0,82 0,46 -0,14 1,43 0,03 0,18

-0,13 1,10 1,01 -0,94 -0,02 -0,41 -1,54 0,12 0,02 -0,12 -0,04 -0,75 -0,65 0,21 0,54 0,46 0,72 0,04 -0,16 -0,31 -0,64 -0,72 -0,66 -0,03 -0,33 -0,48 -0,18 -1,23 -1,64 -0,24 -0,66 -1,08 -0,55 -1,17 -0,84 -0,17 -0,62 -0,66 0,49 -1,36 -1,49 0,18 2,25 -1,01 -2,16 -0,62 -0,85 0,11 -1,30 0,14 -0,75 -0,55 -0,77 -0,83 -1,14

-1,86 -1,17 -0,36 -0,83 -0,81 -1,12 -2,81 -1,54 -1,27 -0,39 0,04 -0,56 -0,19 1,33 1,13 -0,90 -0,26 0,63 1,66 -0,51 -0,18 -1,91 -0,56 0,09 1,13 -0,06 0,11 -1,19 -1,67 -1,34 0,25 -0,01 -0,32 -1,01 -0,35 -0,81 0,01 -0,49 1,07 -0,47 -1,35 -0,21 2,27 -0,72 -1,51 -0,63 0,55 0,15 -1,25 -0,67 -0,02 -0,50 1,21 -0,19 -0,15

Anexo IV

STM2856 STM2856 STM2857 STM2857 STM2858 STM2858 STM2902 STM2902 STM2903 STM2903 STM2904 STM2904 STM2905 STM2905 STM2907 STM2907 STM2909 STM2909 STM2910 STM2910 STM2911 STM2911 STM2912 STM2912 STM2913 STM2913 STM2914 STM2914 STM2915 STM2915 STM2916 STM2916 STM2917 STM2917 STM2918 STM2918 STM2919 STM2919 STM2920 STM2920 STM2921 STM2921 STM2922 STM2922 STM2923 STM2923 STM2924 STM2924 STM2925 STM2925 STM2926 STM2926 STM2927 STM2927 STM2928

hypC hypC hypD hypD hypE hypE STM2902 STM2902 STM2903 STM2903 STM2904 STM2904 STM2905 STM2905 pphB pphB mutS mutS STM2910 STM2910 STM2911 STM2911 STM2912 STM2912 STM2913 STM2913 STM2914 STM2914 ygbM ygbM ygbL ygbL ygbK ygbK ygbJ ygbJ ygbI ygbI STM2920 STM2920 STM2921 STM2921 STM2922 STM2922 STM2923 STM2923 rpoS rpoS nlpD nlpD pcm pcm surE surE ygbO

-0,11 -0,68 -1,42 -0,55 -1,00 -1,96 -0,95 -0,06 3,71 3,58 1,15 1,77 0,06 0,45 -0,74 1,66 -1,18 -0,05 0,66 1,27 0,51 1,44 0,15 1,23 -0,14 1,48 -0,50 0,13 0,28 3,15 -0,60 0,95 -0,46 -0,81 -1,18 -0,22 -0,26 0,27 -1,86 -0,86 -1,07 0,58 -0,69 0,40 -0,97 0,27 -1,35 -1,52 0,50 1,37 -1,37 -1,43 -2,95 -2,16 -0,91

-0,09 -0,83 -0,74 -0,63 -0,22 -0,86 0,40 -0,07 2,14 1,35 2,78 2,58 1,96 1,86 -0,53 0,83 -0,12 -1,41 -0,22 -0,71 -0,21 0,72 -1,09 -1,24 -0,85 -0,30 -1,30 -2,47 0,26 -0,42 -0,89 -0,79 -0,59 -0,47 -0,07 -1,27 -0,10 -0,75 0,08 -0,40 -0,08 -0,94 2,08 2,59 2,51 2,38 3,29 3,77 3,70 4,07 -0,30 0,15 -1,54 -1,47 -1,64

-1,63 -0,96 -0,95 -0,46 -0,25 -3,28 -1,50 -0,61 2,80 2,66 0,01 0,92 0,59 -0,09 -0,89 1,24 -0,80 -0,73 1,12 0,99 1,40 0,11 -0,80 -0,21 -1,05 0,55 -0,86 0,59 0,84 0,70 -1,32 -0,27 -0,19 -1,00 -0,67 -0,86 -0,89 0,32 0,21 -0,71 -0,45 -1,01 0,78 1,79 0,66 0,78 3,18 3,38 2,43 3,00 -1,39 -1,65 -2,01 -2,40 -1,07

STM2928 STM2929 STM2929 STM2930 STM2930 STM2931 STM2931 STM2932 STM2932 STM2933 STM2933 STM2934 STM2934 STM2935 STM2935 STM2936 STM2936 STM2937 STM2937 STM2938 STM2938 STM2939 STM2939 STM2940 STM2940 STM2941 STM2941 STM2942 STM2942 STM2943 STM2943 STM2944 STM2944 STM2945 STM2945 STM2946 STM2946 STM2947 STM2947 STM2948 STM2948 STM2949 STM2949 STM2950 STM2950 STM2951 STM2951 STM2953 STM2953 STM2954 STM2954 STM2954,1n STM2954,1n STM2955,S STM2955,S

273

ygbO ispF ispF ispD ispD ftsB ftsB ygbE ygbE cysC cysC cysN cysN cysD cysD iap iap ygbF ygbF STM2938 STM2938 ygcH ygcH STM2940 STM2940 yghJ yghJ STM2942 STM2942 STM2943 STM2943 ygcB ygcB sopD sopD cysH cysH cysI cysI cysJ cysJ ptpS ptpS STM2950 STM2950 ygcF ygcF pyrG pyrG mazG mazG STM2954,1n STM2954,1n STM2955,S STM2955,S

-0,62 -2,51 -1,50 -2,68 -1,09 -0,23 1,12 -1,86 -1,08 -1,70 -0,15 -0,15 0,85 2,08 3,36 0,16 2,07 -0,12 -0,06 0,73 1,10 -0,92 1,11 -0,67 -0,16 1,05 0,27 0,13 0,88 2,69 2,93 -0,03 0,64 0,16 1,20 0,48 1,92 0,40 1,66 0,46 0,70 -0,87 -0,09 -0,59 0,67 -1,30 -1,04 -3,17 -2,58 1,79 2,36 0,25 -0,18 -0,20 0,59

-1,68 -1,83 -1,44 -1,38 -1,98 -1,32 -1,15 -1,18 -1,07 0,41 0,81 1,86 1,80 2,90 2,22 -1,07 -1,94 0,30 0,16 0,53 -0,57 -0,39 -0,27 0,15 -0,74 -0,22 -0,14 -0,32 -0,44 1,97 1,94 -0,29 -0,55 -0,26 -0,11 1,12 0,19 0,70 0,61 1,36 0,87 -1,13 -0,54 -0,41 -0,97 -0,60 -0,80 -0,58 -0,35 -0,81 -0,44 0,55 0,28 0,71 0,68

-0,50 -2,64 -2,73 -3,25 -4,51 -4,12 -2,97 -1,85 -0,99 -1,68 -0,95 -0,61 0,93 1,60 0,31 -0,38 0,69 -0,79 0,15 -0,37 -0,50 -0,89 0,32 -0,85 -0,22 -0,75 -0,12 -1,48 -0,21 4,83 4,84 -1,20 -0,24 0,61 0,91 0,33 0,87 -1,53 -0,58 0,15 1,11 -1,91 -1,22 -1,25 -0,90 -0,95 -0,77 -1,17 -0,75 1,82 2,44 -0,15 -0,54 0,12 0,87

Anexo IV

STM2956 STM2956 STM2957 STM2957 STM2958 STM2958 STM2959 STM2959 STM2960 STM2960 STM2961 STM2961 STM2962 STM2962 STM2963 STM2963 STM2964 STM2964 STM2965 STM2965 STM2966 STM2966 STM2967 STM2967 STM2968 STM2968 STM2969 STM2969 STM2970 STM2970 STM2971 STM2971 STM2972 STM2972 STM2973 STM2973 STM2974 STM2974 STM2976 STM2976 STM2977 STM2977 STM2978 STM2978 STM2979 STM2979 STM2980 STM2980 STM2981 STM2981 STM2982 STM2982 STM2983 STM2983 STM2984

relA relA rumA rumA barA barA STM2959 STM2959 gudD gudD ygcY ygcY gudT gudT STM2963 STM2963 yqcB yqcB yqcC yqcC csrB csrB syd syd yqcD yqcD ygdH ygdH sdaC sdaC sdaB sdaB xni xni fucO fucO fucA fucA fucI fucI fucK fucK fucU fucU fucR fucR ygdE ygdE ygdD ygdD gcvA gcvA ygdI ygdI csdA

0,45 0,90 -1,62 -1,00 -1,04 0,95 0,06 0,90 0,25 0,57 0,20 1,36 -1,31 -1,05 0,63 1,15 0,29 1,79 -1,02 0,02 -0,84 1,37 -1,24 -0,44 -1,37 -1,27 -1,66 -1,51 -3,38 -2,93 -0,88 -0,62 -0,21 -0,58 -0,23 0,50 -0,93 -0,74 -0,30 0,39 -0,56 1,07 -0,25 0,19 2,01 -0,85 -0,92 0,82 2,36 3,08 1,40 2,36 0,93 1,88 -1,19

-0,63 -0,91 -0,70 -0,55 0,45 0,50 0,31 -0,64 0,95 0,24 0,43 0,47 -0,48 -0,22 -0,03 -0,71 0,01 -0,24 0,36 0,40 0,24 0,83 -0,42 0,16 -1,60 -1,55 -1,39 -1,34 -1,96 -1,72 -0,83 -0,78 -0,01 -1,02 -1,06 -0,63 -0,26 -0,26 0,10 0,11 0,66 0,75 0,51 0,28 -0,96 -1,21 -0,30 -0,09 -1,17 -1,43 -1,77 -2,23 1,36 1,17 -0,58

-1,68 -0,67 -2,10 -1,98 -0,48 0,62 -0,19 -0,26 -0,15 1,05 0,05 0,57 -1,20 -0,91 -0,87 0,28 0,05 0,81 1,10 1,42 3,27 4,24 1,32 0,68 -0,89 -0,02 -1,42 -1,39 -3,02 -2,72 -2,16 -0,60 0,80 -1,20 -1,38 -0,56 0,25 0,04 -0,03 0,98 -2,13 0,24 -0,08 -0,05 0,03 -0,58 -1,23 -1,44 -0,78 -0,70 0,23 1,37 4,43 5,30 -0,12

STM2984 STM2985 STM2985 STM2986,Sc STM2986,Sc STM2987 STM2987 STM2988 STM2988 STM2991 STM2991 STM2992 STM2992 STM2993 STM2993 STM2994 STM2994 STM2995 STM2995 STM2996 STM2996 STM2997 STM2997 STM2998 STM2998 STM2999 STM2999 STM3000 STM3000 STM3001 STM3001 STM3002 STM3002 STM3003 STM3003 STM3004 STM3004 STM3005 STM3005 STM3006 STM3006 STM3007 STM3007 STM3009 STM3009 STM3010 STM3010 STM3011 STM3011 STM3012 STM3012 STM3013 STM3013 STM3014 STM3014

274

csdA ygdK ygdK STM2986,Sc STM2986,Sc ygdL ygdL mltA mltA amiC amiC argA argA recD recD recB recB ptr ptr recC recC ppdC ppdC ygdB ygdB ppdB ppdB ppdA ppdA thyA thyA lgt lgt ptsP ptsP ygdP ygdP mutH mutH ygdQ ygdQ ygdR ygdR ygeD ygeD aas aas galR galR STM3012 STM3012 lysA lysA lysR lysR

-1,09 -0,34 0,54 -0,36 0,61 -1,47 -0,05 -1,96 -0,43 -0,99 0,27 0,13 0,10 0,61 0,74 -0,93 0,67 -1,03 -0,74 -0,86 0,42 -0,12 1,44 -0,79 0,72 -1,12 0,72 -0,26 0,29 -1,46 -1,09 0,28 -0,78 -1,56 0,08 -0,52 -0,17 -0,99 -0,23 -0,94 -1,21 0,22 1,15 -0,87 0,81 -1,45 -0,40 -1,20 -0,54 -1,02 0,08 -0,70 0,76 3,19 0,70

-1,22 -0,13 -1,30 -0,73 -0,88 -0,24 -1,06 -0,63 -1,31 0,54 0,04 1,41 1,07 -0,37 -0,94 -0,82 -1,18 -0,76 -1,19 0,09 -0,29 -0,82 -0,78 -0,97 -0,35 0,37 -1,37 -1,32 -1,96 -1,83 -1,89 -0,98 -1,16 -0,49 -0,65 -0,23 -0,39 -0,73 -0,73 -0,99 -1,32 0,39 -0,03 -0,63 -0,30 -1,44 -0,69 -0,89 0,15 1,06 0,59 0,18 -0,23 -0,53 -0,48

-0,87 -0,81 -1,31 0,40 -0,03 -1,65 -1,24 -1,09 -0,88 1,09 1,61 1,39 0,01 -0,71 0,05 -1,65 -2,22 0,16 -1,23 -0,73 -0,06 0,16 0,24 0,35 -0,09 -0,75 -1,89 -0,29 -1,15 -2,33 -3,07 -2,54 -1,72 -2,41 -1,42 -1,41 -0,19 -1,73 -1,25 0,73 -1,57 1,78 2,56 -0,74 0,50 -2,16 -1,32 -0,51 0,18 0,23 -0,29 -0,67 -0,08 0,21 0,09

Anexo IV

STM3015 STM3015 STM3016 STM3016 STM3017 STM3017 STM3018 STM3018 STM3019 STM3019 STM3020 STM3020 STM3021 STM3021 STM3022 STM3022 STM3023 STM3023 STM3024 STM3024 STM3025 STM3025 STM3025,1N STM3025,1N STM3026 STM3026 STM3030 STM3030 STM3031 STM3031 STM3033 STM3033 STM3036 STM3036 STM3037 STM3037 STM3038 STM3038 STM3039 STM3039 STM3040 STM3040 STM3041c STM3041c STM3042 STM3042 STM3043 STM3043 STM3044 STM3044 STM3045 STM3045 STM3046 STM3046 STM3047

ygeA ygeA araE araE kduD kduD kduI kduI yqeF yqeF STM3020 STM3020 STM3021 STM3021 STM3022 STM3022 yohL yohL yohM yohM STM3025 STM3025 STM3025,1N STM3025,1N STM3026 STM3026 STM3030 STM3030 STM3031 STM3031 STM3033 STM3033 STM3036 STM3036 glyU glyU STM3038 STM3038 idi idi lysS lysS prfB prfB recJ recJ dsbC dsbC xerD xerD fldB fldB ygfX ygfX ygfY

1,54 0,46 0,79 1,46 -0,30 0,25 0,56 0,47 0,10 0,69 1,08 1,31 -0,28 0,01 -0,96 -0,79 0,08 0,50 -0,39 -0,95 0,30 1,02 1,25 2,99 0,77 1,14 3,00 0,97 0,84 0,00 -0,04 -0,05 -0,51 0,58 -2,17 -2,64 2,85 1,92 -0,88 -0,42 -1,49 -0,88 -2,66 -0,73 -1,34 -0,73 -0,45 -0,06 -0,93 -0,32 -1,06 -0,98 -0,88 -0,75 -1,19

0,13 -0,35 0,65 0,96 -1,56 -0,77 -0,35 -0,92 -0,89 -1,19 -0,05 0,16 -1,82 -1,93 -0,71 -0,96 0,81 0,65 1,02 -0,60 -0,59 0,61 1,24 0,82 -0,08 0,22 -0,18 -1,70 0,46 -0,08 0,57 0,77 0,11 0,40 -2,32 -2,48 -0,63 -1,12 -0,40 -0,34 -0,98 -0,52 -0,65 -0,71 -0,84 -0,35 0,28 -0,01 -0,07 0,00 -0,23 -0,45 0,09 -0,10 0,01

0,72 -0,59 0,62 1,66 -0,57 0,12 0,82 1,83 -0,32 0,20 0,93 0,63 -1,29 -0,86 -1,98 -2,47 -0,74 0,64 1,73 -0,06 -0,68 -0,03 2,05 4,28 -0,41 -0,24 0,66 -0,61 -0,64 -0,31 -2,02 -1,56 2,21 3,75 3,24 3,16 1,10 1,08 -1,19 -0,69 -1,67 -1,65 -4,21 -3,44 -2,20 -1,51 -0,86 0,91 -1,52 -1,21 -0,53 -1,17 -0,91 -1,02 -1,09

STM3047 STM3048 STM3048 STM3049 STM3049 STM3050 STM3050 STM3051 STM3051 STM3052 STM3052 STM3053 STM3053 STM3054 STM3054 STM3055 STM3055 STM3056 STM3056 STM3057 STM3057 STM3058 STM3058 STM3059,S STM3059,S STM3060 STM3060 STM3061 STM3061 STM3062 STM3062 STM3064 STM3064 STM3065 STM3065 STM3066 STM3066 STM3067 STM3067 STM3070 STM3070 STM3071 STM3071 STM3072 STM3072 STM3073 STM3073 STM3074 STM3074 STM3075 STM3075 STM3077 STM3077 STM3078 STM3078

275

ygfY ygfZ ygfZ yqfA yqfA yqfB yqfB bglA bglA STM3052 STM3052 gcvP gcvP gcvH gcvH gcvT gcvT visC visC ubiH ubiH pepP pepP ygfB ygfB ygfE ygfE ygfA ygfA serA serA iciA iciA yggE yggE yggA yggA yggB yggB epd epd STM3071 STM3071 STM3072 STM3072 STM3073 STM3073 STM3074 STM3074 STM3075 STM3075 yggG yggG speB speB

-0,19 -0,95 -0,68 -0,78 -0,08 -0,35 0,69 0,60 0,25 2,19 3,94 -1,50 0,06 -2,37 -1,80 -2,13 -2,76 -0,50 0,57 -1,87 -1,65 1,33 1,10 -0,47 0,55 2,57 3,20 -1,01 0,30 0,38 2,01 -0,57 -0,09 0,12 1,00 -1,65 -0,71 -1,17 -1,11 -2,71 -1,49 -1,15 -0,17 -0,78 -0,08 -0,22 0,75 0,58 0,43 -1,29 -0,51 -1,42 0,25 -1,24 -0,37

-0,02 -0,18 -0,48 0,64 0,28 1,24 0,97 -0,49 0,01 0,79 0,69 0,89 1,16 0,59 1,38 0,44 0,66 -0,14 0,14 -0,82 -0,92 0,37 0,35 -0,18 0,61 0,19 0,28 -0,15 -0,19 0,75 0,63 -0,55 -0,86 -0,05 -0,33 -0,37 -0,83 0,53 0,23 -0,34 -0,30 -1,60 -1,99 -1,64 -1,04 -1,00 -0,91 -0,90 -0,53 -0,93 -0,67 -1,21 -1,66 -1,30 -2,21

-1,24 -0,65 -0,73 -1,01 -0,42 -0,15 0,71 -0,54 -1,10 2,84 3,24 -0,43 0,34 -2,23 -3,05 -1,27 -2,62 -0,76 0,23 -1,09 -1,52 -1,59 -1,15 -1,48 -0,92 0,80 1,78 0,25 0,75 -1,21 0,09 -0,27 0,61 0,41 0,85 -0,66 -0,60 -1,15 -0,73 -0,32 0,10 0,03 -0,40 -1,14 -0,75 -0,89 -0,15 -0,72 -0,71 -0,93 -0,86 -1,78 -1,38 -1,77 -1,59

Anexo IV

STM3079,S STM3079,S STM3080 STM3080 STM3081 STM3081 STM3082 STM3082 STM3083 STM3083 STM3084,S STM3084,S STM3085 STM3085 STM3086 STM3086 STM3087 STM3087 STM3089 STM3089 STM3090 STM3090 STM3091 STM3091 STM3092 STM3092 STM3092 STM3092 STM3093 STM3093 STM3094 STM3094 STM3095 STM3095 STM3096 STM3096 STM3097 STM3097 STM3098 STM3098 STM3099 STM3099 STM3100 STM3100 STM3101 STM3101 STM3102 STM3102 STM3103 STM3103 STM3104 STM3104 STM3105 STM3105 STM3106

STM3079,S STM3079,S STM3080 STM3080 STM3081 STM3081 STM3082 STM3082 STM3083 STM3083 STM3084,S STM3084,S STM3085 STM3085 speA speA yqgB yqgB yqgD yqgD metK metK galP galP sprT sprT sprT sprT endA endA yggJ yggJ gshB gshB yqgE yqgE yqgF yqgF STM3098 STM3098 yggR yggR yggS yggS yggT yggT yggU yggU yggV yggV yggW yggW yggM yggM ansB

-1,63 -1,36 -0,68 0,30 -0,91 0,39 2,24 1,69 4,81 8,76 -0,94 0,16 -0,88 0,24 -1,27 -1,61 -2,91 -2,57 -2,51 0,07 -2,18 -1,72 -0,48 0,65 -0,91 -1,39 -0,16 -2,50 -3,68 -3,15 -2,42 -1,87 -2,50 -1,77 -0,76 -1,31 -0,97 -1,77 -0,35 0,59 0,05 0,84 -2,78 -1,84 -0,52 0,34 -1,56 -0,35 -1,79 -1,19 -0,90 -1,00 -0,98 -0,89 2,14

-1,09 -1,15 -0,50 -0,79 0,42 0,06 0,59 0,27 0,93 3,00 0,69 -0,44 -0,90 -0,63 -1,03 -1,10 -2,37 -2,19 -1,37 -1,56 -0,79 -0,44 -0,53 -0,40 -1,12 -0,98 -0,88 -0,93 -2,79 -3,23 -1,37 -1,50 -2,18 -0,70 0,67 0,34 0,75 -0,39 0,33 -0,53 -0,78 -1,64 -0,54 -0,67 -0,33 -0,24 -0,16 -0,14 -1,02 -1,18 -0,32 -0,97 0,42 0,12 0,19

-1,69 -1,45 -0,50 0,55 0,21 0,63 1,99 1,70 2,30 6,96 0,19 -1,15 -0,68 -0,27 0,34 -1,40 -2,75 -2,52 -1,94 -2,11 -3,16 -2,98 -0,54 0,19 -2,13 -0,97 -1,28 -2,43 -3,48 -4,28 -2,78 -2,03 -2,40 -2,55 -2,06 -2,03 -1,78 -3,38 -0,18 -0,83 -0,69 0,11 -2,39 -2,28 -1,97 -2,93 -1,57 -1,95 -3,42 -4,05 -1,03 -0,87 1,99 2,50 1,63

STM3106 STM3107 STM3107 STM3108 STM3108 STM3109 STM3109 STM3110 STM3110 STM3111 STM3111 STM3112 STM3112 STM3113 STM3113 STM3114 STM3114 STM3115 STM3115 STM3116 STM4321 STM3116 STM4321 STM3118 STM3118 STM3119 STM3119 STM3120 STM3120 STM3121 STM3121 STM3122 STM3122 STM3123 STM3123 STM3124 STM3124 STM3125 STM3125 STM3126 STM3126 STM3127 STM3127 STM3128 STM3128 STM3129 STM3129 STM3131 STM3131 STM3132 STM3132 STM3133 STM3133 STM3134 STM3134

276

ansB yggN yggN yggL yggL yggH yggH mutY mutY yggX yggX mltC mltC nupG nupG speC speC yqgA yqgA pheV pheR pheV pheR STM3118 STM3118 STM3119 STM3119 STM3120 STM3120 STM3121 STM3121 STM3122 STM3122 STM3123 STM3123 STM3124 STM3124 STM3125 STM3125 STM3126 STM3126 STM3127 STM3127 STM3128 STM3128 STM3129 STM3129 STM3131 STM3131 STM3132 STM3132 STM3133 STM3133 STM3134 STM3134

3,83 -0,40 -0,47 -3,09 -1,48 -2,47 -1,86 0,00 -0,21 -1,39 -0,46 -1,13 0,02 -0,40 0,36 -0,68 1,35 0,28 0,87 -1,39 -1,67 -1,62 -0,67 -0,57 1,28 0,39 0,17 -0,24 -0,45 2,96 1,85 -0,71 0,53 0,37 1,21 0,18 0,35 0,90 1,23 1,88 2,00 -0,76 -0,51 0,85 -1,64 -0,31 -0,15 1,74 2,38 0,06 0,70 2,33 2,66 0,77 1,96

0,06 0,65 0,51 -0,33 -0,39 -0,47 -0,38 -2,31 -2,99 0,39 0,33 -1,19 -0,91 -1,63 -1,90 -0,28 -0,83 -0,55 -0,51 -0,93 0,06 -1,62 -1,65 0,67 0,56 1,22 -0,19 0,64 -0,44 -0,77 -0,77 -0,25 0,27 0,04 -0,46 -0,53 -0,58 -0,19 -0,08 1,14 0,72 0,37 -0,18 0,95 0,57 -0,34 -0,15 -0,21 -0,03 -1,75 -1,13 0,12 0,86 0,36 1,20

2,98 0,96 -0,04 -1,98 -1,83 -1,84 -1,30 -0,38 0,23 -1,46 -0,71 1,20 -0,37 -1,33 -0,81 0,19 1,17 -1,21 0,44 4,24 3,37 4,47 3,61 -0,13 1,07 0,11 -1,99 0,49 -0,86 0,13 0,01 -0,72 1,78 -0,26 1,12 0,33 -0,31 0,70 0,24 2,51 2,44 0,15 0,13 1,58 -0,35 -0,30 -0,49 0,16 0,74 0,04 0,41 4,01 3,21 -0,36 0,49

Anexo IV

STM3135 STM3135 STM3136 STM3136 STM3137 STM3137 STM3139 STM3139 STM3140 STM3140 STM3141 STM3141 STM3142 STM3142 STM3143 STM3143 STM3144 STM3144 STM3145 STM3145 STM3146 STM3146 STM3147 STM3147 STM3148 STM3148 STM3149 STM3149 STM3150 STM3150 STM3151 STM3151 STM3153 STM3153 STM3154 STM3154 STM3155 STM3155 STM3156 STM3156 STM3157 STM3157 STM3158 STM3158 STM3159 STM3159 STM3160 STM3160 STM3161 STM3161 STM3162 STM3162 STM3163 STM3163 STM3164

STM3135 STM3135 STM3136 STM3136 STM3137 STM3137 gsp gsp yghU yghU STM3141 STM3141 STM3142 STM3142 hybG hybG hypA hypA hybE hybE hybD hybD hybC hybC hybB hybB hybA hybA hypO hypO yghW yghW yqhA yqhA STM3154 STM3154 STM3155 STM3155 STM3156 STM3156 yghA yghA exbD exbD exbB exbB STM3160 STM3160 metC metC yghB yghB yqhC yqhC yqhD

0,22 1,77 0,41 1,89 -0,04 0,10 1,50 1,63 0,29 1,38 0,45 1,31 0,11 1,61 0,14 1,20 -1,57 0,09 -1,30 -1,18 -1,23 -0,72 -0,15 -0,34 0,00 0,45 -0,71 -0,68 0,51 0,14 -1,98 -2,00 -1,52 -0,75 -0,63 0,34 1,24 1,83 -0,84 -0,57 1,10 1,50 -1,53 0,02 -0,68 0,44 -1,01 -0,80 -0,32 0,49 0,62 0,89 0,86 0,52 -1,13

0,28 1,18 0,93 0,88 0,28 0,30 -1,79 -2,01 0,63 0,83 1,31 1,42 1,68 1,74 -0,13 -0,56 -0,41 -1,14 -1,13 -1,63 -0,80 -1,16 -1,51 -1,49 -0,68 -0,96 -0,81 -0,81 -1,00 -1,30 -2,34 -1,31 -0,65 -0,54 0,16 0,37 -0,11 -1,21 -1,31 -1,44 0,11 0,32 0,94 0,76 1,04 1,50 0,59 0,70 0,05 0,11 0,36 -0,17 0,13 0,62 -1,16

0,32 0,83 0,10 1,43 -1,03 -0,01 -0,37 0,64 -0,06 0,84 0,36 1,66 -0,22 0,96 -1,27 -0,55 -0,81 -1,09 -1,50 -1,96 -1,50 -1,20 -0,87 -0,23 -0,76 0,06 -1,42 -0,67 -1,22 -0,46 -1,84 -2,01 -1,27 -1,24 -1,18 -0,25 1,18 0,78 -0,20 0,39 1,62 1,99 0,02 0,44 -1,67 -1,18 0,99 -0,64 -0,66 0,68 -0,45 -0,25 0,06 -0,58 -0,70

STM3164 STM3165 STM3165 STM3166,S STM3166,S STM3167 STM3167 STM3168 STM3168 STM3169 STM3169 STM3170 STM3170 STM3171 STM3171 STM3172 STM3172 STM3173 STM3173 STM3174 STM3174 STM3175 STM3175 STM3176 STM3176 STM3177 STM3177 STM3178 STM3178 STM3179 STM3179 STM3180 STM3180 STM3181 STM3181 STM3182 STM3182 STM3183 STM3183 STM3184 STM3184 STM3185 STM3185 STM3186 STM3186 STM3187 STM3187 STM3188 STM3188 STM3189 STM3189 STM3190 STM3190 STM3191 STM3191

277

yqhD yqhE yqhE STM3166,S STM3166,S STM3167 STM3167 ygiR ygiR STM3169 STM3169 STM3170 STM3170 ygiK ygiK sufI sufI plsC plsC parC parC STM3175 STM3175 ygiW ygiW ygiX ygiX ygiY ygiY mdaB mdaB ygiN ygiN parE parE yqiA yqiA icc icc yqiB yqiB yqiE yqiE tolC tolC ygiB ygiB ygiC ygiC ygiD ygiD ygiE ygiE STM3191 STM3191

-0,36 -0,38 -0,14 0,17 0,96 -0,28 0,34 -1,43 -0,33 -0,81 0,82 0,77 3,02 -0,33 0,03 -1,20 -0,67 0,77 0,72 -3,12 -0,94 -0,42 0,01 -0,69 -0,66 -0,81 -1,49 -1,11 0,36 -2,22 -2,18 -1,35 -0,26 -1,08 0,42 -2,25 -1,63 -2,01 -1,98 -1,92 -0,48 -0,29 0,17 0,77 0,89 -2,71 -1,12 -0,64 1,18 0,77 1,11 -0,88 0,66 0,60 2,33

-1,52 -0,44 -1,12 -1,51 -0,45 0,47 0,57 -2,20 -3,95 -0,64 -0,11 -0,78 -0,64 -1,22 -1,21 -0,88 -0,65 -0,98 -0,72 -2,19 -1,60 -1,26 -0,97 0,40 0,09 -0,38 -0,75 0,26 -0,36 -0,13 -0,82 -0,34 -0,42 -0,85 -0,73 -0,71 -0,60 -0,62 -0,74 -0,15 0,22 -0,10 0,16 0,00 0,43 0,21 -0,06 0,08 0,21 0,47 -0,31 0,18 0,33 0,44 0,24

0,59 1,14 2,17 -0,42 0,31 -0,56 0,65 -1,27 -1,57 -0,47 1,64 0,75 1,37 0,02 0,14 -1,56 -1,46 0,29 0,45 -2,96 -2,56 -1,40 -1,55 0,08 0,68 0,16 -1,21 0,14 -0,04 -1,00 -0,32 -1,46 -2,36 -1,37 -0,65 -1,68 -1,88 -3,15 -2,75 -0,82 -1,15 -1,22 -0,10 -0,40 -0,44 0,35 0,84 -0,57 0,93 0,50 1,16 -0,82 0,08 0,17 0,13

Anexo IV

STM3193 STM3193 STM3194 STM3194 STM3195 STM3195 STM3196,S STM3196,S STM3197 STM3197 STM3198 STM3198 STM3199 STM3199 STM3200 STM3200 STM3201 STM3201 STM3202 STM3202 STM3203 STM3203 STM3204 STM3204 STM3205 STM3205 STM3206 STM3206 STM3207 STM3207 STM3208 STM3208 STM3209 STM3209 STM3210 STM3210 STM3211,S STM3211,S STM3212 STM3212 STM3213 STM3213 STM3214 STM3214 STM3215 STM3215 STM3218 STM3218 STM3219 STM3219 STM3220 STM3220 STM3221 STM3221 STM3222

STM3193 STM3193 STM3194 STM3194 ribB ribB yqiC yqiC glgS glgS STM3198 STM3198 yqiK yqiK rfaE rfaE glnE glnE ygiF ygiF ygiM ygiM cca cca uppP uppP folB folB ygiH ygiH gcp gcp rpsU rpsU dnaG dnaG rpoD rpoD mug mug ileX ileX yqjH yqjH yqjI yqjI oat oat fadH fadH ygjO ygjO ygjP ygjP ygjQ

-0,64 0,19 -0,66 0,20 -0,98 -1,23 0,53 1,68 -0,47 1,74 -0,71 1,16 -2,23 -1,70 -0,91 -1,16 -1,46 -1,16 -1,22 1,30 0,51 0,89 -0,44 -0,33 0,05 0,56 -0,70 0,09 -0,32 0,44 -0,83 0,10 -3,12 -2,41 -0,76 -0,35 -0,21 0,49 0,22 0,35 -0,51 -1,10 -1,00 -0,01 -0,94 -0,10 0,79 0,05 -0,18 0,76 -0,85 0,19 -0,90 0,50 0,20

0,50 -0,24 -1,03 -1,04 -0,14 -0,48 0,93 0,71 0,05 -0,36 -0,33 -0,92 -0,76 -0,78 -0,59 -1,03 -1,04 -1,02 -0,68 -1,01 0,48 0,18 -0,18 -0,26 -0,50 -0,70 -1,28 -1,10 0,09 -0,23 -0,60 -0,98 -1,11 -1,15 -0,33 0,25 0,61 0,81 0,74 0,87 -1,14 -1,08 -0,15 -0,19 -1,44 -1,43 0,16 0,31 -0,42 -1,03 -0,43 -0,64 -0,85 -0,36 -0,89

0,47 0,59 -1,10 1,52 0,46 0,25 -0,04 1,20 -0,20 1,11 -1,07 1,10 -0,93 -1,37 -0,62 -0,96 -1,38 -1,51 -1,43 -0,40 -1,31 -0,52 -0,23 -0,39 -0,09 0,76 -1,29 -2,19 1,10 1,15 -1,40 0,61 -4,13 -3,91 -1,04 -0,53 -0,85 -0,31 1,49 1,23 0,60 0,72 -0,83 0,03 -2,08 -1,56 2,65 2,30 -2,33 -0,65 -1,14 -0,51 -1,48 -0,41 -0,60

STM3222 STM3223 STM3223 STM3224 STM3224 STM3225 STM3225 STM3226 STM3226 STM3227 STM3227 STM3228 STM3228 STM3229 STM3229 STM3230 STM3230 STM3231 STM3231 STM3232 STM3232 STM3233 STM3233 STM3234 STM3234 STM3235 STM3235 STM3236 STM3236 STM3237 STM3237 STM3238 STM3238 STM3239 STM3239 STM3240 STM3240 STM3241 STM3241 STM3242 STM3242 STM3243 STM3243 STM3244 STM3244 STM3245 STM3245 STM3247 STM3247 STM3248 STM3248 STM3249 STM3249 STM3250 STM3250

278

ygjQ ygjR ygjR ygjT ygjT ygjU ygjU yqjA yqjA yqjB yqjB yqjC yqjC yqjD yqjD yqjE yqjE yqjK yqjK yqjF yqjF yqjG yqjG yhaH yhaH yhaJ yhaJ yhaK yhaK yhaL yhaL yhaN yhaN yhaO yhaO tdcG tdcG tdcE tdcE tdcD tdcD tdcC tdcC tdcB tdcB tdcA tdcA garK garK garR garR garL garL garD garD

1,63 0,48 1,21 0,53 0,29 -0,69 -0,96 -1,03 0,89 -1,25 0,18 0,65 0,91 -0,68 0,41 -1,43 -0,81 -0,94 -0,32 -0,43 3,40 0,07 -0,32 -1,34 -0,51 -0,42 0,76 0,27 0,89 1,99 2,05 -0,44 -0,17 -0,94 1,63 -0,32 1,45 -1,12 -0,26 0,36 1,00 0,59 0,67 0,32 1,10 -0,35 1,05 0,53 1,99 -0,46 0,63 0,04 0,65 -0,72 1,57

-1,50 0,11 0,61 3,03 3,02 0,16 0,71 -1,21 -1,22 -0,11 -0,36 2,00 2,01 2,11 2,14 2,14 2,46 2,47 2,75 0,12 -0,10 0,24 -0,27 -0,35 -0,68 0,98 0,73 -0,11 0,15 0,13 -0,07 0,03 -0,48 -0,76 -1,24 -1,30 -1,27 -0,75 -0,88 -1,13 -0,53 -0,17 0,16 -0,06 -0,36 -1,59 -0,58 1,49 1,83 0,12 0,13 0,33 0,30 -0,28 -0,34

0,75 -0,19 1,74 0,36 1,27 -0,01 -0,02 -1,28 -0,36 -0,13 0,47 3,55 4,17 1,15 1,95 0,22 0,91 0,53 0,42 0,27 1,69 1,15 1,39 -0,44 -1,03 0,46 0,32 -0,67 0,33 0,97 1,62 -1,02 -0,66 -1,42 0,38 -0,36 -1,25 -0,20 0,12 0,11 0,26 0,91 0,06 0,11 -0,11 -1,15 0,07 -1,12 -0,52 -0,34 -0,83 -0,83 0,35 -0,95 0,20

Anexo IV

STM3251 STM3251 STM3252 STM3252 STM3253 STM3253 STM3254 STM3254 STM3255 STM3255 STM3256 STM3256 STM3257 STM3257 STM3258 STM3258 STM3259 STM3259 STM3260 STM3260 STM3261 STM3261 STM3262 STM3262 STM3263 STM3263 STM3264 STM3264 STM3265 STM3265 STM3266 STM3266 STM3267 STM3267 STM3268 STM3268 STM3269 STM3269 STM3270 STM3270 STM3271 STM3271 STM3272 STM3272 STM3273 STM3273 STM3274 STM3274 STM3275,S STM3275,S STM3276 STM3276 STM3277 STM3277 STM3278

STM3251 STM3251 agaR agaR STM3253 STM3253 STM3254 STM3254 STM3255 STM3255 STM3256 STM3256 STM3257 STM3257 STM3258 STM3258 STM3259 STM3259 STM3260 STM3260 STM3261 STM3261 STM3262 STM3262 yraL yraL yraM yraM yraN yraN yraO yraO yraP yraP yraR yraR yhbO yhbO yhbP yhbP yhbQ yhbQ yhbS yhbS yhbT yhbT yhbU yhbU yhbV yhbV yhbW yhbW STM3277 STM3277 STM3278

-0,79 0,78 0,12 0,67 1,68 2,53 -0,39 0,62 0,66 1,88 3,34 1,54 -1,59 0,17 0,52 1,46 -0,01 -0,08 0,06 -0,64 -1,24 1,83 0,11 0,60 0,23 1,38 -1,37 -0,24 -1,48 -0,63 -0,60 0,53 -0,10 0,43 -0,33 0,54 -0,51 0,54 0,06 0,91 -1,01 -0,94 -0,96 -0,63 -0,84 -0,86 -0,86 -0,12 0,32 0,20 -0,73 0,28 0,61 1,21 -1,08

0,16 -0,66 0,14 0,00 1,10 0,02 -1,13 -0,16 1,60 -0,35 -0,31 -0,61 0,51 -1,24 0,21 -1,45 0,20 -0,30 -0,72 -1,50 -0,80 -0,36 -0,37 -0,39 -0,39 -0,40 -0,23 -0,58 0,01 -0,50 -0,24 0,11 -0,19 -0,05 0,07 0,47 0,03 0,56 0,45 0,38 -0,15 -0,59 -0,86 -1,10 0,53 -0,04 -0,83 -1,77 -0,51 -2,11 -0,46 0,30 1,26 -0,40 -0,32

-0,40 0,09 2,06 1,90 1,75 2,46 -0,60 0,13 0,25 0,31 2,09 0,98 -0,42 -0,58 -0,42 -1,36 1,20 0,93 0,35 0,49 -1,02 -0,65 0,97 0,68 0,14 0,00 -1,71 -0,91 -1,32 -0,64 -1,47 0,08 -0,79 -0,24 0,89 0,71 1,50 2,37 1,39 2,14 -0,30 -1,21 -1,39 -0,81 0,54 0,07 -0,44 -0,23 -0,79 0,92 0,53 0,98 0,44 1,46 -0,38

STM3278 STM3279 STM3279 STM3280,S STM3280,S STM3281 STM3281 STM3282 STM3282 STM3283 STM3283 STM3284 STM3284 STM3285 STM3285 STM3286 STM3286 STM3287 STM3287 STM3288 STM3288 STM2989 STM2990 STM3289 STM2989 STM2990 STM3289 STM3290,S STM3290,S STM3291 STM3291 STM3292 STM3292 STM3293 STM3293 STM3294 STM3294 STM3295 STM3295 STM3296 STM3296 STM3297 STM3297 STM3298,S STM3298,S STM3299 STM3299 STM3300 STM3300 STM3301 STM3301 STM3303 STM3303 STM3303 STM3303

279

STM3278 mtr mtr deaD deaD nlpI nlpI pnp pnp rpsO rpsO truB truB rbfA rbfA infB infB nusA nusA yhbC yhbC metZ metW metY metZ metW metY argG argG STM3291 STM3291 leuU leuU secG secG mrsA mrsA folP folP hflB hflB ftsJ ftsJ yhbY yhbY greA greA dacB dacB yhbZ yhbZ rpmA rpmA rpmA rpmA

0,17 -0,65 0,55 -0,35 -1,01 -1,70 1,46 0,43 -1,48 -2,42 -2,67 -1,49 -0,92 -2,14 -1,10 -1,50 -0,64 -1,07 -0,31 -1,94 1,45 0,78 1,10 1,50 1,62 2,53 2,35 -0,98 0,23 -0,45 -0,05 -1,58 -2,24 -1,70 -1,19 -2,68 -0,92 -0,11 0,35 -0,93 -0,51 -2,10 -2,00 -1,49 -0,73 -2,13 -0,84 -1,34 0,72 0,66 1,47 -2,68 -1,72 -1,48 -1,29

0,23 -0,18 -0,15 0,96 0,14 0,33 0,87 -1,28 -1,38 -0,68 -0,47 -0,05 0,05 -0,77 -1,12 -0,11 -0,01 -0,78 -0,61 -0,67 -1,62 0,98 0,80 1,06 0,48 1,21 1,10 -0,14 -0,14 -0,37 -0,44 -0,83 -1,33 -0,88 -0,72 -1,18 -1,40 -0,98 -0,92 -0,08 0,85 0,01 0,23 0,59 0,22 -0,21 0,31 -0,13 0,05 0,66 0,74 -0,37 -0,19 -0,61 -0,31

0,12 -0,50 -0,13 -1,65 -1,29 -2,98 -2,98 -0,23 -0,16 -2,25 -4,64 -2,85 -2,32 -2,43 -1,57 -2,24 -1,56 -3,66 -4,03 0,42 0,08 3,12 3,36 4,22 3,42 4,06 4,42 -0,99 0,68 -0,17 0,97 -0,87 -1,02 -2,52 -1,96 -2,86 -2,44 -1,77 -1,31 -1,68 -1,15 -2,02 -2,03 -2,70 -2,22 -2,22 -2,19 -1,25 0,21 0,45 1,50 -3,90 -3,06 -3,60 -3,01

Anexo IV

STM3305 STM3305 STM3306 STM3306 STM3307 STM3307 STM3308 STM3308 STM3308 STM3308 STM3309 STM3309 STM3310 STM3310 STM3311 STM3311 STM3312 STM3312 STM3313 STM3313 STM3314 STM3314 STM3315 STM3315 STM3316 STM3316 STM3317 STM3317 STM3318 STM3318 STM3319 STM3319 STM3320 STM3320 STM3321 STM3321 STM3322 STM3322 STM3323 STM3323 STM3324 STM3324 STM3325 STM3325 STM3326 STM3326 STM3327 STM3327 STM3328 STM3328 STM3329 STM3329 STM3330 STM3330 STM3331

ispB ispB nlp nlp murA murA yrbA yrbA yrbA yrbA yrbB yrbB yrbC yrbC yrbD yrbD yrbE yrbE yrbF yrbF yrbG yrbG yrbH yrbH yrbI yrbI yrbK yrbK yhbN yhbN yhbG yhbG rpoN rpoN yhbH yhbH ptsN ptsN yhbJ yhbJ ptsO ptsO yrbL yrbL mtgA mtgA yhbL yhbL arcB arcB yhcC yhcC gltB gltB gltD

-1,27 0,86 -0,02 0,89 -1,90 -1,32 -1,96 -1,50 -1,21 -1,92 -1,82 -0,95 -1,63 -0,65 -0,85 -0,48 -1,05 -1,91 -1,76 -1,51 -2,33 -1,64 -1,90 -1,08 -1,93 -0,82 -2,13 -1,69 -0,85 -0,56 -1,78 -1,37 -1,58 0,72 -1,46 -0,66 -0,74 -1,66 -1,99 -1,56 -1,66 -1,30 -1,06 -1,11 -1,56 -1,21 -1,21 -0,18 0,05 2,29 -0,06 1,36 -1,41 0,31 -0,53

-0,67 -0,66 -0,62 -0,83 -1,31 -1,40 -1,43 -1,29 -1,21 -1,76 -0,31 -0,43 0,24 0,75 -0,01 -0,16 -0,53 -1,31 -1,65 -1,42 -1,14 -1,25 -1,23 -1,03 -0,44 -0,55 0,38 -0,76 -0,21 -0,97 -0,18 -0,34 0,74 1,22 1,03 1,00 -0,26 0,30 -0,92 -0,64 -1,70 -1,68 -0,56 -1,23 -1,35 -0,93 -0,76 -1,02 -0,76 -1,71 -1,27 -0,07 -0,57 -0,56 -1,17

-2,98 -2,49 -0,73 0,18 -3,83 -3,48 -2,45 -2,72 -3,21 -3,13 -2,11 -1,46 -0,87 -0,65 -0,59 0,17 -1,19 -2,22 -2,65 -3,17 -2,95 -2,52 -2,53 -1,73 -1,18 -0,41 -1,34 -1,03 -1,13 -0,56 -1,84 -1,34 -0,63 0,46 -0,31 0,41 1,23 0,93 -1,41 -0,62 -1,34 -1,10 0,93 1,44 0,05 -0,29 -2,27 -1,60 0,71 1,03 -1,30 0,18 -2,11 -0,86 -1,40

STM3331 STM3332 STM3332 STM3333 STM3333 STM3334 STM3334 STM3335 STM3335 STM3336 STM3336 STM3337 STM3337 STM3338 STM3338 STM3339 STM3339 STM3340 STM3340 STM3341 STM3341 STM3342 STM3342 STM3343 STM3343 STM3344 STM3344 STM3345 STM3345 STM3346 STM3346 STM3347 STM3347 STM3348 STM3348 STM3349 STM3349 STM3350 STM3350 STM3351 STM3351 STM3352 STM3352 STM3352 STM3352 STM3352 STM3352 STM3353 STM3353 STM3354 STM3354 STM3355 STM3355 STM3356 STM3356

280

gltD yhcG yhcG STM3333 STM3333 STM3334 STM3334 yhcH yhcH nanK nanK nanE nanE nanT nanT nanA nanA yhcK yhcK sspB sspB sspA sspA STM3343 STM3343 rpsI rpsI rplM rplM yhcM yhcM yhcB yhcB degQ degQ degS degS STM3350 STM3350 oadB oadB oadA oadA oadA oadA oadA oadA oadG oadG STM3354 STM3354 STM3355 STM3355 STM3356 STM3356

0,68 -0,74 0,12 -1,40 -0,07 0,41 1,42 0,77 1,11 0,27 -1,03 3,01 1,93 0,60 1,04 -0,76 0,64 3,57 1,61 -0,67 -0,05 -2,14 -1,93 0,16 0,67 -1,10 -1,16 -0,70 -0,02 -3,41 -2,27 -1,12 -1,20 -1,45 -0,41 0,58 1,06 -1,05 0,48 1,62 1,67 0,49 1,05 1,92 1,69 2,56 3,00 1,00 1,01 -0,34 0,78 0,46 0,73 0,88 0,62

-1,01 1,00 -0,26 -0,04 0,07 0,08 0,13 0,57 -0,37 0,63 0,33 0,41 0,49 0,76 0,68 0,48 0,18 -0,42 -0,26 -0,22 -0,47 -1,41 -1,78 -1,29 -0,90 -1,14 -1,05 -0,35 -0,94 -1,72 -1,44 -0,16 -0,20 -0,23 -0,31 -0,76 -1,26 -1,32 -0,85 0,72 -0,12 -0,60 0,38 0,11 0,01 -0,01 -0,58 -0,29 -0,79 0,01 -0,52 -0,53 -0,83 -0,39 1,07

-0,92 -1,05 2,33 -1,99 -1,46 -0,64 -0,18 -0,05 0,03 1,38 1,08 1,04 1,51 0,97 1,62 1,14 1,26 1,31 1,83 -2,53 -1,11 -2,48 -2,28 -1,37 -1,48 -1,19 -1,34 -3,82 -2,56 -3,97 -3,14 -2,28 -1,59 -1,03 -0,69 -0,44 -0,31 -1,93 0,29 -0,09 -0,33 0,86 0,01 0,79 0,39 0,95 1,56 1,30 0,54 0,29 0,77 0,59 0,78 -0,17 3,93

Anexo IV

STM3357 STM3357 STM3358 STM3358 STM3360 STM3360 STM3361 STM3361 STM3362 STM3362 STM3363 STM3363 STM3364 STM3364 STM3365 STM3365 STM3366 STM3366 STM3367 STM3367 STM3368 STM3368 STM3369 STM3369 STM3370 STM3370 STM3371 STM3371 STM3372 STM3372 STM3373 STM3373 STM3374 STM3374 STM3375 STM3375 STM3376 STM3376 STM3377 STM3377 STM3378 STM3378 STM3379 STM3379 STM3380 STM3380 STM3381 STM3381 STM3382 STM3382 STM3383 STM3383 STM3384 STM3384 STM3385

STM3357 STM3357 STM3358 STM3358 argR argR yhcN yhcN STM3362 STM3362 yhcO yhcO yhcP yhcP yhcQ yhcQ yhcR yhcR yhcS yhcS tldD tldD yhdP yhdP cafA cafA maf maf mreD mreD mreC mreC mreB mreB yhdA yhdA yhdH yhdH STM3377 STM3377 STM3378 STM3378 accB accB accC accC yhdT yhdT panF panF prmA prmA yhdG yhdG fis

-0,91 -1,63 -1,99 -1,12 -0,01 -0,37 -0,67 0,32 0,29 1,34 -0,25 1,09 -0,32 1,01 0,37 -0,24 -1,00 -0,86 -0,38 -1,52 -0,39 0,14 -0,58 0,23 -0,79 -1,30 -2,38 -1,34 -2,34 -1,80 -2,56 -1,81 -2,73 -1,52 -0,73 -1,18 0,07 -0,09 -1,31 -1,49 -2,43 -0,61 -0,84 -2,06 -1,62 -0,83 -1,58 -0,92 -0,80 -0,52 -1,48 -1,27 -3,74 -3,37 -3,60

-0,61 -1,22 -0,54 0,05 -0,40 -0,63 -0,80 -0,79 -0,14 -0,06 0,93 0,49 -0,38 -0,37 -0,63 -0,36 -0,88 -1,24 0,50 -0,68 -0,41 -0,47 -0,93 -1,37 -0,73 -1,10 -0,98 -0,97 -1,54 -2,09 -2,38 -2,09 -2,39 -2,00 -0,75 -0,94 0,06 -0,26 -0,24 -0,31 -1,16 -0,93 -1,81 -1,12 -1,14 -1,64 -1,23 -1,67 -1,80 -1,48 -0,73 -1,29 -1,90 -1,94 -1,23

0,62 -0,46 -0,60 -0,78 -1,00 -0,28 -0,83 0,22 -0,42 0,53 2,38 1,79 -0,10 0,30 -1,13 -0,79 -0,54 -1,04 1,05 -1,62 -0,34 -0,19 -1,32 -0,66 0,12 0,27 -2,13 -2,52 -3,30 -1,68 -3,09 -2,66 -4,12 -5,11 -1,01 -1,50 -0,77 -0,72 1,19 0,36 -0,91 -1,00 -4,37 -2,52 -1,90 -0,58 -2,97 -2,09 -0,87 0,05 -0,10 -0,89 -5,82 -5,08 -3,80

STM3385 STM3386 STM3386 STM3387 STM3387 STM3388 STM3388 STM3389 STM3389 STM3390 STM3390 STM3391 STM3391 STM3392 STM3392 STM3394 STM3394 STM3396 STM3396 STM3399 STM3399 STM3400 STM3400 STM3401 STM3401 STM3402 STM3402 STM3403 STM3403 STM3404 STM3404 STM3405 STM3405 STM3406 STM3406 STM3407 STM3407 STM3408 STM3408 STM3410 STM3410 STM3412 STM3412 STM3413 STM3413 STM3414 STM3414 STM3415 STM3415 STM3416 STM3416 STM3417 STM3417 STM3418 STM3418

281

fis yhdJ yhdJ yhdU yhdU STM3388 STM3388 envR envR acrE acrE acrF acrF yhdV yhdV thrV thrV rrlD rrlD yrdA yrdA yrdB yrdB aroE aroE yrdC yrdC yrdD yrdD smg smg smf smf def def fmt fmt sun sun mscL mscL zntR zntR yhdN yhdN rplQ rplQ rpoA rpoA rpsD rpsD rpsK rpsK rpsM rpsM

-2,09 -0,02 0,23 -0,54 -0,49 -1,39 -1,31 -0,25 0,48 0,00 0,44 -0,59 0,47 0,25 0,45 -1,56 -0,46 -2,94 -2,04 -0,44 0,16 -1,11 -0,40 -0,98 -0,01 -1,61 -1,36 -1,29 -1,20 -1,06 -0,40 -0,09 0,11 -1,71 -0,54 -1,45 -1,03 -0,28 -0,16 -1,37 -1,42 -1,24 -0,15 -2,13 -0,87 -4,07 -3,86 -2,30 -1,40 -1,42 -0,98 -2,21 -2,22 -1,71 -1,81

-1,06 -1,43 -0,45 -0,95 -0,99 -0,04 -0,78 -0,56 -0,56 -0,51 -1,41 -1,17 -0,95 -0,33 -0,26 -1,34 -1,22 -0,28 0,14 -0,07 0,30 -0,09 -0,16 0,10 -0,34 -1,18 -1,43 -0,19 -0,61 1,06 1,03 1,45 1,87 -0,26 -0,20 -0,32 -0,85 -0,70 -1,96 -0,75 -0,63 -0,12 0,40 -0,80 0,34 -1,92 -1,13 -0,48 -0,47 -0,27 -0,12 -0,84 -0,36 -0,72 -0,15

-2,85 0,64 2,70 -0,81 -0,25 -1,19 1,66 -0,27 0,32 -0,19 -0,44 -0,35 0,61 -0,18 -0,64 -1,10 -0,65 -2,16 -1,43 0,54 0,74 0,55 0,98 0,07 0,44 -0,87 -0,49 -0,17 -0,66 0,79 1,48 1,84 2,42 -0,79 0,71 -0,45 -0,81 -0,42 -0,72 -0,76 -0,89 -0,93 -0,63 -1,65 -1,80 -5,21 -5,81 -6,28 -6,59 -5,64 -6,31 -6,24 -6,14 -5,62 -6,00

Anexo IV

STM3420 STM3420 STM3421 STM3421 STM3422 STM3422 STM3423 STM3423 STM3424 STM3424 STM3425 STM3425 STM3426 STM3426 STM3426 STM3426 STM3427,S STM3427,S STM3428 STM3428 STM3429 STM3429 STM3429 STM3429 STM3430 STM3430 STM3430 STM3430 STM3431 STM3431 STM3432 STM3432 STM3433 STM3433 STM3434 STM3434 STM3435 STM3435 STM3436 STM3436 STM3437 STM3437 STM3438 STM3438 STM3439 STM3439 STM3440 STM3440 STM3456 STM3456 STM3457 STM3457 STM3458 STM3458 STM3459

secY secY rplO rplO rpmD rpmD rpsE rpsE rplR rplR rplF rplF rpsH rpsH rpsH rpsH rpsN rpsN rplE rplE rplX rplX rplX rplX rplN rplN rplN rplN rpsQ rpsQ rpmC rpmC rplP rplP rpsC rpsC rplV rplV rpsS rpsS rplB rplB rplW rplW rplD rplD rplC rplC yheV yheV kefB kefB yheR yheR yheS

-2,50 -2,63 -2,07 -1,65 -2,83 -2,82 -1,43 -0,93 -1,96 -1,68 -0,22 -1,05 -2,72 -1,56 -2,65 -0,86 -2,87 -1,44 -3,22 -3,16 -4,28 -3,03 -2,89 -2,95 -3,49 -2,26 -3,83 -2,34 -2,83 -2,50 -2,82 -1,33 -1,46 -0,21 -1,29 -0,71 -1,52 -1,26 -1,56 -0,72 -2,09 -1,67 -1,34 -0,87 -0,50 -0,88 -2,31 -1,15 0,54 -0,12 0,19 0,77 -0,96 -1,05 -0,71

-0,66 -0,43 -0,60 -0,60 -1,22 -0,54 0,61 0,19 -0,52 0,08 -0,45 -0,18 -1,09 -0,60 -1,23 -0,07 -0,66 -0,02 -1,05 -1,02 -1,46 -1,28 -1,33 -0,93 -1,96 -1,06 -1,88 -0,95 -1,04 -1,18 -0,70 -0,44 -0,15 0,18 0,55 0,32 -0,30 -0,27 0,07 0,28 -0,11 -0,46 0,25 0,09 0,02 0,02 -0,77 -0,56 0,19 0,25 0,81 0,69 -0,16 -0,50 -0,42

-5,34 -5,26 -6,06 -6,47 -5,63 -6,15 -5,33 -4,86 -5,58 -5,77 -6,00 -6,47 -6,42 -6,65 -6,87 -6,28 -7,72 -6,55 -5,63 -6,59 -6,21 -5,90 -5,91 -6,29 -5,86 -5,87 -6,48 -6,15 -5,35 -4,76 -4,57 -4,87 -5,31 -5,08 -5,71 -5,11 -6,95 -6,61 -4,05 -5,31 -4,82 -5,21 -6,35 -6,86 -7,04 -7,83 -6,87 -6,51 -0,75 -0,70 -0,54 0,31 -1,34 -2,81 -0,60

STM3459 STM3461 STM3461 STM3462 STM3462 STM3463 STM3463 STM3464 STM3464 STM3465 STM3465 STM3466 STM3466 STM3467 STM3467 STM3468 STM3468 STM3469 STM3469 STM3470 STM3470 STM3472 STM3472 STM3473 STM3473 STM3474 STM3474 STM3475 STM3475 STM3476 STM3476 STM3477 STM3477 STM3478 STM3478 STM3480 STM3480 STM3481 STM3481 STM3482 STM3482 STM3483 STM3483 STM3484 STM3484 STM3485 STM3485 STM3486 STM3486 STM3487 STM3487 STM3488 STM3488 STM3489 STM3489

282

yheS STM3461 STM3461 yheT yheT yheU yheU prkB prkB yhfA yhfA crp crp yhfK yhfK argD argD pabA pabA fic fic ppiA ppiA yhfC yhfC nirB nirB nirD nirD nirC nirC cysG cysG bigA bigA yhfL yhfL trpS trpS gph gph rpe rpe dam dam damX damX aroB aroB aroK aroK hofQ hofQ yrfA yrfA

0,11 -1,03 0,02 -1,98 -1,00 -0,73 -0,38 -1,22 -0,12 -1,35 -1,71 -1,46 -1,56 0,48 0,47 -0,43 0,48 0,27 -0,04 -0,63 -0,28 -0,73 0,88 -1,32 -1,09 -0,56 0,90 3,63 3,62 -0,39 -0,72 -1,33 0,28 -0,17 0,47 -1,92 -0,81 -2,81 -1,83 -3,45 -2,72 -1,94 -1,62 -2,38 -1,28 -2,93 -1,50 -2,50 -2,56 -3,28 -3,00 -0,19 2,04 -0,88 0,68

-0,02 0,69 1,07 -1,23 -0,61 -0,26 -0,21 -0,03 -0,24 -0,76 -0,78 -0,38 -0,65 0,47 0,00 0,67 0,63 0,12 0,70 0,93 0,82 0,75 0,78 -2,34 -2,78 -0,45 -0,34 -1,08 -0,13 -0,34 -0,78 -0,37 -0,41 -0,81 -0,36 -1,68 -2,23 -2,39 -2,15 -1,78 -1,90 -1,08 -1,51 -1,01 -1,44 -2,15 -1,51 -1,23 -1,07 -1,54 -1,82 -0,64 -1,03 0,52 0,59

-1,22 0,10 0,38 -0,59 -1,01 -1,30 -0,16 0,23 -1,05 -0,50 -0,74 0,36 1,03 -0,72 1,69 -0,07 -0,37 -0,84 -0,01 1,12 1,33 -0,76 -0,54 -2,13 -1,58 -0,92 0,32 -1,12 0,78 -0,95 -1,38 -1,20 -0,35 -0,90 0,03 -2,39 -2,47 -2,56 -2,60 -2,99 -2,40 -1,56 -0,94 -2,79 -1,90 -2,89 -2,93 -3,06 -2,56 -3,03 -3,01 -1,38 0,07 0,43 -0,15

Anexo IV

STM3490 STM3490 STM3491 STM3491 STM3492 STM3492 STM3493 STM3493 STM3494,S STM3494,S STM3495 STM3495 STM3496 STM3496 STM3497 STM3497 STM3498 STM3498 STM3499 STM3499 STM3501 STM3501 STM3502 STM3502 STM3503 STM3503 STM3504 STM3504 STM3507 STM3507 STM3508 STM3508 STM3509 STM3509 STM3510 STM3510 STM3511 STM3511 STM3512 STM3512 STM3513 STM3513 STM3514 STM3514 STM3515 STM3515 STM3516 STM3516 STM3517 STM3517 STM3518 STM3518 STM3519 STM3519 STM3521

yrfB yrfB yrfC yrfC yrfD yrfD mrcA mrcA yrfE yrfE yrfF yrfF yrfG yrfG yrfH yrfH hslO hslO yhgE yhgE envZ envZ ompR ompR greB greB yhgF yhgF yhgG yhgG STM3508 STM3508 bioH bioH yhgH yhgH yhgI yhgI gntT gntT malQ malQ malP malP malT malT STM3516 STM3516 STM3517 STM3517 rtcA rtcA rtcB rtcB STM3521

-0,66 1,03 3,09 6,85 -0,14 0,76 0,02 1,60 -0,12 0,89 -1,53 0,13 -2,01 -1,02 -0,18 0,29 -1,42 -0,32 -0,38 0,41 0,08 1,17 -1,26 -0,08 -1,14 0,52 -0,14 -1,30 -1,41 -0,71 0,33 0,81 -1,25 0,05 -2,59 -2,05 -1,40 -0,55 -2,44 -1,85 1,12 1,76 0,52 -0,70 -1,51 -0,97 0,29 -0,54 0,28 0,39 0,69 1,78 0,72 1,25 -0,10

-1,68 -2,78 1,60 2,70 -1,22 -2,09 -0,17 -0,64 -0,99 -0,76 0,79 -1,11 -0,40 -0,45 -0,08 -0,14 -0,77 -0,91 -0,07 -0,95 -0,55 -0,04 -0,54 -0,81 -0,85 -0,85 -0,35 -1,69 -0,78 -1,22 -0,69 -0,12 -0,11 -0,31 -1,69 -1,77 0,27 -0,05 -3,45 -3,24 -0,87 -1,02 -0,29 -0,72 -0,98 -0,49 1,64 0,51 1,15 0,86 -0,47 0,02 1,23 1,33 2,34

-0,46 0,07 3,71 6,37 -1,18 0,03 0,58 1,34 -1,47 0,02 -1,29 -2,79 -2,91 -2,36 -1,89 -2,05 -3,30 -2,28 -1,03 -0,86 -1,35 -0,36 -1,30 -1,14 -1,55 -1,02 -1,71 -2,46 -2,30 -0,64 -0,87 0,29 -1,60 -1,27 -2,30 0,15 -2,63 -2,10 -2,48 -1,59 2,08 2,15 2,29 1,23 -0,41 -1,23 2,02 -0,86 1,08 1,48 -1,06 -0,06 -0,02 0,54 -0,86

STM3521 STM3522 STM3522 STM3523 STM3523 STM3524 STM3524 STM3525 STM3525 STM3526 STM3526 STM3527 STM3527 STM3528 STM3528 STM3529 STM3529 STM3531 STM3531 STM3532 STM3532 STM3533 STM3533 STM3534 STM3534 STM3535 STM3535 STM3536 STM3536 STM3537 STM3537 STM3538 STM3538 STM3539 STM3539 STM3541 STM3541 STM3543 STM3543 STM3544 STM3544 STM3545 STM3545 STM3546 STM3546 STM3547,Sc STM3547,Sc STM3548 STM3548 STM3549 STM3549 STM3550 STM3550 STM3551 STM3551

283

STM3521 rtcR rtcR glpR glpR glpG glpG glpE glpE glpD glpD STM3527 STM3527 STM3528 STM3528 gldA gldA STM3531 STM3531 STM3532 STM3532 STM3533 STM3533 glgP glgP glgA glgA glgC glgC glgX glgX glgB glgB asd asd gntU gntU gntR gntR yhhW yhhW yhhX yhhX yhhY yhhY STM3547,Sc STM3547,Sc STM3548 STM3548 STM3549 STM3549 STM3550 STM3550 ggt ggt

0,82 -2,24 -0,83 -1,29 -0,55 -1,92 -1,32 -2,46 -1,55 -1,60 -0,44 -2,26 -0,19 -0,98 0,46 0,86 2,46 -0,28 0,43 0,64 1,05 -0,13 0,31 -0,42 1,58 -0,83 -0,10 -0,57 -0,41 -0,96 0,57 -0,71 -0,73 -0,35 1,38 -0,57 0,41 -1,09 -0,47 -0,68 1,17 0,32 0,70 -0,33 0,80 -0,97 2,94 1,22 0,28 0,37 0,99 -0,05 0,75 0,19 0,67

2,47 -1,18 -0,74 -1,92 -1,68 -1,22 -1,46 -1,57 -1,03 1,63 1,38 0,31 0,96 0,09 0,26 -2,08 -1,35 0,14 -0,27 -0,33 -0,16 0,08 0,13 -0,08 0,44 1,00 1,08 1,27 1,36 0,93 0,74 -1,99 -3,55 -0,12 0,39 -0,50 -0,32 -0,99 -1,10 -0,39 -0,73 0,09 -0,32 0,47 -0,64 -0,99 0,29 0,27 -0,46 -0,08 -0,07 0,95 0,84 2,16 1,25

0,06 -1,63 -1,26 -2,29 -1,59 -0,88 -1,35 0,17 0,56 2,17 2,78 1,65 2,03 1,19 1,53 -0,65 0,35 0,79 0,39 0,20 -0,64 -1,47 -1,45 0,55 1,06 0,57 0,86 0,95 1,08 0,00 0,94 -2,97 -2,52 -0,71 0,32 -0,80 -0,33 -1,42 -0,83 0,46 0,35 -0,24 1,35 0,20 0,65 0,23 2,61 -1,64 -0,58 0,32 0,30 0,44 1,64 1,81 1,74

Anexo IV

STM3552 STM3552 STM3553 STM3553 STM3554 STM3554 STM3555 STM3555 STM3556 STM3556 STM3557 STM3557 STM3558 STM3558 STM3559 STM3559 STM3560 STM3560 STM3561 STM3561 STM3562 STM3562 STM3563 STM3563 STM3564 STM3564 STM3565 STM3565 STM3567 STM3567 STM3568 STM3568 STM3569 STM3569 STM3570 STM3570 STM3571 STM3571 STM3572 STM3572 STM3573 STM3573 STM3574 STM3574 STM3575 STM3575 STM3576 STM3576 STM3577 STM3577 STM3578 STM3578 STM3579 STM3579 STM3580

yhhA yhhA ugpQ ugpQ ugpC ugpC ugpE ugpE ugpA ugpA ugpB ugpB STM3558 STM3558 yhhV yhhV livF livF livG livG livM livM livH livH livK livK yhhK yhhK livJ livJ rpoH rpoH ftsX ftsX ftsE ftsE ftsY ftsY yhhF yhhF yhhL yhhL yhhM yhhM yhhN yhhN zntA zntA tcp tcp yhhP yhhP yhhQ yhhQ STM3580

1,14 1,89 -0,22 2,48 -0,63 0,13 0,27 0,42 -0,35 -0,91 0,10 1,86 4,75 4,49 1,30 1,19 -0,33 1,14 0,78 1,98 -0,10 0,98 0,40 0,64 -1,12 -0,46 -0,14 -0,66 -0,53 1,19 0,94 2,43 -0,80 -1,27 -1,98 -1,21 -2,27 -1,67 -1,76 -0,51 0,19 -1,04 -0,95 -0,83 -0,55 0,76 -0,10 -0,49 -1,03 1,17 -0,68 -1,40 -0,62 -0,04 0,08

3,35 3,12 2,11 2,59 0,96 1,13 1,55 1,61 0,80 0,72 4,07 4,40 1,11 1,46 1,40 1,21 -0,39 0,26 -0,17 0,22 0,46 -0,12 -0,44 -1,23 -0,46 -0,55 -0,56 -1,32 0,50 1,08 1,67 2,61 -0,36 -0,30 -1,04 -0,99 -1,19 -0,77 -1,13 -1,18 -0,16 -0,73 -0,09 0,02 0,21 -0,68 0,85 0,94 -0,30 -1,05 -1,60 -1,16 -0,63 -0,64 -0,08

4,72 5,67 3,90 4,25 0,11 0,78 1,86 0,64 -0,05 -0,45 2,19 2,68 1,40 0,78 0,57 1,20 -0,82 -0,26 -0,54 0,47 -0,57 0,35 -0,12 -0,35 -1,26 -0,51 -0,76 -3,43 -0,11 3,84 -1,00 -0,11 -2,46 -1,29 -2,80 -2,25 -2,15 -1,07 -2,63 -1,76 -0,24 -1,32 -0,51 -1,02 0,08 0,18 -1,07 -1,42 -1,33 -1,57 -2,36 -2,07 -1,42 -0,41 -0,08

STM3580 STM3581,S STM3581,S STM3582 STM3582 STM3583 STM3583 STM3584 STM3584 STM3585 STM3585 STM3586,S STM3586,S STM3587 STM3587 STM3588 STM3588 STM3589 STM3589 STM3590 STM3590 STM3591 STM3591 STM3592 STM3592 STM3593 STM3593 STM3594 STM3594 STM3595 STM3595 STM3596 STM3596 STM3597 STM3597 STM3598 STM3598 STM3599 STM3599 STM3600 STM3600 STM3601 STM3601 STM3602 STM3602 STM3603 STM3603 STM3604 STM3604 STM3605 STM3605 STM3606 STM3606 STM3607 STM3607

284

STM3580 yhhS yhhS yhhT yhhT acpT acpT nikR nikR yhhJ yhhJ yhiH yhiH yhiI yhiI yhiN yhiN pitA pitA uspB uspB uspA uspA yhiP yhiP yhiQ yhiQ prlC prlC STM3595 STM3595 yhiR yhiR gor gor STM3598 STM3598 STM3599 STM3599 STM3600 STM3600 STM3601 STM3601 STM3602 STM3602 treF treF STM3604 STM3604 STM3605 STM3605 yhjB yhjB yhjC yhjC

0,92 -0,75 0,07 1,88 0,80 3,08 0,45 -0,54 -0,52 -0,08 0,01 -0,07 -0,11 -0,87 0,20 -0,50 0,37 -1,00 -0,76 -0,92 0,90 -2,29 -1,37 -1,27 0,28 -1,23 -1,24 -1,68 -0,72 -0,67 -0,06 -2,06 -0,77 -1,18 -0,76 -1,62 0,22 1,47 1,14 -0,22 0,51 0,31 0,94 0,58 0,21 -0,55 -0,02 0,82 2,01 -1,34 0,28 -0,15 1,02 0,70 1,07

-0,18 -0,69 -0,50 -0,25 -1,21 -0,75 -1,26 0,39 -0,12 -1,12 -1,69 0,07 -1,24 -0,60 -0,89 -0,98 -1,42 -0,89 -0,72 0,20 0,75 0,53 1,03 -1,05 0,84 -1,07 -0,53 -0,73 -0,67 -0,60 -0,68 -0,84 -0,71 -0,05 -0,35 -0,22 -0,06 0,75 0,74 -0,90 -1,57 0,47 0,42 1,67 0,24 0,35 -0,45 0,04 -0,41 -0,35 1,03 0,89 0,83 0,48 0,58

0,46 -1,19 -0,86 0,63 -0,17 0,86 -0,52 -2,39 -0,71 -0,85 -0,27 -0,87 -0,59 -0,54 0,48 -0,90 -0,67 -1,23 -0,22 1,07 1,82 0,74 1,31 -1,82 -0,50 -1,13 -2,01 -0,86 0,09 -2,17 -1,47 -2,71 -2,21 -0,54 0,16 -2,17 -1,74 -0,99 0,57 -1,25 0,34 -0,40 0,75 1,51 0,39 0,51 0,41 -0,46 0,74 -1,79 -1,42 1,75 1,59 -0,32 0,95

Anexo IV

STM3608 STM3608 STM3609 STM3609 STM3610 STM3610 STM3611 STM3611 STM3612 STM3612 STM3613 STM3613 STM3614 STM3614 STM3615 STM3615 STM3616 STM3616 STM3617 STM3617 STM3618 STM3618 STM3619 STM3619 STM3620 STM3620 STM3621 STM3621 STM3622 STM3622 STM3623 STM3623 STM3624 STM3624 STM3624A STM3624A STM3625 STM3625 STM3626 STM3626 STM3627 STM3627 STM3628 STM3628 STM3629 STM3629 STM3630 STM3630 STM3631 STM3631 STM3632 STM3632 STM3633 STM3633 STM3634

yhjD yhjD yhjE yhjE yhjG yhjG yhjH yhjH kdgK kdgK yhjJ yhjJ dctA dctA yhjK yhjK yhjL yhjL STM3617 STM3617 yhjN yhjN yhjO yhjO yhjQ yhjQ yhjR yhjR yhjS yhjS yhjT yhjT yhjU yhjU STM3624A STM3624A yhjV yhjV dppF dppF dppD dppD dppC dppC dppB dppB dppA dppA STM3631 STM3631 STM3632 STM3632 STM3633 STM3633 proK

-0,43 0,90 -0,43 1,01 -0,63 0,90 -1,16 -1,27 -1,26 -1,43 -0,81 -0,12 -1,28 -0,33 -0,76 -0,09 0,18 -0,10 -2,37 -1,37 -1,68 -2,88 -1,34 -0,47 -0,68 0,29 -1,00 -0,07 -2,03 -0,24 -1,93 0,57 -2,43 -1,19 -1,54 -0,70 3,22 1,88 0,00 0,41 0,17 1,15 -1,07 0,19 0,05 1,39 -1,00 1,60 0,06 1,00 -0,37 -1,16 -0,64 -0,53 0,73

-0,26 -0,99 -0,01 0,12 1,34 -0,29 -2,82 -0,09 -0,96 -0,48 -1,25 -0,73 -1,20 -0,53 0,14 0,59 -0,89 -1,29 -1,49 -0,99 -0,86 -1,33 -1,20 -1,61 -0,11 -1,18 -0,48 -0,25 -0,88 -1,03 -1,21 -1,27 -0,80 -0,38 -0,50 -0,86 -1,39 -1,56 -0,59 -0,46 -0,06 -0,93 -0,59 -0,95 0,28 0,37 2,36 2,12 0,36 -0,38 -0,62 -1,39 -0,82 -0,46 -1,67

-1,23 -0,39 0,37 0,73 1,71 1,11 -0,12 -0,33 -0,71 -2,02 -0,84 -1,00 -2,63 0,24 0,33 0,16 -0,97 -0,45 -1,03 -0,99 -1,37 -4,20 -2,62 -1,86 -1,94 -1,05 -1,25 -0,98 -0,97 -0,78 -1,30 0,02 -2,23 -1,74 -2,00 -0,98 3,30 0,99 0,94 -0,55 0,29 1,56 -0,68 -0,35 0,12 2,51 1,01 0,85 1,31 1,73 0,05 -0,24 -2,38 -1,03 0,03

STM3634 STM3635 STM3635 STM3641 STM3641 STM3642 STM3642 STM3643 STM3643 STM3644 STM3644 STM3645 STM3645 STM3646 STM3646 STM3647 STM3647 STM3648 STM3648 STM3649 STM3649 STM3650 STM3650 STM3651 STM3651 STM3652 STM3652 STM3655 STM3655 STM3656 STM3656 STM3657 STM3657 STM3658 STM3658 STM3659 STM3659 STM3660 STM3660 STM3661 STM3661 STM3662 STM3662 STM3663 STM3663 STM3664 STM3664 STM3665 STM3665 STM3666 STM3666 STM3667 STM3667 STM3668 STM3668

285

proK yhjW yhjW yhjY yhjY tag tag yiaC yiaC bisC bisC yiaD yiaD yiaE yiaE yiaF yiaF yiaG yiaG cspA cspA STM3650 STM3650 STM3651 STM3651 STM3652 STM3652 glyS glyS glyQ glyQ STM3657 STM3657 yiaH yiaH yiaB yiaB xylB xylB xylA xylA xylR xylR bax bax malS malS avtA avtA ysaA ysaA yiaJ yiaJ yiaK yiaK

0,39 0,77 1,46 -1,05 -0,08 -0,28 1,21 2,18 0,80 -1,34 -0,19 0,70 1,65 0,22 0,27 -1,85 -0,33 -0,18 0,08 0,07 -0,95 -0,72 0,81 1,27 1,65 0,13 0,15 -1,66 -1,72 -3,02 -2,11 -1,90 -1,31 -1,21 -1,13 0,62 2,14 -0,82 -0,51 -0,32 5,87 -1,31 -0,38 -1,64 -0,78 -0,17 1,51 -0,40 1,17 -1,23 -0,31 -1,01 -0,04 -0,17 0,43

-1,24 0,39 0,61 -0,35 -0,03 0,15 0,26 -1,02 -1,25 -1,05 -0,73 0,55 0,56 0,37 -0,09 -0,48 -0,60 0,98 1,20 0,32 0,36 0,30 0,76 1,58 1,60 1,31 1,06 -0,02 -1,21 -1,93 -1,31 -0,46 -0,36 0,14 -1,42 -0,80 -1,08 -0,83 -0,39 0,18 1,38 1,20 1,52 1,49 2,05 -0,83 -1,03 -1,06 -0,88 -1,39 -0,75 -0,32 -0,93 -0,67 -0,76

0,08 0,10 0,36 -1,10 0,41 -0,37 -0,64 -0,95 -0,07 -0,49 -0,52 -0,93 -0,47 1,16 1,76 -1,72 -0,68 2,91 4,03 -1,31 -1,57 -0,22 -0,11 -1,05 -1,24 -0,13 -1,87 -0,70 -1,41 -3,74 -3,73 -1,23 -1,40 -0,90 -0,12 -0,50 2,15 -0,15 0,27 0,39 1,61 -0,23 0,51 0,82 0,81 -0,11 0,71 -0,27 0,34 -0,99 -1,44 -0,98 0,07 -0,51 0,12

Anexo IV

STM3669 STM3669 STM3670 STM3670 STM3671 STM3671 STM3672 STM3672 STM3673 STM3673 STM3674 STM3674 STM3675 STM3675 STM3676 STM3676 STM3677 STM3677 STM3678 STM3678 STM3679 STM3679 STM3680 STM3680 STM3681 STM3681 STM3682 STM3682 STM3683 STM3683 STM3684 STM3684 STM3685 STM3685 STM3686 STM3686 STM3687 STM3687 STM3688 STM3688 STM3689 STM3689 STM3690 STM3690 STM3691 STM3691 STM3692 STM3692 STM3693 STM3693 STM3694 STM3694 STM3695 STM3695 STM3696

yiaL yiaL STM3670 STM3670 yiaM yiaM yiaN yiaN yiaO yiaO lyxK lyxK sgbH sgbH sgbU sgbU sgbE sgbE STM3678 STM3678 STM3679 STM3679 aldB aldB STM3681 STM3681 selB selB selA selA yibF yibF mtlA mtlA mtlD mtlD mtlR mtlR STM3688 STM3688 yibL yibL STM3690 STM3690 STM3691 STM3691 lldP lldP lldR lldR lldD lldD yibK yibK STM3696

-0,69 -0,10 -0,55 0,72 -0,81 -0,50 -0,52 -1,03 0,33 1,49 0,50 1,21 -0,12 2,30 -0,12 1,13 0,22 0,83 0,54 0,88 0,37 0,76 1,30 1,77 0,05 0,72 -2,05 -0,93 -1,83 -0,90 0,45 2,85 0,62 -0,33 0,98 1,66 -1,73 -1,27 -0,92 0,42 -0,75 0,03 0,67 2,48 0,87 0,71 -0,69 -1,16 1,03 1,66 -0,70 -0,43 -0,75 0,51 -0,34

-0,38 -0,38 0,19 -0,94 0,17 -0,58 -0,06 -0,64 0,27 -1,59 0,30 0,69 0,55 -0,88 0,34 -0,08 0,55 -0,11 -0,09 -0,20 1,10 1,22 3,54 2,85 -0,28 -1,47 -0,50 -0,30 -0,96 -0,64 0,64 0,81 0,23 0,40 -0,32 -1,07 -0,63 -0,61 0,50 0,25 -1,37 -1,39 0,54 0,00 -0,07 -0,59 -0,97 -0,89 -0,99 -1,23 -0,42 -1,03 -0,80 -0,77 0,15

-1,50 0,38 -0,99 0,27 0,20 0,10 -0,83 -0,20 -0,83 -0,39 1,77 0,97 -0,07 -0,02 -0,88 0,70 -0,40 0,29 -0,62 1,11 2,69 3,45 5,75 6,67 0,90 1,24 -0,44 0,47 -1,84 -0,91 0,84 1,45 0,26 0,91 -0,42 0,23 1,31 2,09 3,10 2,91 -0,52 0,08 2,10 1,53 -0,23 0,01 -0,36 -1,76 -0,49 0,16 0,43 0,07 -1,97 -0,47 -0,89

STM3696 STM3697 STM3697 STM3698 STM3698 STM3699 STM3699 STM3700 STM3700 STM3701 STM3701 STM3702 STM3702 STM3703 STM3703 STM3705 STM3705 STM3706 STM3706 STM3707 STM3707 STM3708 STM3708 STM3709 STM3709 STM3710 STM3710 STM3711 STM3711 STM3712 STM3712 STM3713 STM3713 STM3714 STM3714 STM3715 STM3715 STM3716 STM3716 STM3717 STM3717 STM3718 STM3718 STM3719 STM3719 STM3720 STM3720 STM3721 STM3721 STM3722 STM3722 STM3723 STM3723 STM3724 STM3724

286

STM3696 STM3697 STM3697 STM3698 STM3698 cysE cysE gpsA gpsA secB secB grxC grxC yibN yibN yibP yibP yigQ yigQ yibD yibD tdh tdh kbl kbl rfaD rfaD rfaF rfaF rfaC rfaC rfaL rfaL rfaK rfaK rfaZ rfaZ rfaY rfaY rfaJ rfaJ rfaI rfaI rfaB rfaB yibR yibR rfaP rfaP rfaG rfaG rfaQ rfaQ kdtA kdtA

-0,50 -1,37 0,03 -1,21 -0,25 -0,52 -0,07 -1,37 -1,37 -1,26 -1,19 -2,60 -2,17 -3,55 -1,91 -2,12 -3,36 0,62 1,18 -1,26 -1,43 -0,88 -0,09 -3,08 -2,32 0,88 0,49 -3,26 -2,84 -1,52 -2,95 -1,87 -2,60 -0,88 -0,57 -0,09 1,82 -2,06 -1,75 -2,22 -1,25 -2,92 -3,39 -3,02 -1,39 0,82 0,69 -0,76 -0,61 -1,93 -0,44 -2,88 -2,33 -2,24 -0,92

-0,07 0,38 0,01 -0,44 -0,31 0,23 0,59 -0,36 -0,18 -0,70 -0,15 -1,10 -1,13 -1,44 -1,01 -2,00 -1,79 -1,11 -1,20 -1,62 -1,43 -0,72 -0,22 -1,71 -1,48 1,16 1,55 -1,60 -1,71 -1,36 -1,72 -1,92 -2,13 -0,56 -0,22 1,22 0,19 -1,82 -2,31 -1,93 -2,48 -2,84 -2,64 -2,54 -2,20 0,17 0,12 -0,73 -1,23 -1,46 -1,29 -1,77 -1,72 -1,10 -1,03

-0,16 -0,97 -0,71 -1,01 -1,40 -1,78 -1,16 -1,87 -1,88 -1,79 -1,24 -3,45 -3,24 -3,53 -2,83 -1,89 -3,06 -0,82 -0,18 -1,16 -1,68 -1,30 -0,46 -2,89 -2,86 4,02 2,96 -1,59 -1,93 -1,60 -2,02 -2,99 -2,30 0,15 -0,28 2,62 3,16 -2,24 -3,14 -2,59 -2,03 -2,68 -2,68 -3,15 -1,61 2,37 2,99 0,15 0,08 -2,64 -1,85 -2,62 -2,56 -3,39 -2,85

Anexo IV

STM3725 STM3725 STM3726 STM3726 STM3727 STM3727 STM3728 STM3728 STM3729 STM3729 STM3730 STM3730 STM3731 STM3731 STM3732 STM3732 STM3733 STM3733 STM3734 STM3734 STM3735 STM3735 STM3736 STM3736 STM3737 STM3737 STM3738 STM3738 STM3739 STM3739 STM3740 STM3740 STM3741 STM3741 STM3742 STM3742 STM3743 STM3743 STM3744 STM3744 STM3745 STM3745 STM3746 STM3746 STM3747 STM3747 STM3748 STM3748 STM3749 STM3749 STM3750 STM3750 STM3751 STM3751 STM3752

kdtB kdtB mutM mutM rpmG rpmG rpmB rpmB radC radC dfp dfp dut dut slmA slmA pyrE pyrE rph rph yicC yicC STM3736 STM3736 STM3737 STM3737 yigC yigC yicF yicF gmk gmk rpoZ rpoZ spoT spoT spoU spoU recG recG STM3745 STM3745 gltS gltS yicE yicE yicH yicH yicI yicI yicJ yicJ selC selC STM3752

-1,60 -1,07 -1,87 -0,58 -3,17 -2,25 -4,10 -3,39 -3,19 -1,65 -1,61 -0,25 -0,53 0,03 -0,42 -1,33 -1,01 -0,13 0,35 1,04 -1,96 0,62 -1,40 -0,92 -0,69 0,68 -0,60 -2,10 -1,24 -1,21 -1,65 -1,85 -2,97 -1,12 -3,18 -3,10 -1,23 -1,82 -0,95 0,65 -0,40 0,58 -1,70 -0,38 0,19 0,84 0,59 2,44 -0,48 0,74 0,15 1,05 -0,63 -0,80 -0,94

-0,81 -0,83 -0,56 -0,77 -1,98 -1,79 -3,01 -2,20 -2,00 -2,13 -0,03 -0,60 -1,31 -1,43 -0,60 -1,41 -0,87 -0,56 -1,01 -0,82 -0,71 0,04 -0,65 -1,10 -0,32 -0,50 -1,02 -2,43 -0,36 -0,61 -0,74 -0,83 -0,85 -0,73 -2,46 -2,77 -2,59 -1,97 -0,47 -0,46 -0,30 -0,29 -0,42 -0,10 0,34 0,10 -0,16 -0,29 0,21 -0,21 0,48 0,03 0,28 0,15 -0,48

-2,23 -1,94 -2,86 -2,07 -3,25 -2,73 -5,24 -4,37 -1,92 -2,13 -2,46 -2,23 -1,74 -1,60 -1,12 -1,00 -0,36 -0,47 -1,44 -1,04 -1,11 1,84 -1,41 -0,57 -1,43 -0,47 -1,10 -2,47 -1,22 -1,00 -1,34 -1,16 -2,79 -2,16 -2,03 -3,51 -3,36 -3,68 -0,16 -1,01 -2,82 -1,06 -1,47 -1,77 -1,54 -0,49 -1,25 0,52 -0,95 -0,32 1,42 1,50 1,22 0,43 -0,49

STM3752 STM3765 STM3765 STM3766 STM3766 STM3767 STM3767 STM3768 STM3768 STM3769,S STM3769,S STM3770 STM3770 STM3771 STM3771 STM3772 STM3772 STM3773 STM3773 STM3774 STM3774 STM3775 STM3775 STM3776 STM3776 STM3777 STM3777 STM3778 STM3778 STM3779 STM3779 STM3781 STM3781 STM3782 STM3782 STM3783 STM3783 STM3784 STM3784 STM3785 STM3785 STM3786 STM3786 STM3787 STM3787 STM3788 STM3788 STM3789 STM3789 STM3790 STM3790 STM3791 STM3791 STM3792 STM3792

287

STM3752 yicL yicL STM3766 STM3766 STM3767 STM3767 STM3768 STM3768 STM3769,S STM3769,S STM3770 STM3770 STM3771 STM3771 STM3772 STM3772 STM3773 STM3773 STM3774 STM3774 STM3775 STM3775 yicM yicM STM3777 STM3777 STM3778 STM3778 STM3779 STM3779 STM3781 STM3781 STM3782 STM3782 STM3783 STM3783 STM3784 STM3784 STM3785 STM3785 yicN yicN uhpT uhpT uhpC uhpC uhpB uhpB uhpA uhpA STM3791 STM3791 STM3792 STM3792

-0,18 -0,84 -0,23 0,93 1,38 1,08 1,51 0,08 1,07 -0,14 0,95 -0,48 2,63 -0,33 0,65 0,65 0,61 0,26 -0,02 4,30 3,75 0,21 0,45 -1,27 1,52 0,65 2,01 0,72 1,85 0,18 0,13 -0,33 1,97 0,24 -0,82 0,71 -0,85 -0,41 -1,22 -0,06 3,11 -0,90 1,02 0,60 1,94 -0,25 0,59 0,36 0,29 -2,04 -1,03 -0,33 0,97 -0,84 0,46

-0,74 0,05 -0,39 0,90 0,39 0,68 0,18 -0,27 -1,62 -0,21 -0,61 -0,31 0,25 -0,49 -0,77 -0,30 -0,40 -1,11 -0,99 0,07 -1,37 -0,67 -1,05 -0,16 0,11 2,09 1,76 1,52 1,53 0,88 0,50 1,15 -0,08 0,29 -0,03 1,51 0,94 0,37 0,60 0,98 0,16 -0,56 -0,42 0,70 0,08 -1,45 -1,45 -1,41 -1,50 0,05 -1,02 -0,95 -1,05 -0,68 -0,51

-0,20 -0,15 -0,38 0,66 0,49 0,12 1,02 -0,51 0,11 0,78 0,23 -1,02 2,40 -0,94 -0,04 -0,05 1,36 -0,80 0,87 2,40 3,10 -0,34 -0,21 -0,45 1,11 1,63 2,73 1,21 1,70 2,21 1,42 -1,40 1,60 0,10 -1,07 0,61 0,56 0,06 0,18 -0,73 0,54 -1,45 -0,82 1,10 0,29 -1,61 -0,77 0,66 -0,05 -1,71 -1,73 -0,35 0,79 0,25 -0,96

Anexo IV

STM3793 STM3793 STM3794 STM3794 STM3795 STM3795 STM3796 STM3796 STM3796A,S STM3796A,S STM3797 STM3797 STM3798 STM3798 STM3799 STM3799 STM3800 STM3800 STM3801 STM3801 STM3802 STM3802 STM3803 STM3803 STM3804 STM3804 STM3805 STM3805 STM3807 STM3807 STM3808,S STM3808,S STM3809,S STM3809,S STM3810 STM3810 STM3811 STM3811 STM3812 STM3812 STM3813 STM2248 STM3813 STM2248 STM3814 STM2249 STM3814 STM2249 STM2250 STM3815 STM22450 STM3815 STM2251 STM3816 STM2251

STM3793 STM3793 STM3794 STM3794 ilvN ilvN ilvB ilvB STM3796A,S STM3796A,S ivbL ivbL emrD emrD STM3799 STM3799 dsdC dsdC dsdX dsdX dsdA dsdA yidF yidF yidG yidG yidH yidH yidE yidE ibpB ibpB ibpA ibpA yidQ yidQ yidR yidR ccmH ccmH ccmG ccmG ccmG ccmG ccmF ccmF ccmF ccmF ccmE ccmE ccmE ccmE ccmD ccmD ccmD

-0,91 -0,34 -0,85 0,49 -0,17 1,81 1,81 0,47 1,62 2,39 0,26 1,44 -1,21 -0,41 -0,18 0,86 -1,43 -0,76 0,13 1,21 1,24 0,34 0,24 0,92 -1,03 0,89 -0,84 0,27 -0,61 1,10 2,54 3,17 1,40 2,55 4,69 0,69 0,73 0,04 1,46 1,66 0,16 1,21 1,03 2,24 -0,24 0,40 0,50 0,55 2,37 2,44 2,49 2,85 -0,40 0,59 0,84

0,04 0,69 0,49 0,82 0,22 0,40 -0,05 -0,55 -1,05 -1,50 0,82 1,00 -0,51 -0,21 -0,13 -0,26 -1,70 -1,15 -0,65 -0,95 -0,30 -1,16 -0,59 -0,71 -0,31 -0,40 -0,11 -0,52 -0,76 -0,85 1,45 1,68 3,09 3,85 1,06 0,96 0,78 1,21 0,22 0,07 -0,35 -0,56 -0,41 -0,76 -1,15 -0,82 -1,43 -1,92 0,38 0,06 -0,19 -0,16 0,41 -0,22 -0,42

-0,70 1,97 1,95 3,49 -0,94 1,58 0,25 0,75 -0,26 0,66 0,27 1,56 -1,14 -0,73 0,18 -0,11 -1,52 -1,18 -0,81 0,45 -0,24 0,58 -1,83 -0,32 -0,35 0,63 -0,58 -1,38 -1,69 -0,33 -0,36 0,98 0,12 -0,23 3,18 1,37 -0,31 -0,33 -0,61 0,00 -0,70 -0,12 -0,26 0,82 -0,17 -0,25 0,16 0,03 0,17 0,25 0,04 1,27 -0,57 -1,67 -1,51

STM3816 STM2252 STM3817 STM2252 STM3817 STM2243 STM3818 STM2253 STM3818 STM3820 STM3820 STM3821 STM3821 STM3822 STM3822 STM3823 STM3823 STM3824 STM3824 STM3825 STM3825 STM3826 STM3826 STM3827 STM3827 STM3828 STM3828 STM3829 STM3829 STM3830 STM3830 STM3831 STM3831 STM3832 STM3832 STM3833 STM3833 STM3834 STM3834 STM3835 STM3835 STM3836 STM3836 STM3837 STM3837 STM3838 STM3838 STM3839 STM3839 STM3840 STM3840 STM3842 STM3842 STM3843 STM3843

288

ccmD ccmC ccmC ccmC ccmC ccmB ccmB ccmB ccmB STM3820 STM3820 torD torD torA torA torC torC torR torR torT torT torS torS dgoT dgoT dgoA dgoA dgoK dgoK dgoR dgoR yidA yidA STM3832 STM3832 STM3833 STM3833 STM3834 STM3834 gyrB gyrB recF recF dnaN dnaN dnaA dnaA rpmH rpmH rnpA rnpA yidC yidC trmE trmE

1,11 -0,17 -0,07 0,70 1,59 -1,19 0,90 -0,65 0,29 -1,96 -0,50 -0,06 1,48 0,35 0,94 2,10 3,78 -1,31 0,24 -0,78 -0,14 -0,10 0,15 0,69 3,14 1,92 1,99 1,03 3,07 1,20 2,36 -0,56 0,42 -0,37 0,74 0,39 1,44 -2,19 -1,20 -2,60 -0,38 -2,68 -3,28 -2,20 -1,04 -2,25 -1,33 0,23 -1,70 -3,30 -1,97 -1,99 0,16 0,03 0,78

-0,59 0,71 -0,03 -0,18 -0,26 0,78 1,09 0,40 1,20 -0,14 -0,85 0,00 0,00 -0,22 -1,45 0,42 -0,06 -1,05 -0,59 0,17 -0,27 0,22 -1,53 -0,77 -0,59 1,00 1,23 1,38 1,05 0,88 0,81 -0,24 1,18 -0,28 -0,61 0,30 -0,03 -1,62 -1,64 -1,89 -1,59 -1,81 -1,89 -1,11 -0,80 -0,79 -0,92 -1,70 -1,80 -2,16 -1,98 -2,02 -2,02 -0,60 -0,27

-0,19 -0,70 -1,73 -0,75 -0,55 -0,98 -1,49 -2,13 -0,61 -1,04 -0,53 -0,03 2,28 -1,25 -0,06 1,91 2,71 -1,52 0,30 -1,14 -0,67 0,12 0,40 0,38 0,21 3,00 3,27 2,93 4,08 2,87 3,56 0,67 1,67 -0,67 -0,19 -0,51 1,60 -2,88 -2,70 -3,56 -3,04 -2,17 -2,42 -3,56 -2,27 -2,04 -2,66 -2,95 -3,41 -5,67 -2,86 -2,08 -1,32 -0,72 0,71

Anexo IV

STM3845 STM3845 STM3846,s STM3846,s STM3847 STM3847 STM3848 STM3848 STM3849 STM3849 STM3850 STM3850 STM3851,S STM3851,S STM3852 STM3852 STM3858 STM3858 STM3859 STM3859 STM3860 STM3860 STM3861 STM3861 STM3862 STM3862 STM3863 STM3863 STM3864 STM3864 STM3865 STM3865 STM3866 STM3866 STM3867 STM3867 STM3868 STM3868 STM3869 STM3869 STM3870 STM3870 STM3871 STM3871 STM3871 STM3871 STM3872 STM3872 STM3873,S STM3873,S STM3874 STM3874 STM3875 STM3875 STM3876

STM3845 STM3845 STM3846,s STM3846,s yidY yidY yidZ yidZ yieE yieE yieF yieF yieG yieG yieH yieH STM3858 STM3858 aroE aroE STM3860 STM3860 glmS glmS glmU glmU STM3863 STM3863 atpC atpC atpD atpD atpG atpG atpA atpA atpH atpH atpF atpF atpE atpE atpB atpB atpB atpB atpI atpI gidB gidB gidA gidA mioC mioC asnC

1,02 1,59 -1,47 -2,27 2,01 2,26 -0,82 -0,21 -0,58 1,22 -1,58 -0,14 -0,28 0,23 -0,35 0,85 -0,68 1,05 -0,77 -0,16 -2,01 -1,86 -1,14 -0,69 -1,84 -2,15 -1,95 -2,05 -2,29 -1,83 -2,77 -0,85 -2,04 -1,78 -3,90 -3,01 -3,47 -3,17 -5,00 -3,65 -3,26 -2,57 -3,74 -2,00 -3,44 -1,98 -3,46 -2,42 -1,52 -0,68 -1,59 -1,02 -2,69 -1,08 -1,00

-0,06 -0,34 -0,07 0,03 -0,12 0,33 -1,22 -1,64 -0,47 -1,08 -0,36 0,12 0,26 0,21 -0,50 0,02 0,36 0,17 -1,21 -1,47 -1,90 -1,20 -0,81 -1,19 -2,14 -2,28 -1,31 -2,00 -1,29 -1,39 -1,26 -1,07 -1,98 -1,78 -2,40 -2,69 -2,90 -2,61 -3,45 -2,53 -3,19 -2,79 -2,98 -2,03 -2,74 -1,70 -2,50 -2,92 -1,41 -2,06 -1,10 -1,32 -0,93 -0,90 -0,62

2,18 2,80 -0,35 0,52 0,19 0,44 -1,51 -0,02 -0,09 -0,24 -1,66 -0,67 -1,16 -0,28 -1,54 -0,75 -0,91 -0,69 -0,76 0,73 -3,47 -1,92 -2,69 -3,07 -3,05 -2,31 -1,19 -1,70 -2,72 -3,91 -3,99 -3,20 -4,45 -3,71 -4,54 -4,84 -5,02 -5,24 -4,81 -5,49 -5,15 -5,47 -4,71 -2,36 -4,53 -2,88 -3,88 -4,15 -2,51 -1,86 -2,30 -1,73 -3,27 -2,40 -2,07

STM3876 STM3877 STM3877 STM3878,S STM3878,S STM3879 STM3879 STM3881 STM3881 STM3882 STM3882 STM3883 STM3883 STM3884 STM3884 STM3885 STM3885 STM3886 STM3886 STM3887 STM3887 STM3888 STM3888 STM3891 STM3891 STM3895 STM0265 STM0254 STM3895 STM0265 STM0254 STM3896 STM3896 STM3897 STM3897 STM3898 STM3898 STM3899 STM3899 STM3901 STM3901 STM3902 STM3902 STM3903 STM3903 STM3904 STM3904 STM3905 STM3905 STM3906 STM3906 STM3907 STM3907 STM3908 STM3908

289

asnC asnA asnA yieM yieM yieN yieN rbsD rbsD rbsA rbsA rbsC rbsC rbsB rbsB rbsK rbsK rbsR rbsR yieO yieO yieP yieP rrlC rrlC aspT aspV aspU aspT aspV aspU trpT trpT yifA yifA yifE yifE yifB yifB ilvG ilvG ilvM ilvM ilvE ilvE ilvD ilvD ilvA ilvA STM3906 STM3906 STM3907 STM3907 ilvY ilvY

0,61 -0,65 -0,01 -0,12 0,95 -0,31 -0,38 -2,03 -1,62 -1,47 -0,33 -2,38 -1,80 -1,57 -0,63 -1,89 -0,38 -0,33 -0,28 0,08 0,49 -2,17 -0,53 -2,04 -1,46 -1,47 -1,25 -0,60 -0,53 -0,65 -0,30 -1,16 -0,49 -1,11 -0,09 -3,02 -1,56 -1,06 -1,14 -0,79 0,69 0,16 0,52 0,30 1,78 -2,85 1,19 0,93 0,61 1,45 1,72 0,41 4,05 -0,39 0,39

-0,60 0,69 0,02 1,02 1,00 -0,04 -0,65 -4,58 -4,40 -3,68 -4,18 -3,16 -3,34 -0,78 -0,45 -2,16 -1,94 -2,09 -2,32 -1,91 -2,44 -0,60 -0,07 0,57 0,82 0,27 0,17 0,70 0,68 0,12 0,41 -0,18 -0,11 0,47 0,65 -2,07 -1,59 -0,45 -1,77 0,61 0,64 0,74 0,77 0,58 0,17 -0,49 -0,82 0,58 0,42 2,48 2,42 0,81 1,17 1,03 0,61

-1,32 -0,52 -0,88 -0,01 1,63 0,27 -1,29 -2,29 -1,90 -2,88 -2,56 -2,73 -1,90 -0,86 -0,09 -1,60 -0,68 -1,03 -0,48 -0,08 0,36 -0,01 0,54 0,12 0,98 0,20 0,19 0,10 0,30 -0,01 0,07 1,69 2,16 1,00 1,52 -1,44 -1,15 0,55 -1,67 -1,72 0,35 -1,36 0,24 -0,67 0,52 -2,26 -2,85 1,71 0,20 0,79 1,86 0,77 1,58 -1,23 -0,61

Anexo IV

STM3909 STM3909 STM3910 STM3910 STM3911 STM3911 STM3912 STM3912 STM3913 STM3913 STM3914 STM3914 STM3915 STM3915 STM3917 STM3917 STM3918 STM3918 STM3919 STM3919 STM3920 STM3920 STM3921 STM3921 STM3922 STM3922 STM3923 STM3923 STM3924 STM3924 STM3925 STM3925 STM3926 STM3926 STM3927 STM3927 STM3928 STM3928 STM3929 STM3929 STM3930 STM3930 STM3931 STM3931 STM3932 STM3932 STM3933 STM4553 STM4554 STM4555 STM3933 STM4553 STM4554 STM4555 STM3934

ilvC ilvC ppiC ppiC STM3911 STM3911 rep rep gppA gppA rhlB rhlB trxA trxA rho rho rfe rfe wzzE wzzE wecB wecB wecC wecC rffG rffG rffH rffH wecD wecD wecE wecE wzxE wzxE STM3927 STM3927 wecF wecF wecG wecG yifK yifK argX argX hisR hisR leuT leuV leuP leuQ leuT leuV leuP leuQ proM

0,09 1,05 -1,38 0,12 -0,49 0,28 0,06 0,97 -0,76 -0,51 -2,53 -2,20 -2,47 -1,99 -0,92 -0,75 -1,72 -1,18 -1,67 -1,28 -1,76 -1,66 -2,23 -1,62 -1,47 -0,76 -2,06 -2,05 -2,37 0,26 -1,35 -1,65 -1,63 -1,56 -0,99 0,16 -0,60 -0,39 -1,59 -1,78 -1,99 -1,21 -3,91 -2,72 -1,00 -0,09 -1,47 -1,05 -0,26 -1,07 -0,97 -0,17 0,95 -0,83 -2,20

1,02 0,46 -0,30 -0,49 -1,28 -0,74 0,40 0,18 -0,06 -0,29 -1,59 -1,88 -1,31 -1,08 -0,59 -0,68 -0,94 -0,78 -1,59 -1,60 -1,82 -1,89 -2,12 -1,78 -1,85 -2,05 -1,05 -1,99 -2,16 -1,89 -2,01 -2,18 -1,57 -2,05 -1,85 -1,59 -1,32 -1,59 -1,20 -1,81 -1,81 -1,50 -0,70 -0,48 0,03 0,23 -2,34 -2,11 -1,71 -2,26 -2,36 -2,19 -1,65 -2,30 -1,34

-0,97 -0,09 -1,85 -1,40 -1,89 -0,37 0,00 0,62 -1,54 -0,99 -2,43 -2,49 -2,26 -2,47 -1,80 -2,29 -1,85 -2,28 -2,12 -1,53 -1,37 -1,69 -3,36 -3,56 -2,13 -1,75 -2,54 -3,86 -2,97 -2,58 -2,16 -1,83 -1,03 -1,82 -1,97 0,05 -0,41 -0,87 -0,79 -1,93 -0,36 -0,36 1,43 1,97 2,92 3,86 -0,07 -0,05 0,23 -0,53 -0,56 -0,20 0,83 -0,40 0,83

STM3934 STM3935 STM3935 STM3936 STM3936 STM3937 STM3937 STM3938 STM3938 STM3939 STM3939 STM3940 STM3940 STM3941 STM3941 STM3943 STM3943 STM3944 STM3944 STM3946 STM3946 STM3947 STM3947 STM3948 STM3948 STM3949 STM3949 STM3950 STM3950 STM3951 STM3951 STM3953 STM3953 STM3955 STM3955 STM3956 STM3956 STM3957 STM3957 STM3958 STM3958 STM3959 STM3959 STM3960 STM3960 STM3961 STM3961 STM3962 STM3962 STM3963 STM3963 STM3964 STM3964 STM3965 STM3965

290

proM hemY hemY hemX hemX STM3937 STM3937 hemC hemC cyaA cyaA STM3940 STM3940 STM3941 STM3941 cyaY cyaY STM3944 STM3944 yifL yifL dapF dapF yigA yigA xerC xerC yigB yigB uvrD uvrD yigF yigF rarD rarD yigI yigI pldA pldA recQ recQ rhtC rhtC rthB rthB pldB pldB yigL yigL yigM yigM metR metR metE metE

-2,12 -2,03 -0,65 -2,39 -1,61 -3,02 -2,08 -2,66 -3,03 -0,10 0,07 -0,60 -0,89 -1,37 -0,77 -1,31 -0,18 -0,28 0,17 -0,41 0,18 -2,27 -1,84 -2,23 -0,93 -2,04 1,01 -1,03 -0,55 -1,56 -0,36 0,93 1,63 -0,88 0,93 -0,95 1,04 -1,29 0,00 -0,94 0,51 0,53 -0,02 -0,35 1,64 -1,08 -1,07 -0,86 -1,00 -0,52 0,11 -0,19 1,24 0,69 1,78

-1,99 -1,54 -1,89 -1,71 -1,75 -1,72 -1,27 -1,95 -2,11 -0,28 -0,55 -0,33 -0,50 0,08 -0,67 0,00 -0,91 -0,12 -0,08 0,05 -0,31 -0,63 -0,53 -0,78 -1,10 -1,13 -1,10 -1,19 -0,59 -0,13 -0,27 0,06 0,50 -1,53 -1,08 0,85 0,98 -0,55 -0,57 -0,34 -0,65 0,51 0,24 -0,19 -0,58 0,30 -0,28 -0,68 -0,38 -0,32 -0,12 1,12 0,87 0,19 -0,19

0,62 -1,96 -1,62 -2,21 -2,48 -1,37 -1,55 -1,62 -2,50 -0,13 1,55 -0,23 -0,41 -1,21 -0,92 -0,85 -0,81 -0,86 -0,18 -0,43 -0,14 -1,53 -1,10 -2,59 -1,88 -2,66 -2,54 -0,37 -0,52 -0,94 -0,51 1,10 0,31 -1,57 -1,38 -0,05 -0,30 -0,81 0,75 -1,22 -1,01 -0,43 -2,11 -1,42 0,02 -0,30 -1,94 -0,75 -1,87 0,51 -0,57 -1,57 -0,12 -0,81 0,40

Anexo IV

STM3966 STM3966 STM3967 STM3967 STM3968 STM3968 STM3969 STM3969 STM3970 STM3970 STM3971 STM3971 STM3972 STM3972 STM3973 STM3973 STM3974 STM3974 STM3975 STM3975 STM3976,S STM3976,S STM3977 STM3977 STM3978 STM3978 STM3979 STM3979 STM3981 STM3981 STM3984 STM3984 STM3985 STM3985 STM3987 STM3987 STM3991 STM4135 STM3991 STM4135 STM3894 STM4136 STM3992 STM0253 STM2656 STM3894 STM4136 STM3992 STM0253 STM2656 STM3993 STM3993 STM3994 STM3994 STM3995

STM3966 STM3966 dlhH dlhH udp udp yigN yigN ubiE ubiE yigP yigP aarF aarF tatA tatA tatB tatB tatC tatC yigW yigW rfaH rfaH yigC yigC ubiB ubiB STM3981 STM3981 pepQ pepQ yigZ yigZ hemG hemG rrlA rrlB rrlA rrlB rrfC rrfB rrfA rrfH rrfG rrfC rrfB rrfA rrfH rrfG mobB mobB mobA mobA yihD

1,15 1,15 0,47 0,88 -1,60 -0,42 -0,67 -0,59 -1,08 -0,07 -1,04 -0,51 0,55 1,45 -0,28 0,67 -1,73 0,80 -0,66 0,74 -1,27 -1,25 -1,64 -1,11 -1,46 -0,25 -1,44 -0,85 -0,36 1,02 -0,57 0,16 -1,37 -0,76 0,06 0,56 -2,25 -2,70 -2,94 -2,65 0,55 0,55 0,35 0,21 0,27 1,20 1,49 1,46 0,51 1,40 -0,93 -0,84 -1,25 -0,40 -1,27

0,93 0,65 1,10 1,48 -2,99 -2,80 -0,16 -0,39 -0,32 0,08 0,16 0,13 -0,32 0,30 0,09 0,09 -0,66 -0,14 -0,51 -0,41 0,14 -0,63 -1,07 -0,85 -0,95 -0,54 -1,35 -1,40 -0,06 0,44 -0,32 -0,59 -0,91 -0,78 0,71 0,41 0,04 -0,78 -0,04 -0,18 0,17 0,36 0,00 -0,15 0,14 0,43 -0,09 0,34 -0,17 0,40 -0,23 -0,03 -0,28 -0,25 -1,02

0,69 1,12 0,62 0,96 -2,36 -1,85 -0,70 -0,49 -1,82 -1,28 -1,64 -0,73 -2,04 -0,81 0,09 0,65 -1,86 -1,26 -1,37 -0,50 -1,76 -1,51 -0,71 -1,28 -2,50 -2,30 -0,87 -1,02 -0,22 0,47 -0,07 0,97 -0,76 -0,14 0,82 1,75 -0,83 -1,69 -1,95 -2,04 0,80 0,97 0,28 0,25 0,62 1,09 0,92 0,44 0,46 1,12 1,32 1,68 1,22 1,21 0,20

STM3995 STM3996 STM3996 STM3997 STM3997 STM3998 STM3998 STM3999 STM3999 STM4000 STM4000 STM4001 STM4001 STM4003 STM4003 STM4004 STM4004 STM4005 STM4005 STM4006 STM4006 STM4007 STM4007 STM4009 STM4009 STM4010 STM4010 STM4011 STM4011 STM4012 STM4012 STM4013,S STM4013,S STM4014 STM4014 STM4015 STM4015 STM4016 STM4016 STM4017 STM4017 STM4018 STM4018 STM4019 STM4019 STM4020,S STM4020,S STM4021 STM4021 STM4023 STM4023 STM4024,S STM4024,S STM4025 STM4025

291

yihD yihE yihE dsbA dsbA yihG yihG polA polA spf spf yihA yihA yihI yihI hemN hemN glnG glnG glnL glnL glnA glnA typA typA STM4010 STM4010 STM4011 STM4011 STM4012 STM4012 STM4013,S STM4013,S STM4014 STM4014 STM4015 STM4015 yshA yshA yihO yihO yihP yihP yihQ yihQ yihR yihR yihS yihS yihU yihU yihV yihV yihW yihW

-0,03 1,79 2,32 -1,95 -0,76 -1,62 -1,32 -1,15 0,24 -1,34 -1,15 -1,42 -1,52 -1,08 -0,49 -1,15 -1,34 -0,44 0,06 -1,27 -0,46 -1,28 -0,90 -1,17 -0,68 -1,62 -1,75 -1,51 -0,61 -0,84 1,51 -0,26 0,31 5,83 6,92 -1,09 -0,44 1,59 -0,52 0,26 1,37 1,43 2,18 0,73 0,59 -0,13 0,04 -0,74 0,27 -0,03 0,46 -0,25 0,07 -0,47 -0,33

-0,99 -0,25 -0,47 -0,42 -0,27 -0,51 -0,58 -0,33 -0,64 -0,73 -1,59 0,54 -0,41 -1,25 -1,05 -1,12 -0,63 -1,42 -0,83 -1,99 -2,05 -0,45 -0,28 -0,30 -0,14 -0,35 -0,72 -0,96 -1,02 -0,61 -0,34 -0,45 -2,23 4,51 2,60 0,59 -0,74 -0,86 -1,41 -0,45 -0,95 1,54 1,16 0,62 -0,39 -0,58 -0,15 -0,13 -1,13 -1,54 -0,80 -0,70 -1,13 -0,66 -0,37

0,55 0,12 0,89 -0,62 -0,97 -1,76 -1,13 -0,91 -0,44 -0,56 -0,45 -0,44 -0,67 -0,21 0,15 -1,51 -1,71 -0,40 -0,75 -1,87 -1,29 -3,45 -4,71 -0,79 -0,98 -1,15 -1,19 -1,78 -1,02 -0,03 0,83 0,35 0,40 4,31 4,65 -0,11 0,63 1,55 0,43 1,30 0,38 1,82 2,52 0,28 1,07 -0,41 -0,64 0,79 -0,24 -0,50 0,15 -0,42 -0,55 -0,24 0,76

Anexo IV

STM4026 STM4026 STM4027 STM4027 STM4028 STM4028 STM4029 STM4029 STM4030,S STM4030,S STM4031 STM4031 STM4032 STM4032 STM4032,2N STM4032,2N STM4033 STM4033 STM4034 STM4034 STM4035 STM4035 STM4036 STM4036 STM4037 STM4037 STM4038 STM4038 STM4039 STM4039 STM4040 STM4040 STM4041 STM4041 STM4042 STM4042 STM4042A STM4042A STM4043 STM4043 STM4044 STM4044 STM4045 STM4045 STM4046 STM4046 STM4047 STM4047 STM4048 STM4048 STM4049 STM4049 STM4050 STM4050 STM4051

yihX yihX rbn rbn yihZ yihZ yiiD yiiD STM4030,S STM4030,S STM4031 STM4031 STM4032 STM4032 STM4032,2N STM4032,2N STM4033 STM4033 fdhE fdhE fdoI fdoI fdoH fdoH fdoG fdoG fdhD fdhD STM4039 STM4039 yiiG yiiG STM4041 STM4041 STM4042 STM4042 STM4042A STM4042A yiiL yiiL STM4044 STM4044 rhaD rhaD rhaA rhaA rhaB rhaB rhaS rhaS rhaR rhaR rhaT rhaT STM4051

-1,06 -0,28 -0,29 0,45 -0,74 0,16 0,27 1,27 1,16 1,26 0,98 2,58 -1,09 1,13 0,74 1,25 -0,60 0,27 1,43 0,76 -0,45 0,43 -0,81 2,35 -3,06 -2,23 0,30 -0,94 -0,82 0,80 -0,39 0,52 -1,39 -0,11 0,62 0,32 -1,12 -0,09 -0,88 -1,99 0,54 1,40 -1,01 0,41 -0,04 1,38 -0,49 0,99 0,03 2,02 0,36 1,07 -0,72 0,89 -0,49

-0,94 -0,40 -0,64 -0,67 -0,75 -1,01 0,51 0,95 2,01 1,86 2,50 2,91 -0,35 -0,01 3,00 0,82 -0,23 -0,19 0,32 0,41 -1,39 -0,76 -2,33 -3,04 -2,42 -1,38 -2,12 -1,83 -0,33 0,26 -0,09 -0,24 -0,60 -0,82 -0,10 0,20 -0,46 0,33 -0,19 -0,18 -0,46 0,27 -0,04 -0,43 -0,60 0,09 0,73 -0,93 -0,74 -0,52 0,29 0,58 -0,07 0,07 0,35

-0,38 0,19 -1,14 -0,44 -1,50 -0,69 0,12 1,33 0,06 1,04 0,15 0,45 -0,22 0,85 0,97 1,50 -1,03 -0,62 -0,92 -0,60 -1,65 -1,27 -0,93 0,06 -2,62 -1,97 -1,50 -2,27 -0,67 -0,55 0,23 1,08 -1,14 -0,77 -1,23 -0,13 -0,65 -0,70 0,26 -2,07 0,51 0,31 -0,37 -0,31 -0,14 0,49 -0,46 1,86 -0,29 0,39 0,92 0,24 -0,85 0,30 -0,15

STM4051 STM4052 STM4052 STM4053 STM4053 STM4054 STM4054 STM4055 STM4055 STM4056,S STM4056,S STM4057 STM4057 STM4058 STM4058 STM4059 STM4059 STM4060 STM4060 STM4061 STM4061 STM4063 STM4063 STM4064 STM4064 STM4065 STM4065 STM4066 STM4066 STM4067 STM4067 STM4068 STM4068 STM4069 STM4069 STM4070 STM4070 STM4071 STM4071 STM4072 STM4072 STM4073 STM4073 STM4074 STM4074 STM4075 STM4075 STM4076 STM4076 STM4077 STM4077 STM4079,S STM4079,S STM4080 STM4080

292

STM4051 STM4052 STM4052 STM4053 STM4053 STM4054 STM4054 sodA sodA yiiM yiiM STM4057 STM4057 cpxA cpxA cpxR cpxR cpxP cpxP fieF fieF sbp sbp ushB ushB STM4065 STM4065 STM4066 STM4066 STM4067 STM4067 STM4068 STM4068 STM4069 STM4069 STM4070 STM4070 STM4071 STM4071 ydeV ydeV ydeW ydeW ego ego ydeY ydeY ydeZ ydeZ yneA yneA yneC yneC STM4080 STM4080

0,38 -0,40 0,84 0,37 0,46 -0,55 0,26 -3,04 -1,93 -1,05 -0,44 -1,46 -0,17 -1,27 0,25 -1,66 -1,18 1,58 2,67 -0,58 -0,39 1,12 -0,46 -1,24 -1,29 -0,75 0,03 -0,82 0,10 -2,17 -1,08 -1,36 -0,92 -0,13 -0,41 -0,51 0,38 0,28 1,66 0,02 2,22 -0,26 -0,20 -0,79 -0,17 2,41 3,51 0,33 0,75 -0,60 0,91 -1,38 -0,37 -1,51 -1,24

0,05 0,47 -1,04 0,29 -1,38 -0,71 -1,63 -1,42 -1,46 -0,33 -0,58 -0,70 -0,64 -0,22 -0,03 0,19 0,42 4,60 4,36 0,06 0,58 0,46 -0,88 -0,78 -0,45 -1,33 -0,69 -0,24 -0,78 -0,64 -0,92 -1,09 -0,63 0,16 -0,91 0,55 0,63 -0,59 -0,09 1,44 1,06 0,53 1,28 0,10 -0,05 0,12 0,53 2,27 1,96 1,60 2,04 0,98 0,39 -0,54 -0,21

1,72 0,25 -1,26 0,84 0,09 0,07 -0,10 -0,08 -0,18 -0,09 -0,16 -1,38 0,02 -1,77 -0,64 -1,77 -1,42 4,01 4,64 -1,11 -0,57 0,31 -0,43 -2,85 -4,82 -1,22 0,58 -0,65 -0,68 -1,55 -1,83 -1,28 -0,75 -0,68 -0,83 -1,10 -0,85 -1,37 0,75 -0,14 2,31 0,60 0,24 -0,12 -1,22 1,49 3,62 2,48 1,92 1,05 1,53 -0,18 -0,28 -2,33 -2,27

Anexo IV

STM4082 STM4082 STM4083 STM4083 STM4084 STM4084 STM4085 STM4085 STM4086 STM4086 STM4087 STM4087 STM4088 STM4088 STM4089 STM4089 STM4090 STM4090 STM4091 STM4091 STM4092 STM4092 STM4093 STM4093 STM4094 STM4094 STM4095 STM4095 STM4097 STM4097 STM4098 STM4098 STM4099 STM4099 STM4100 STM4100 STM4101 STM4101 STM4102 STM4102 STM4103 STM4103 STM4104 STM4104 STM4105 STM4105 STM4106 STM4106 STM4107 STM4107 STM4108 STM4108 STM4109 STM4109 STM4110

yiiQ yiiQ yiiR yiiR fpr fpr glpX glpX glpK glpK glpF glpF yiiU yiiU menG menG menA menA hslU hslU hslV hslV ftsN ftsN cytR cytR priA priA STM4097 STM4097 STM4098 STM4098 metJ metJ metB metB metL metL STM4102 STM4102 STM4103 STM4103 STM4104 STM4104 metF metF katG katG yijF yijF gldA gldA talC talC ptsA

-2,25 -1,29 0,32 1,10 2,31 3,16 -2,38 -1,05 -2,24 -0,66 -2,20 -2,30 -0,83 0,31 -0,80 0,09 -1,24 -1,39 -1,04 -0,55 -2,78 -2,02 -1,26 2,36 -1,16 -1,57 -1,74 -2,06 -1,28 -0,57 0,02 0,54 -0,71 -0,56 -1,52 0,07 -1,07 0,15 0,93 1,15 4,43 0,88 0,28 0,84 -0,08 0,09 1,91 2,33 -0,09 1,28 -0,74 0,10 -0,04 -0,09 0,16

-1,48 -1,12 -0,24 -0,14 -0,05 -0,66 -0,46 -0,18 2,12 2,24 1,28 1,50 0,00 0,05 0,63 0,72 -0,72 -1,09 -1,06 -1,00 -0,51 -0,02 -1,49 -0,90 -2,34 -2,38 -1,70 -1,90 -0,74 0,05 0,64 0,40 -0,82 -0,44 -0,38 -0,61 0,27 -1,17 -0,72 -0,45 3,49 0,69 0,73 -0,37 0,43 0,87 -0,29 2,79 -0,10 -0,76 -0,98 -0,72 0,30 0,60 -0,11

-2,49 -2,64 0,41 1,27 1,18 1,00 -1,88 -1,99 0,86 1,59 1,53 1,96 -0,12 0,81 -0,07 0,98 -1,03 -2,17 -1,61 -2,22 -2,14 -1,61 -2,12 -1,24 -1,80 -2,11 -2,08 -1,47 -1,31 -0,25 -1,53 0,09 -0,45 0,04 -1,54 -0,90 -1,73 -2,20 -1,04 0,00 3,25 2,53 0,66 1,19 0,35 0,12 1,83 1,41 -1,67 1,00 -0,37 0,07 0,50 0,74 -0,34

STM4110 STM4112 STM4112 STM4113 STM4113 STM4114 STM4114 STM4115 STM4115 STM4116 STM4116 STM4117 STM4117 STM4118 STM4118 STM4119 STM4119 STM4120 STM4120 STM4121 STM4121 STM4122 STM4122 STM4123 STM4123 STM4125 STM4125 STM4126 STM4126 STM4127 STM4127 STM4128 STM4128 STM4129 STM4129 STM4130 STM4130 STM4131 STM4131 STM3988 STM2659 STM4132 STM4177 STM3889 STM3398 STM3988 STM2659 STM4132 STM4177 STM3889 STM3398 STM0250 STM4133 STM3989 STM0250

293

ptsA frwC frwC frwB frwB pflD pflD pflC pflC frwD frwD yijO yijO yijP yijP ppc ppc argE argE argC argC argB argB argH argH oxyR oxyR udhA udhA yijC yijC yijD yijD trmA trmA btuB btuB murI murI rrsA rrsG rrsB rrsE rrsC rrsD rrsA rrsG rrsB rrsE rrsC rrsD ileV ileU ileT ileV

1,01 -0,71 0,59 0,46 1,01 -0,81 0,20 0,71 0,48 0,52 -0,12 -0,35 -0,19 -1,68 -1,75 -1,47 -0,77 -1,48 -2,08 -0,41 0,14 -1,11 -1,02 -0,10 1,15 -0,47 0,38 -1,75 -0,84 -2,16 -0,69 -1,51 0,46 1,14 2,67 -0,83 -1,48 -1,83 -0,34 -2,05 -2,55 -2,49 -2,10 -2,53 -1,48 -2,12 -2,10 -1,89 -1,62 -2,08 -1,51 0,95 0,63 1,18 1,66

-0,18 0,37 0,21 -0,27 0,17 -0,40 0,25 0,51 0,12 0,25 -0,26 0,53 -0,26 -0,87 -1,94 -1,39 -1,25 0,12 0,28 -0,81 -0,55 0,08 0,57 -0,67 0,10 0,57 0,94 0,37 0,72 0,42 0,07 -0,70 -0,05 -0,93 0,66 -0,96 -1,13 -0,19 0,20 -0,16 -0,50 0,42 0,16 1,13 0,61 0,25 0,66 0,81 0,61 0,73 0,00 0,51 0,47 0,48 0,84

0,80 -0,81 0,01 -0,12 0,72 -0,31 -0,37 0,40 0,58 0,33 1,31 0,64 0,76 -0,75 -3,77 -1,82 -2,03 -0,95 -1,92 -0,38 -0,35 -0,22 -0,36 -0,11 0,63 -1,42 -1,00 -0,75 -0,83 -1,67 -0,37 -2,48 -1,49 -1,16 1,51 0,02 0,60 0,89 1,54 0,00 0,23 -0,60 0,01 -0,86 0,07 -0,52 -0,24 -0,01 0,75 -0,27 0,70 1,26 0,83 1,16 1,19

Anexo IV

STM4133 STM3989 STM0251 STM3990 STM4134 STM0251 STM3990 STM4134 STM4135 STM4135 STM4138 STM4138 STM4139 STM4139 STM4142 STM4142 STM4143 STM4143 STM4144 STM4144 STM4145 STM4145 STM4146 STM4146 STM4147 STM4147 STM4148 STM4148 STM4149 STM4149 STM4150 STM4150 STM4151 STM4151 STM4152 STM4152 STM4153 STM4153 STM4154 STM4154 STM4155 STM4155 STM4156 STM4156 STM4158 STM4158 STM4159 STM4159 STM4160 STM4160 STM4161 STM4161 STM4162 STM4162 STM4163

ileU ileT alaV alaT alaV alaT rrlB rrlB birA birA coaA coaA thrU thrU tyrU tyrU glyT glyT thrT thrT tuf tuf secE secE nusG nusG rplK rplK rplA rplA rplJ rplJ rplL rplL rpoB rpoB rpoC rpoC STM4155 STM4155 STM4156 STM4156 STM4158 STM4158 thiH thiH thiG thiG STM4161 STM4161 thiF thiF thiE

1,23 1,20 0,75 1,41 1,36 1,55 1,67 0,88 -2,74 -2,96 -1,02 -0,90 -1,94 -1,39 -3,69 -2,98 -0,52 1,15 -4,73 -4,48 -1,54 -1,57 -2,89 -2,05 3,40 2,31 -2,94 -2,39 -3,32 -2,24 -3,73 -3,81 -2,84 -2,61 -0,79 -0,19 -2,63 -3,71 -1,96 -1,61 -1,36 -1,01 -1,13 -0,70 0,10 1,80 0,23 1,68 0,07 2,12 0,72 0,89 0,47 0,88 -0,23

0,32 0,10 0,25 0,71 0,46 0,87 0,86 0,24 -0,13 -0,25 -1,33 -1,56 -2,20 -2,06 -1,09 -0,65 -1,15 -1,16 -3,11 -3,19 -1,64 -1,57 -1,26 -1,57 -0,99 -1,41 -2,03 -1,62 -1,47 -1,31 -2,43 -2,27 -1,15 -0,59 0,67 0,70 -1,36 -1,22 -0,71 -0,64 -1,18 -1,07 -1,37 -0,86 -1,29 -0,30 0,72 1,42 1,90 2,16 1,76 2,09 2,90 2,68 1,82

0,86 1,21 0,73 0,45 0,21 0,65 0,25 0,39 -1,90 -1,54 -1,34 -0,26 -1,79 -0,92 1,29 1,59 -0,37 0,39 -3,31 -3,71 -1,76 -1,89 -5,22 -4,47 1,79 -0,50 -3,19 -3,69 -5,17 -4,97 -6,17 -6,77 -5,37 -5,20 -3,32 -3,34 -3,98 -4,09 -1,30 -1,17 -1,10 -1,15 -1,47 -0,69 -1,82 -0,54 0,13 -0,63 -0,37 -0,40 -0,90 -1,57 -1,50 -0,34 -0,18

STM4163 STM4164 STM4164 STM4165 STM4165 STM4166 STM4166 STM4167 STM4167 STM4168 STM4168 STM4169 STM4169 STM4170 STM4170 STM4171 STM4171 STM4172 STM4172 STM4173 STM4173 STM4174 STM4174 STM4175 STM4175 STM4176 STM4176 STM3397 STM2658 STM4178 STM3890 STM3397 STM2658 STM4178 STM3890 STM3393 STM4180 STM3393 STM4180 STM4181 STM4181 STM4182 STM4182 STM4186 STM4186 STM4188,S STM4188,S STM4189 STM4189 STM4190 STM4190 STM4191 STM4191 STM4192 STM4192

294

thiE thiC thiC rsd rsd nudC nudC hemE hemE nfi nfi yjaG yjaG hupA hupA yjaH yjaH zraP zraP hydH hydH hydG hydG purD purD purH purH gltW gltV gltU gltW gltV gltU rrfF rrfE rrfF rrfE yjaB yjaB metA metA STM4186 STM4186 metH metH yjbB yjbB pepE pepE STM4191 STM4191 STM4192 STM4192

0,58 -0,64 -0,02 0,76 1,02 -0,76 -0,68 -1,12 -1,30 -0,47 0,07 -1,39 -0,18 -3,99 -4,57 5,03 0,73 -0,82 -0,17 -1,14 -0,27 -0,68 -0,24 -1,07 -0,38 -1,44 0,62 1,17 1,36 1,69 1,25 1,82 2,01 1,76 1,45 0,39 0,32 1,32 0,65 -0,83 -1,48 -0,61 -0,61 -0,03 0,98 -0,40 1,79 -0,79 -0,04 1,36 1,94 -0,29 1,06 -1,68 -1,16

1,93 1,73 1,89 1,55 1,40 -0,61 -0,85 -0,67 -0,59 -0,92 -0,66 -0,82 -0,55 -2,74 -2,53 -0,05 0,06 0,89 0,81 -0,62 -0,70 -0,26 -1,02 -0,72 0,00 0,42 0,87 0,64 0,82 0,91 0,94 0,47 0,94 0,72 0,37 -0,13 -0,40 -0,15 -0,63 -0,46 0,08 -0,83 -1,20 -0,38 -0,64 0,01 -1,00 -0,18 -0,64 -1,31 -1,33 -0,52 -0,92 -0,83 -0,81

-0,15 -1,46 -1,59 1,04 1,65 -0,67 -0,96 -1,85 -1,29 -1,46 -1,59 -2,65 -1,86 -4,10 -4,96 1,34 0,45 -0,93 -0,96 -1,44 -0,81 -0,82 -2,52 -1,28 -1,19 -0,17 0,06 1,13 1,14 1,11 0,99 1,24 1,48 1,28 1,73 0,30 0,39 0,12 0,27 1,47 1,26 0,21 0,17 -0,41 0,82 0,09 0,43 0,07 0,24 -1,37 0,10 -0,22 0,71 -1,66 -1,19

Anexo IV

STM4193 STM4193 STM4194 STM4194 STM4195 STM4195 STM4196 STM4196 STM4198 STM4198 STM4199 STM4199 STM4200 STM4200 STM4201 STM4201 STM4202 STM4202 STM4203 STM4203 STM4204 STM4204 STM4205 STM4205 STM4206 STM4206 STM4207 STM4207 STM4208 STM4208 STM4209 STM4209 STM4210 STM4210 STM4211 STM4211 STM4212 STM4212 STM4213 STM4213 STM4214 STM4214 STM4215 STM4215 STM4216 STM4216 STM4217 STM4217 STM4218 STM4218 STM4219,S STM4219,S STM4220 STM4220 STM4222,S

yjbC yjbC yjbD yjbD STM4195 STM4195 STM4196 STM4196 STM4198 STM4198 STM4199 STM4199 STM4200 STM4200 STM4201 STM4201 STM4202 STM4202 STM4203 STM4203 STM4204 STM4204 STM4205 STM4205 STM4206 STM4206 STM4207 STM4207 STM4208 STM4208 STM4209 STM4209 STM4210 STM4210 STM4211 STM4211 STM4212 STM4212 STM4213 STM4213 STM4214 STM4214 STM4215 STM4215 STM4216 STM4216 STM4217 STM4217 STM4218 STM4218 STM4219,S STM4219,S lysC lysC yjbE

-1,24 -0,49 -1,06 -0,26 -0,21 1,88 0,31 1,81 0,47 1,20 1,61 1,99 -0,15 0,80 -0,69 0,50 0,16 1,47 0,62 1,49 0,18 0,67 3,94 2,65 -1,18 -1,15 0,09 2,35 1,02 1,43 0,80 0,59 -0,23 -0,11 0,15 1,15 -0,14 -1,13 0,03 1,17 0,97 3,27 1,38 2,47 0,35 1,87 -0,30 0,64 -1,40 -0,33 -0,65 0,68 -0,48 1,75 -0,16

-0,53 -0,76 -0,31 -0,73 1,06 1,05 0,39 0,36 0,07 0,20 -1,53 -2,05 -0,44 -0,12 0,85 -0,51 0,31 -0,35 -0,20 -1,24 0,07 -0,63 -1,03 -0,45 -0,87 -1,31 1,04 0,51 -0,52 -0,50 -0,35 -0,14 -0,36 -1,26 -0,93 -1,41 0,07 -0,43 -1,24 0,03 0,45 0,16 0,30 0,02 0,86 0,63 -1,36 -0,94 -1,54 -2,06 0,44 0,37 -0,19 -0,33 -1,09

-0,83 -0,95 -0,99 -1,09 0,29 0,72 0,06 1,48 -0,16 0,98 -0,97 0,31 -0,66 0,16 -0,99 -0,23 -0,04 0,56 -0,58 -0,32 0,37 1,61 1,85 2,01 -0,64 -1,11 -0,55 0,17 -0,31 0,32 -0,29 1,23 -0,71 -1,04 -1,01 -0,21 -0,07 0,15 -1,02 0,09 0,68 1,70 -0,34 0,52 0,21 2,51 -1,05 1,04 -1,41 -1,31 -0,80 0,61 -1,19 -0,65 -1,44

STM4222,S STM4223 STM4223 STM4224 STM4224 STM4225 STM4225 STM4226 STM4226 STM4227 STM4227 STM4228 STM4228 STM4229 STM4229 STM4230 STM4230 STM4231 STM4231 STM4232 STM4232 STM4233 STM4233 STM4234 STM4234 STM4235 STM4235 STM4236 STM4236 STM4237 STM4237 STM4238 STM4238 STM4240 STM4240 STM4241 STM4241 STM4242 STM4242 STM4243 STM4243 STM4244 STM4244 STM4245 STM4245 STM4246 STM4246 STM4247 STM4247 STM4248 STM4248 STM4249 STM4249 STM4250 STM4250

295

yjbE yjbF yjbF yjbG yjbG yjbH yjbH yjbA yjbA malG malG malF malF malE malE malK malK lamB lamB malM malM ubiC ubiC ubiA ubiA plsB plsB dgkA dgkA lexA lexA dinF dinF yjbJ yjbJ zur zur STM4242 STM4242 yjbN yjbN pspG pspG qor qor dnaB dnaB alr alr tyrB tyrB aphA aphA yjbQ yjbQ

0,35 0,17 1,50 1,23 1,65 0,25 2,32 -0,14 0,21 0,41 1,04 -0,31 0,26 -0,88 0,19 -0,55 0,39 -0,74 0,40 -1,73 -0,26 -1,47 0,41 -1,17 -0,07 -1,47 -0,28 -0,90 -0,87 -0,86 0,63 -0,96 0,01 1,11 1,95 -0,53 0,15 1,40 1,64 -1,08 -1,02 0,20 1,26 -0,01 0,86 -1,63 -2,47 -0,23 0,08 0,56 0,64 -0,85 -0,15 0,17 0,51

-1,36 0,11 -0,61 -1,03 -1,25 0,15 0,62 -0,44 -0,96 -1,46 -2,45 -0,72 -0,67 -1,50 -1,79 -2,04 -1,56 -1,56 -1,30 -1,25 -1,50 -1,29 -0,96 -0,75 -0,52 -1,31 -1,08 -0,93 -0,65 0,29 -0,11 0,66 0,51 2,29 2,22 0,73 1,06 0,28 -0,72 0,19 -0,44 1,08 1,09 0,53 0,99 -0,69 -1,69 0,34 -0,14 -1,17 -1,19 0,67 0,71 1,77 1,61

-0,81 0,10 0,67 -0,83 0,18 -0,79 0,16 0,04 -0,20 -2,14 -0,50 -0,52 0,35 -0,96 -0,62 -1,51 -0,56 -1,16 -0,84 -0,43 0,19 0,97 2,11 -0,71 0,35 -1,36 -0,09 -1,52 -1,30 -1,18 -0,47 2,55 2,53 8,06 8,78 4,22 4,48 1,21 0,72 0,47 0,09 0,43 1,30 3,00 1,95 -0,86 -1,16 -1,13 -0,34 0,07 1,67 -1,67 -0,32 1,39 2,08

Anexo IV

STM4251 STM4251 STM4252 STM4252 STM4253 STM4253 STM4254 STM4254 STM4256 STM4256 STM4263 STM4263 STM4264 STM4264 STM4265 STM4265 STM4266 STM4266 STM4267 STM4267 STM4268 STM4268 STM4269 STM4269 STM4270 STM4270 STM4271 STM4271 STM4272 STM4272 STM4273 STM4273 STM4274 STM4274 STM4277 STM4277 STM4278,S STM4278,S STM4279 STM4279 STM4280 STM4280 STM4281 STM4281 STM4282 STM4282 STM4283 STM4283 STM4284 STM4284 STM4285 STM4285 STM4286 STM4286 STM4287,S

yjbR yjbR STM4252 STM4252 STM4253 STM4253 uvrA uvrA ssb ssb yjcB yjcB yjcC yjcC soxS soxS soxR soxR STM4267 STM4267 yjcD yjcD yjcE yjcE STM4270 STM4270 STM4271 STM4271 STM4272 STM4272 actP actP yjcH yjcH nrfA nrfA nrfB nrfB nrfC nrfC nrfD nrfD nrfE nrfE nrfG nrfG gltP gltP yjcO yjcO fdhF fdhF lpxO lpxO phnO

-0,39 0,25 -0,34 0,37 -0,08 0,63 -0,85 1,12 -0,72 -0,08 0,57 1,43 -0,97 -0,80 -1,18 -0,03 -0,35 -0,39 -0,55 0,71 -0,71 -0,70 1,37 1,65 -0,99 -0,66 0,64 0,76 0,34 3,11 -0,42 1,27 2,27 0,93 0,19 1,14 0,12 1,57 -0,04 1,55 -0,53 1,96 -0,09 1,73 -0,79 0,10 -0,18 0,62 -0,75 -0,47 0,56 1,31 0,84 0,54 -1,09

1,28 1,00 1,20 0,83 -0,48 -0,20 -0,18 -0,19 0,44 0,73 2,18 1,93 0,18 0,29 0,82 0,84 0,42 0,56 1,03 1,12 0,06 0,07 0,90 0,35 -0,64 -1,28 -1,23 -1,67 -0,47 -0,82 -0,66 0,22 -0,82 -1,80 -0,95 -2,14 -0,90 -1,06 -1,01 -0,11 -1,58 -1,55 -2,05 -3,07 -0,74 -0,16 -0,12 -0,49 -0,96 -0,67 0,13 -0,01 -0,78 -0,71 -0,57

0,22 -0,02 0,15 0,65 -0,97 -0,25 -1,27 -1,49 -1,25 -0,25 -1,16 -0,48 -0,06 -0,71 -0,33 0,57 0,10 0,56 0,33 1,05 -1,31 -0,57 1,62 1,21 -1,38 -0,23 0,36 1,28 -0,18 0,07 -0,52 0,55 0,23 0,96 -0,57 0,58 -0,82 -0,53 -0,66 0,47 -1,52 -0,28 -2,17 -1,37 -1,20 -1,13 -1,11 -0,36 -1,27 -1,34 0,11 0,88 -1,28 -0,53 -0,56

STM4287,S STM4288 STM4288 STM4289 STM4289 STM4290 STM4290 STM4291 STM4291 STM4292 STM4292 STM4293 STM4293 STM4294 STM4294 STM4295 STM4295 STM4296 STM4296 STM4297 STM4297 STM4298 STM4298 STM4299 STM4299 STM4301 STM4301 STM4302 STM4302 STM4303 STM4303 STM4304 STM4304 STM4305,S STM4305,S STM4306 STM4306 STM4307 STM4307 STM4308 STM4308 STM4309 STM4309 STM4310 STM4310 STM4312 STM4312 STM4313 STM4313 STM4314 STM4314 STM4315 STM4315 STM4317 STM4317

296

phnO phnB phnB phnA phnA proP proP basS basS basR basR yjdB yjdB yjdE yjdE adiY adiY adi adi melR melR melA melA melB melB dcuB dcuB STM4302 STM4302 dcuR dcuR dcuS dcuS STM4305,S STM4305,S STM4306 STM4306 STM4307 STM4307 STM4308 STM4308 STM4309 STM4309 STM4310 STM4310 STM4312 STM4312 STM4313 STM4313 STM4314 STM4314 STM4315 STM4315 STM4317 STM4317

0,38 -0,87 1,02 -0,83 -0,23 -0,64 -0,27 -0,67 -0,15 -1,81 -0,15 -1,07 0,02 -0,97 0,00 0,35 1,35 -0,56 0,98 -0,61 0,36 -0,60 0,25 -0,59 1,31 -0,41 -0,30 0,06 1,51 -1,23 0,29 -1,58 -1,22 0,34 0,67 1,03 1,88 -0,34 1,40 -0,41 0,41 1,42 1,63 2,31 1,73 0,41 1,25 -0,20 0,82 -1,29 0,09 1,60 1,91 0,65 1,28

-0,29 -0,08 0,48 0,23 0,28 0,60 0,20 0,15 1,22 -0,67 -0,51 0,99 1,28 0,61 0,60 0,22 0,12 0,38 0,14 -0,14 -1,22 -0,44 -1,46 -0,14 -1,31 -0,64 -0,92 0,77 -1,27 0,61 -1,64 0,13 -0,65 1,65 -0,92 -0,84 -1,76 -0,56 -0,65 -0,62 -0,62 0,13 -0,18 0,12 -0,33 0,65 1,19 0,20 0,99 0,64 0,45 -1,10 -1,42 1,44 1,39

0,16 0,77 2,09 -0,44 0,18 -0,17 0,79 -1,02 -0,31 -1,25 -0,98 -1,88 -0,94 -0,78 -0,35 -0,88 -0,12 -0,10 0,67 0,87 -0,27 -0,80 -0,82 -0,73 -0,91 -0,61 -0,32 1,82 1,55 0,10 -2,66 -0,46 -0,92 -0,01 0,04 -0,62 1,11 -1,49 -0,68 -0,75 -0,38 0,91 1,76 0,91 1,54 1,53 1,21 1,49 1,26 -0,45 -0,18 1,50 2,92 -0,95 0,26

Anexo IV

STM4318 STM4318 STM4319 STM4319 STM4322 STM4322 STM4323 STM4323 STM4324 STM4324 STM4325 STM4325 STM4326 STM4326 STM4327 STM4327 STM4328 STM4328 STM4329 STM4329 STM4330 STM4330 STM4331 STM4331 STM4332 STM4332 STM4333 STM4333 STM4334 STM4334 STM4335 STM4335 STM4337 STM4337 STM4338 STM4338 STM4339 STM4339 STM4340 STM4340 STM4341 STM4341 STM4342 STM4342 STM4343 STM4343 STM4344 STM4344 STM4345 STM4345 STM4346 STM4346 STM4347 STM4347 STM4348

STM4318 STM4318 phoN phoN yjdC yjdC dsbD dsbD cutA cutA dcuA dcuA aspA aspA fxsA fxsA yjeH yjeH groES groES groEL groEL yjeI yjeI yjeJ yjeJ yjeK yjeK efp efp ecnA ecnA ecnR ecnR sugE sugE blc blc frdD frdD frdC frdC frdB frdB frdA frdA yjeA yjeA yjeM yjeM yjeO yjeO yjeP yjeP psd

-0,10 0,78 2,41 3,43 -0,55 0,96 -1,26 0,33 1,29 1,69 -0,12 -0,51 -0,55 -0,25 -2,37 -1,29 -1,67 -0,60 -0,25 0,16 -1,48 -1,03 -0,92 -0,47 -1,39 -0,26 -0,24 0,39 -2,18 -2,31 -0,97 0,09 -1,55 -1,22 -1,46 -0,40 -0,12 1,09 -1,07 -0,14 -1,63 -0,67 -1,37 -0,45 0,39 1,18 2,57 0,99 -1,01 0,78 -0,83 0,23 -1,08 0,57 0,42

0,94 0,31 0,82 0,55 -0,31 0,17 0,00 0,52 0,12 0,02 -0,29 -1,08 0,77 0,68 -0,90 -0,67 -0,80 -1,42 0,87 0,89 0,66 1,32 0,27 0,83 -0,44 0,10 -0,74 -0,82 -1,62 -1,72 -1,49 -2,02 -0,55 -0,99 0,01 -0,11 -0,28 -0,09 -1,13 -1,08 -0,94 -0,44 -1,19 -1,26 -1,04 -1,13 -1,39 -1,60 -0,58 -1,55 -1,15 -1,21 -1,66 -1,60 -0,28

0,23 -0,84 0,00 1,04 -0,32 0,20 -1,40 -0,89 -0,77 1,26 0,30 -0,29 0,32 0,16 -2,39 -0,70 -1,48 -2,43 -3,26 -3,08 -2,41 -3,13 -1,22 -0,71 -2,51 -2,26 -1,94 -1,21 -2,65 -2,44 -0,76 -1,22 0,22 0,07 0,00 -0,23 0,66 1,73 -1,20 -0,30 -0,02 -0,98 -1,05 -2,71 -0,30 0,41 -0,27 0,04 -0,94 -0,57 -1,23 -1,50 -2,12 -0,22 -1,58

STM4348 STM4349 STM4349 STM4350 STM4350 STM4351 STM4351 STM4355,S STM4355,S STM4356 STM4356 STM4357 STM4357 STM4358 STM4358 STM4359 STM4359 STM4360 STM4360 STM4361 STM4361 STM4362 STM4362 STM4363 STM4363 STM4364 STM4364 STM4365 STM4365 STM4366 STM4366 STM4367 STM4367 STM4368 STM4368 STM4369 STM4369 STM4370 STM4370 STM4371 STM4371 STM4372 STM4372 STM4373 STM4373 STM4374 STM4374 STM4375 STM4375 STM4376 STM4376 STM4377 STM4377 STM4378 STM4378

297

psd yjeQ yjeQ orn orn STM4351 STM4351 yjeS yjeS yjeF yjeF yjeE yjeE amiB amiB mutL mutL miaA miaA hfq hfq hflX hflX hflK hflK hflC hflC yjeT yjeT purA purA yjeB yjeB vacB vacB yjfH yjfH yjfI yjfI yjfJ yjfJ STM4372 STM4372 yjfK yjfK yjfL yjfL yjfM yjfM yjfC yjfC aidB aidB yjfN yjfN

0,91 -0,81 -1,69 -0,69 0,23 -1,35 -1,64 -1,51 0,10 2,63 2,41 -1,19 -0,88 -2,49 -1,52 -0,04 0,09 -2,57 -1,48 -2,89 -1,72 -0,93 0,03 -0,13 0,79 -0,21 1,08 -0,91 -0,20 -1,67 -1,42 -1,32 -0,91 0,39 1,14 -1,11 -0,21 0,06 -0,21 0,68 0,37 0,52 1,59 -0,33 1,23 0,17 2,29 0,07 1,07 0,54 0,83 2,47 2,52 1,91 1,32

-0,54 -1,07 -1,13 -0,66 -1,01 -0,51 -0,75 -0,51 -0,57 0,15 0,19 -0,28 -0,51 -0,88 -0,27 1,30 1,41 -0,13 0,17 -0,72 -0,52 0,57 0,76 0,58 0,90 0,67 0,56 -0,43 -0,39 0,35 -0,34 0,46 0,12 -0,10 -0,01 -0,60 -0,52 -0,53 -1,24 -1,86 -1,80 0,17 0,09 0,28 0,25 -0,13 -0,51 0,41 0,28 0,91 1,08 -1,41 -1,96 2,89 2,44

-0,73 -0,67 -0,86 -0,80 -0,55 -1,40 -2,06 -1,12 -0,65 0,28 1,55 -1,26 -1,20 -1,81 -1,44 -0,75 -0,25 -1,70 -1,38 -2,12 -1,94 -1,36 -0,57 -2,52 -2,27 -2,09 -1,94 -2,73 -1,56 -0,63 -1,60 -0,20 -0,04 0,35 0,95 -0,88 -0,85 -0,53 0,09 -1,27 -0,26 0,98 1,01 -0,08 -0,33 0,66 0,28 -1,64 0,02 0,17 0,45 0,31 1,42 3,74 3,30

Anexo IV

STM4379 STM4379 STM4380 STM4380 STM4381 STM4381 STM4382 STM4382 STM4383,S STM4383,S STM4384 STM4384 STM4385 STM4385 STM4386 STM4386 STM4387 STM4387 STM4388 STM4388 STM4389 STM4389 STM4391 STM4391 STM4393 STM4393 STM4394 STM4394 STM4395 STM4395 STM4396 STM4396 STM4397 STM4397 STM4398 STM4398 STM4399 STM4399 STM4400 STM4400 STM4401 STM4401 STM4402 STM4402 STM4403 STM4403 STM4404 STM4404 STM4405 STM4405 STM4406,S STM4406,S STM4407 STM4407 STM4408

yjfO yjfO yjfP yjfP yjfQ yjfQ yjfR yjfR ulaA ulaA sgaB sgaB ptxA ptxA sgaH sgaH sgaU sgaU sgaE sgaE yjfY yjfY rpsF rpsF rpsR rpsR rplI rplI yifZ yifZ ytfB ytfB fklB fklB cycA cycA ytfE ytfE ytfF ytfF ytfG ytfG ytfH ytfH cpdB cpdB cysQ cysQ ytfJ ytfJ ytfK ytfK ytfL ytfL msrA

-0,55 -0,11 0,84 0,85 -1,21 0,43 -0,29 -0,48 0,28 0,74 0,31 1,49 0,86 0,74 0,54 0,47 -0,52 1,59 -2,21 -2,50 -2,38 -0,52 -4,51 -4,73 -3,27 -2,01 -3,24 -2,66 -0,59 0,30 -0,72 -0,19 -1,64 -0,85 -0,28 1,63 0,75 2,16 1,60 1,62 1,11 2,99 0,63 0,23 1,32 0,49 -1,32 -0,17 -0,05 0,25 2,32 -0,41 -1,07 0,48 -0,45

1,18 0,93 0,18 0,17 -0,63 0,44 -1,19 -1,13 -1,65 -0,71 0,58 -0,09 -0,31 -1,43 -1,45 -1,38 -0,90 0,50 -1,24 -1,69 -1,59 -1,47 -2,10 -2,06 -1,59 -1,41 -1,28 -0,53 -1,02 -1,05 -0,75 -0,49 -1,68 -1,89 0,69 0,87 1,58 1,42 0,34 -0,56 0,65 -0,97 0,44 0,26 0,55 0,26 0,30 0,55 0,65 0,74 0,69 1,07 -0,40 0,12 0,63

2,81 3,03 -0,35 0,38 -1,61 -0,55 -0,68 -0,15 -0,57 0,11 0,59 1,08 -0,52 0,06 -1,00 -2,12 -0,97 2,57 -2,74 -2,19 -1,59 -1,60 -5,86 -7,68 -4,31 -4,98 -4,98 -5,00 -1,55 -1,00 -0,24 0,31 -3,74 -2,93 -0,99 -0,86 -0,12 0,28 -0,24 0,21 -0,07 -0,28 -0,03 0,45 0,58 0,53 1,24 1,70 1,27 1,78 2,60 2,30 0,59 1,62 0,50

STM4408 STM4409 STM4409 STM4410 STM4410 STM4411 STM4411 STM4412 STM4412 STM4413 STM4413 STM4414 STM4414 STM4416 STM4416 STM4417 STM4417 STM4418 STM4418 STM4419 STM4419 STM4420 STM4420 STM4421 STM4421 STM4423 STM4423 STM4424,S STM4424,S STM4425 STM4425 STM4426 STM4426 STM4427 STM4427 STM4428 STM4428 STM4433 STM4433 STM4434 STM4434 STM4435 STM4435 STM4436 STM4436 STM4437 STM4437 STM4438 STM4438 STM4439 STM4439 STM4440 STM4440 STM4441 STM4441

298

msrA ytfM ytfM ytfN ytfN ytfP ytfP STM4412 STM4412 STM4413 STM4413 ppa ppa mpl mpl STM4417 STM4417 STM4418 STM4418 STM4419 STM4419 STM4420 STM4420 STM4421 STM4421 STM4423 STM4423 STM4424,S STM4424,S STM4425 STM4425 srfJ srfJ STM4427 STM4427 STM4428 STM4428 STM4433 STM4433 STM4434 STM4434 STM4435 STM4435 STM4436 STM4436 yjgA yjgA pmbA pmbA cybC cybC STM4440 STM4440 STM4441 STM4441

0,67 -1,34 -0,36 -2,56 -1,82 -2,28 -0,72 -0,57 0,96 0,66 -0,55 -2,62 -1,57 -0,16 0,04 0,05 1,42 3,13 3,24 0,75 1,41 -0,24 2,33 -0,56 1,76 0,00 1,71 0,70 2,22 0,66 0,51 0,12 -0,47 1,97 1,73 -1,07 -0,52 1,86 2,61 -0,27 -0,09 -0,11 1,12 -0,27 0,71 -1,09 -1,96 -2,76 -1,53 1,47 1,75 -0,02 0,38 -0,21 0,30

0,52 -0,48 -0,18 -0,19 -0,21 -0,51 -0,21 -0,72 -0,65 1,02 -0,16 -1,48 -0,98 -0,33 -0,12 -0,19 -0,60 2,11 0,99 -0,38 -0,55 0,00 0,99 0,17 0,95 -0,12 -0,82 -0,51 0,45 0,99 1,15 2,31 2,59 1,21 1,05 -0,11 -1,57 -0,78 -0,26 0,44 -1,46 -0,03 0,65 -0,59 -0,46 -1,11 -0,91 -0,63 -0,44 -1,06 -0,87 -0,39 -0,29 -0,03 -0,13

0,69 -1,72 -0,81 -2,40 -1,91 -1,03 -1,48 -0,45 -0,02 1,37 -0,20 -1,73 -2,04 -1,45 -0,79 -0,65 0,36 4,51 4,78 0,38 1,33 1,81 1,02 -2,78 0,57 -0,48 2,21 0,97 1,77 -0,07 0,42 -0,26 0,04 -0,98 1,40 -0,68 -2,51 -0,08 1,42 0,68 0,15 -0,05 0,42 -0,34 0,16 -0,83 -0,77 -0,86 -0,73 -2,13 -1,68 0,83 2,64 1,48 0,39

Anexo IV

STM4442 STM4442 STM4443 STM4443 STM4444 STM4444 STM4445 STM4445 STM4446 STM4446 STM4447 STM4447 STM4448 STM4448 STM4449 STM4449 STM4450 STM4450 STM4451 STM4451 STM4452 STM4452 STM4452,1N STM4452,1N STM4453 STM4453 STM4455 STM4455 STM4457 STM4457 STM4458 STM4458 STM4459 STM4459 STM4460 STM4460 STM4463 STM4463 STM4464 STM4464 STM4465 STM4465 STM4466 STM4466 STM4467 STM4467 STM4468 STM4468 STM4469 STM4469 STM4470 STM4470 STM4471 STM4471 STM4472

STM4442 STM4442 STM4443 STM4443 STM4444 STM4444 STM4445 STM4445 STM4446 STM4446 STM4447 STM4447 STM4448 STM4448 STM4449 STM4449 STM4450 STM4450 nrdG nrdG nrdD nrdD STM4452,1N STM4452,1N treC treC treR treR STM4457 STM4457 yjgF yjgF pyrI pyrI pyrB pyrB STM4463 STM4463 STM4464 STM4464 STM4465 STM4465 STM4466 STM4466 STM4467 STM4467 yjgK yjgK argI argI yjgD yjgD miaE miaE ytgA

0,14 0,88 -0,75 0,67 -0,04 0,72 0,51 2,01 0,37 0,45 -0,67 0,36 0,07 0,88 -0,68 0,89 0,32 1,11 -0,51 0,64 0,06 0,66 1,92 3,16 -2,01 1,01 -0,90 -0,74 -1,00 -1,23 -2,68 -2,09 -1,79 -1,09 -1,23 -0,61 -0,91 0,35 -0,46 1,51 0,51 3,64 0,62 0,78 2,76 3,73 0,63 1,49 1,49 1,88 -1,18 0,39 -0,23 -0,68 0,21

-0,62 -0,23 -0,16 -0,35 -0,01 -0,48 -0,59 -1,09 0,24 0,36 0,24 -1,04 -0,63 -0,23 0,91 0,50 0,84 0,59 0,62 1,11 0,86 0,71 0,43 0,64 -1,14 -0,76 -1,19 -1,94 -0,08 -1,03 -1,87 -1,34 0,00 0,18 -0,35 0,04 -0,80 -0,78 -0,57 -1,32 -0,58 -0,46 -2,14 -1,17 0,45 -0,50 0,24 0,19 2,38 1,49 0,15 -0,44 -0,23 -1,47 -0,33

-0,06 0,84 -0,65 0,54 -0,37 -0,13 -0,24 0,83 -0,06 -0,41 -0,63 0,31 -0,57 0,04 -0,14 0,62 -0,40 -0,30 -0,48 -0,96 -0,46 1,32 2,20 3,26 -1,93 -1,19 0,58 -0,07 -0,01 -1,14 -1,93 -2,71 -2,25 -1,49 -1,44 -1,60 -1,30 -0,59 -1,57 -0,60 -0,15 1,22 -0,84 -0,12 -0,63 0,25 -0,35 0,16 -0,09 1,20 0,17 0,46 -0,40 -0,50 2,65

STM4472 STM4473 STM4473 STM4474 STM4474 STM4475 STM4475 STM4476,S STM4476,S STM4477 STM4477 STM4479 STM4479 STM4480 STM4480 STM4481 STM4481 STM4482 STM4482 STM4483 STM4483 STM4484 STM4484 STM4485 STM4485 STM4486 STM4486 STM4487 STM4487 STM4488 STM4488 STM4489 STM4489 STM4490 STM4490 STM4491 STM4491 STM4492 STM4492 STM4493 STM4493 STM4494 STM4494 STM4495 STM4495 STM4496 STM4496 STM4497 STM4497 STM4498 STM4498 STM4499 STM4499 STM4500 STM4500

299

ytgA yjgM yjgM yjgN yjgN valS valS holC holC pepA pepA yjgP yjgP yjgQ yjgQ idnR idnR idnT idnT idnO idnO idnD idnD idnK idnK yjgB yjgB leuX leuX STM4488 STM4488 STM4489 STM4489 STM4490 STM4490 STM4491 STM4491 STM4492 STM4492 STM4493 STM4493 STM4494 STM4494 STM4495 STM4495 STM4496 STM4496 STM4497 STM4497 STM4498 STM4498 yeeN yeeN yjhP yjhP

1,01 -0,57 -0,56 0,47 0,22 -1,35 0,03 -2,94 -1,30 -4,12 -4,07 -2,20 0,01 -1,47 -1,28 0,22 -0,16 -0,89 -0,85 -1,03 0,17 -0,63 1,33 -1,18 -0,20 -0,24 1,08 -1,62 -0,58 1,55 3,17 -1,30 -0,55 -0,70 -0,28 -1,22 -0,68 -0,89 -0,54 -2,34 -2,82 -1,37 -0,75 -0,35 -0,45 -1,75 -0,13 -0,66 -2,80 -2,73 -2,07 -1,54 -1,98 1,08 2,52

0,18 -0,36 -1,06 -0,98 -0,95 -1,22 -0,85 -1,43 -1,03 -2,40 -2,13 -0,76 -0,90 0,12 -0,95 -0,43 -0,46 -0,34 -1,06 0,34 -0,34 1,23 -1,55 0,39 -0,22 1,87 2,03 -0,12 -0,26 -0,32 -0,99 0,24 0,21 0,16 0,35 -0,04 0,21 -0,56 -0,60 -1,54 -1,42 -0,25 -0,90 -1,12 -1,32 -0,98 -1,30 -1,12 -2,32 -1,98 -2,20 -0,76 -1,15 0,35 0,76

2,21 -1,23 -0,88 -0,11 -0,09 -1,63 -1,39 -2,19 -2,28 -3,28 -2,70 -1,68 -1,26 -0,75 -0,87 -0,70 -0,71 0,47 -1,17 -0,90 -0,15 -1,36 0,03 0,31 0,42 1,75 2,29 2,79 3,23 1,15 2,72 -0,35 -0,50 -0,84 -0,47 -0,20 -0,49 -0,69 -1,02 -2,29 -4,71 -0,49 -1,03 -0,87 -1,15 -2,65 -1,24 0,22 -3,57 -2,65 -2,60 -1,25 -1,71 -0,68 0,58

Anexo IV

STM4501 STM4501 STM4502 STM4502 STM4503 STM4503 STM4504 STM4504 STM4505 STM4505 STM4506 STM4506 STM4507 STM4507 STM4508 STM4508 STM4508,1N STM4508,1N STM4509,S STM4509,S STM4510 STM4510 STM4511 STM4511 STM4512 STM4512 STM4513 STM4513 STM4514,S STM4514,S STM4515 STM4515 STM4516 STM4516 STM4517 STM4517 STM4518 STM4518 STM4519 STM4519 STM4522 STM4522 STM4523 STM4523 STM4524 STM4524 STM4525 STM4525 STM4526 STM4526 STM4527 STM4527 STM4528 STM4528 STM4529

STM4501 STM4501 STM4502 STM4502 STM4503 STM4503 STM4504 STM4504 STM4505 STM4505 STM4506 STM4506 uxuR uxuR trpS2 trpS2 STM4508,1N STM4508,1N STM4509,S STM4509,S STM4510 STM4510 yjiE yjiE iadA iadA yjiG yjiG yjiH yjiH yjiJ yjiJ yjiN yjiN yjiO yjiO STM4518 STM4518 STM4519 STM4519 STM4522 STM4522 yjiW yjiW hsdS hsdS hsdM hsdM hsdR hsdR mrr mrr STM4528 STM4528 STM4529

-0,11 1,32 -0,42 1,04 0,54 0,33 -0,35 -0,21 -0,72 1,36 -0,48 -0,38 0,04 2,09 0,66 1,70 0,47 0,42 -0,40 0,59 0,15 0,82 -0,01 0,74 -1,13 0,06 -0,90 -1,93 0,69 1,58 -0,63 0,19 0,88 0,27 -0,43 0,91 -0,11 -0,21 -0,53 0,79 0,74 1,68 0,12 0,51 1,33 2,33 -1,09 0,05 -1,09 -0,04 -0,44 0,19 1,60 1,22 1,20

-0,30 -0,18 -0,43 0,14 -0,67 -0,59 -0,42 0,91 0,49 0,29 0,98 0,18 0,01 0,21 1,16 1,17 0,04 0,22 -1,23 -0,99 0,08 -0,89 -0,01 -1,03 -0,92 -1,10 -0,79 -0,87 0,46 -0,93 0,04 -0,24 -0,57 -1,60 0,39 -0,02 -0,67 -0,76 0,38 0,59 1,36 2,14 -0,20 -1,33 -1,09 -0,94 -1,68 -2,31 -1,46 -1,39 -0,05 0,33 1,55 1,39 1,71

-1,34 0,16 -1,12 0,48 -0,23 0,63 -0,37 -0,16 0,13 1,51 0,30 -2,57 0,27 0,99 0,35 1,54 0,70 0,83 0,33 -0,59 -0,75 0,44 -1,40 -0,23 -1,98 -0,18 -1,78 -1,00 1,69 0,41 -0,40 -0,14 0,38 0,81 -0,59 -0,45 0,55 0,91 2,47 3,06 2,43 4,44 0,63 1,88 0,18 0,59 -2,00 -2,39 -2,03 1,57 -1,58 0,41 1,03 1,70 0,04

STM4529 STM4530 STM4530 STM4531 STM4531 STM4532 STM4532 STM4534 STM4534 STM4535 STM4535 STM4536 STM4536 STM4537 STM4537 STM4538 STM4538 STM4539 STM4539 STM4540,S STM4540,S STM4541 STM4541 STM4542 STM4542 STM4543 STM4543 STM4544 STM4544 STM4545 STM4545 STM4546 STM4546 STM4547 STM4547 STM4548 STM4548 STM4549 STM4549 STM4551 STM4551 STM4552 STM4552 STM4556 STM4556 STM4558 STM4558 STM4559,S STM4559,S STM4560 STM4560 STM4561 STM4561 STM4562 STM4562

300

STM4529 yjiA yjiA yjiX yjiX yjiY yjiY STM4534 STM4534 STM4535 STM4535 STM4536 STM4536 STM4537 STM4537 STM4538 STM4538 STM4539 STM4539 STM4540,S STM4540,S mdoB mdoB yjjA yjjA dnaC dnaC dnaT dnaT STM4545 STM4545 yjjP yjjP yjjQ yjjQ bglJ bglJ STM4549 STM4549 STM4551 STM4551 STM4552 STM4552 rsmC rsmC rimI rimI yjjG yjjG prfC prfC osmY osmY STM4562 STM4562

2,35 0,20 0,11 -0,61 0,77 -0,66 0,42 2,27 0,95 1,75 1,64 1,87 0,86 0,42 1,23 -0,65 0,50 -0,90 0,12 -1,14 -1,04 -0,39 0,17 0,18 1,18 0,71 0,69 -1,65 -0,75 -0,52 0,45 -0,76 -1,54 0,12 0,42 0,52 0,58 0,42 0,80 -0,22 2,31 0,17 0,95 -0,93 -1,23 -1,36 0,12 -2,44 -0,89 -1,36 -1,45 1,93 2,21 -0,51 1,53

1,84 0,97 1,28 0,33 0,24 -1,38 -0,81 1,01 -1,02 0,22 1,03 -0,79 -2,28 0,90 -1,03 0,83 0,02 0,43 0,37 0,56 0,16 0,77 0,32 0,79 1,05 0,41 0,22 -0,33 -0,71 -0,72 -0,88 0,38 -0,93 0,71 0,77 0,97 1,42 1,03 0,81 0,94 0,59 2,21 2,47 -1,09 -0,89 0,04 -0,29 -1,11 -1,03 0,14 -0,21 3,95 4,01 1,41 1,75

1,29 3,69 2,91 -0,57 -0,30 -1,68 -0,11 4,04 -0,89 2,64 2,18 -0,42 1,32 0,13 0,87 -0,94 0,71 -0,51 0,19 -0,16 -0,50 -0,14 -0,10 -0,56 0,06 -0,89 -0,18 -2,31 -1,14 -0,31 -1,02 0,25 -0,56 -0,85 0,32 -1,64 -1,41 -0,35 -1,21 -0,50 0,32 1,82 2,83 -1,36 -0,83 -1,43 -1,31 -2,06 -2,19 0,77 -0,14 5,73 6,64 2,53 3,65

Anexo IV

STM4563 STM4563 STM4564 STM4564 STM4565 STM4565 STM4566 STM4566 STM4567 STM4567 STM4568 STM4568 STM4569 STM4569 STM4570 STM4570 STM4571 STM4571 STM4574 STM4574 STM4575 STM4575 STM4576 STM4576 STM4577 STM4577 STM4578 STM4578 STM4579 STM4579 STM4580,S STM4580,S STM4581 STM4581 STM4582 STM4582 STM4583 STM4583 STM4584 STM4584 STM4586 STM4586 STM4587 STM4587 STM4588 STM4588 STM4589 STM4589 STM4590 STM4590 STM4596 STM4596 STM4597 STM4597 STM4598

yjjU yjjU yjjV yjjV yjjW yjjW yjjI yjjI deoC deoC deoA deoA deoB deoB deoD deoD STM4571 STM4571 STM4574 STM4574 STM4575 STM4575 lplA lplA smp smp serB serB radA radA nadR nadR yjjK yjjK slt slt trpR trpR yjjX yjjX rob rob creA creA creB creB creC creC creD creD STM4596 STM4596 STM4597 STM4597 arcA

-0,74 -0,30 0,50 0,48 0,21 0,17 -0,28 1,27 -1,08 0,13 -3,01 -1,80 -3,33 -1,76 -2,43 -1,13 -0,72 -0,24 0,08 0,87 -1,20 -0,48 -0,81 -0,58 -1,28 0,04 -1,30 -1,89 -1,74 -0,36 0,65 2,42 -1,27 -1,04 -0,99 -0,52 -1,76 -0,56 -0,70 -0,79 -0,63 -0,72 0,40 0,86 0,08 0,39 -0,04 -1,68 -1,16 0,30 -1,18 0,76 -0,90 -1,44 -0,81

-0,22 0,21 0,40 0,88 -0,45 -0,58 -0,50 -0,66 -1,44 -1,20 -2,30 -1,50 -1,68 -1,16 -1,36 -1,50 -1,50 -1,40 -0,36 0,56 0,31 -0,02 0,63 -0,62 -0,90 -0,89 -1,50 -1,11 -1,13 -0,78 0,15 -0,29 -0,73 -0,88 -1,09 -0,85 -0,11 -0,16 -0,79 -1,10 -0,34 -0,43 0,96 1,51 -0,02 0,08 -0,71 -0,57 0,54 0,40 0,10 -0,12 -0,07 -0,26 0,43

-0,73 -0,31 1,44 0,66 -0,01 0,42 -0,28 1,03 -2,25 -1,44 -1,30 -1,26 -1,11 -0,90 -2,85 -1,90 -0,98 -0,60 -0,30 0,40 -0,41 0,72 0,10 -0,22 -2,15 -1,55 -2,69 -1,76 -1,91 -1,09 0,18 -0,77 -1,06 -0,83 -1,27 -1,52 -0,66 -0,95 -1,11 -0,13 -0,25 -0,82 -0,66 -0,05 -1,50 -1,55 -0,52 -0,33 -1,08 0,12 -0,29 0,79 -0,67 -1,08 -0,31

STM4598 STM4600 STM4600 PSLT001 PSLT001 PSLT002 PSLT002 PSLT006 PSLT006 PSLT008 PSLT008 PSLT009 PSLT009 PSLT010 PSLT007 PSLT010 PSLT007 PSLT011 PSLT011 PSLT012 PSLT012 PSLT014 PSLT014 PSLT015 PSLT015 PSLT023 PSLT023 PSLT025 PSLT025 PSLT026 PSLT026 PSLT027 PSLT027 PSLT028 PSLT028 PSLT029 PSLT029 PSLT030 PSLT030 PSLT031 PSLT031 PSLT032 PSLT032 PSLT032,1N PSLT032,1N PSLT033 PSLT033 PSLT036 PSLT036 PSLT037 PSLT037 PSLT038 PSLT038 PSLT039 PSLT039

301

arcA lasT lasT PSLT001 PSLT001 PSLT002 PSLT002 repA repA srgC srgC rcK rcK srgB srgB srgA srgA orf7 orf7 orf6 orf6 orf5 orf5 repA2 repA2 PSLT025 PSLT025 PSLT026 PSLT026 ccdA ccdA ccdB ccdB PSLT029 PSLT029 PSLT030 PSLT030 rsdB rsdB PSLT032 PSLT032 PSLT032,1N PSLT032,1N PSLT033 PSLT033 PSLT036 PSLT036 spvD spvD spvC spvC spvB spvB

-0,71 -0,81 0,79 1,20 3,71 0,47 1,20 3,02 2,81 2,32 3,58 1,68 2,77 0,65 2,18 3,62 3,38 1,36 3,46 0,38 0,92 -0,04 0,84 -1,04 0,49 -0,35 0,44 0,92 2,68 1,77 2,28 1,40 2,30 0,41 1,51 2,83 2,60 0,21 1,35 0,11 1,32 -0,17 1,56 0,42 1,28 0,89 0,92 0,54 2,14 3,85 3,70 2,24 4,11 3,10 4,39

0,45 -0,60 -0,48 0,99 1,03 0,95 1,13 2,15 1,13 1,30 1,29 1,58 1,29 0,22 -0,36 -0,49 -0,93 1,39 1,28 1,58 1,31 2,13 2,28 0,64 0,59 0,75 0,66 1,69 1,38 3,83 3,71 1,57 1,88 1,24 1,32 0,36 0,75 1,28 1,41 1,13 1,04 1,33 0,92 1,57 2,15 1,38 2,43 0,44 0,05 2,29 1,93 1,41 0,52 2,97 3,20

0,25 -0,85 0,65 1,07 2,17 -0,94 0,03 3,28 1,71 0,48 1,83 -0,02 0,77 -0,19 0,27 1,95 0,55 1,86 2,71 -0,67 -0,63 0,53 0,10 -0,26 -0,72 -0,94 -0,35 0,99 0,89 0,76 2,48 -0,06 0,06 -1,26 -0,35 0,37 0,46 -0,57 -0,40 -0,34 -0,38 -1,34 -0,78 -1,15 -0,41 0,35 -0,92 -0,45 1,12 2,73 2,91 0,74 2,46 3,51 3,62

Anexo IV

PSLT040 PSLT040 PSLT041 PSLT041 PSLT042 PSLT042 PSLT043 PSLT043 PSLT044 PSLT044 PSLT045 PSLT045 PSLT046 PSLT046 PSLT047 PSLT047 PSLT048 PSLT048 PSLT050,1N PSLT050,1N PSLT050,2N PSLT050,2N PSLT051 PSLT051 PSLT052 PSLT052 PSLT053 PSLT053 PSLT054 PSLT054 PSLT055 PSLT055 PSLT056 PSLT056 PSLT057 PSLT057 PSLT059 PSLT059 PSLT060 PSLT060 PSLT060,1N PSLT060,1N PSLT061 PSLT061 PSLT062 PSLT062 PSLT063 PSLT063 PSLT064 PSLT064 PSLT066 PSLT066 PSLT067 PSLT067 PSLT068

spvA spvA spvR spvR PSLT042 PSLT042 PSLT043 PSLT043 rlgA rlgA PSLT045 PSLT045 mig-5 mig-5 PSLT047 PSLT047 tlpA tlpA PSLT050,1N PSLT050,1N PSLT050,2N PSLT050,2N PSLT051 PSLT051 parA parA parB parB samB samB samA samA PSLT056 PSLT056 PSLT057 PSLT057 PSLT059 PSLT059 PSLT060 PSLT060 PSLT060,1N PSLT060,1N PSLT061 PSLT061 PSLT062 PSLT062 PSLT063 PSLT063 PSLT064 PSLT064 ssbB ssbB PSLT067 PSLT067 PSLT068

2,09 3,52 0,52 2,38 0,45 2,23 2,49 3,56 1,32 1,72 2,88 3,40 2,61 3,02 3,09 3,05 1,23 1,22 0,13 1,02 0,87 2,24 1,30 1,85 0,61 1,35 0,27 0,41 -0,04 1,00 1,33 1,35 1,52 2,52 1,17 2,56 1,87 3,36 2,57 4,03 1,35 2,17 1,09 2,97 -0,56 1,85 1,74 3,66 -0,60 0,07 3,54 4,19 0,54 1,84 1,19

3,54 2,98 2,29 1,62 1,91 2,98 2,78 2,72 3,64 3,26 3,38 3,30 1,62 1,85 3,33 2,83 2,26 1,81 2,49 2,63 2,32 2,90 2,71 2,38 1,23 0,98 0,12 0,00 0,94 0,37 1,43 0,63 0,13 -0,33 -0,05 -0,42 1,11 1,01 2,30 2,13 1,31 1,23 0,86 -0,13 0,89 0,54 1,00 0,85 -1,25 -2,32 0,45 -0,28 0,46 -0,02 1,56

1,23 1,42 1,60 1,90 0,24 1,95 0,58 1,82 0,63 0,76 0,08 0,25 0,73 0,89 2,75 2,60 -0,84 -1,12 0,41 0,01 1,56 1,54 2,71 3,06 -0,59 0,12 -0,34 -0,28 -0,13 0,29 0,45 1,55 0,48 1,18 0,04 0,48 0,24 0,69 1,55 2,52 -1,09 0,02 -0,18 0,64 -0,71 0,92 0,45 1,60 -0,86 -1,62 0,81 1,36 0,08 0,35 1,10

PSLT068 PSLT069 PSLT069 PSLT070 PSLT070 PSLT072 PSLT072 PSLT073 PSLT073 PSLT075 PSLT075 PSLT076 PSLT076 PSLT077 PSLT077 PSLT078 PSLT078 PSLT079 PSLT079 PSLT080 PSLT080 PSLT081 PSLT081 PSLT082 PSLT082 PSLT083 PSLT083 PSLT084 PSLT084 PSLT085 PSLT085 PSLT087 PSLT087 PSLT088 PSLT088 PSLT089 PSLT089 PSLT091 PSLT091 PSLT092 PSLT092 PSLT094 PSLT094 PSLT094,1N PSLT094,1N PSLT095 PSLT095 PSLT097 PSLT097 PSLT098 PSLT098 PSLT099 PSLT099 PSLT100 PSLT100

302

PSLT068 psiB psiB psiA psiA PSLT072 PSLT072 traM traM traJ traJ traY traY traA traA traL traL traE traE traK traK traB traB traP traP trbD trbD traV traV traR traR PSLT087 PSLT087 traC traC trbI trbI traW traW traU traU trbC trbC PSLT094,1N PSLT094,1N traN traN traF traF traQ traQ trbB trbB traH traH

2,31 0,78 1,87 2,27 2,65 2,33 3,67 4,91 4,31 -0,55 -0,52 1,30 2,26 0,56 1,67 -0,89 -0,07 2,61 2,80 0,22 2,06 2,77 2,98 1,45 2,32 1,63 3,05 -0,50 2,19 0,83 0,51 0,79 3,71 1,43 2,95 -0,17 0,84 1,27 3,16 1,90 2,63 1,86 2,18 0,36 1,48 1,43 1,59 0,52 2,31 1,65 3,47 0,11 1,55 1,08 2,53

-0,79 0,02 1,46 0,09 -0,60 1,71 1,60 3,68 2,41 -1,14 -0,92 0,80 0,27 -0,59 -1,27 -0,18 -1,02 0,04 -0,31 -0,48 0,39 0,77 0,40 0,64 1,19 2,63 2,00 0,46 0,94 1,09 0,16 0,80 2,02 0,67 0,49 -0,99 0,08 -0,67 -0,14 0,58 0,62 0,28 -0,84 -0,01 -0,38 0,11 -0,81 1,14 1,42 1,28 0,70 0,84 0,12 0,68 0,38

1,05 -1,09 0,31 -0,15 1,00 1,40 2,08 6,08 6,19 -0,69 0,21 2,52 2,34 -1,05 0,01 -2,00 -0,62 1,28 2,26 -0,15 -0,24 0,52 1,41 0,75 0,96 1,73 2,51 -0,47 0,42 0,79 0,12 0,41 2,64 0,28 1,14 -0,13 -0,38 1,70 1,00 0,93 0,84 -0,25 0,19 -1,41 0,38 0,64 2,06 -1,29 0,94 0,99 2,32 -0,62 0,21 0,71 0,21

Anexo IV

PSLT101 PSLT101 PSLT102 PSLT102 PSLT103 PSLT103 PSLT104 PSLT104 PSLT105 PSLT105 PSLT106 PSLT106 PSLT107 PSLT107 PSLT108 PSLT108 PSLT110 PSLT110 PSLT111 PSLT111 CNB1344-0001 CNB1344-0001 CNB1344-0002 CNB1344-0002 CNB1344-0003 CNB1344-0003 CNB1344-0004 CNB1344-0004 CNB1344-0005 CNB1344-0005 CNB1344-0006 CNB1344-0006 CNB1344-0007 CNB1344-0007 CNB1344-0008 CNB1344-0008 CNB1344-0009 CNB1344-0009 CNB1344-0010 CNB1344-0010 CNB1344-0011 CNB1344-0011 CNB1344-0012 CNB1344-0012 CNB1344-0013 CNB1344-0013 CNB1344-0014 CNB1344-0014 CNB1344-0015 CNB1344-0015 CNB1344-0016 CNB1344-0016 CNB1344-0017 CNB1344-0017 CNB1344-0018

traG traG traS traS traT traT traD traD trbH trbH PSLT106 PSLT106 PSLT107 PSLT107 traI traI traX traX finO finO sraE sraE rygB rygB ssrS-6S ssrS-6S rygC rygC rygD rygD ryeC ryeC sroG sroG ryeC ryeC rygD rygD rygC rygC sraF sraF sraG sraG sraH sraH sraL sraL sraI sraI sraJ sraJ csrC csrC oxyS

2,02 2,73 1,56 1,73 0,88 1,44 2,87 4,31 1,67 2,04 2,56 4,05 4,36 4,89 1,83 3,37 -0,11 1,60 1,50 2,12 -1,85 -0,86 -0,92 0,85 -1,87 -0,90 -0,68 -0,99 -0,41 -0,46 -0,88 -0,92 -0,79 -0,47 0,23 1,27 0,14 0,75 0,37 0,77 -0,59 -0,40 -1,50 -0,51 -1,62 -2,15 2,43 3,37 0,22 -0,52 -3,21 -0,74 -3,99 -2,17 -0,57

3,03 2,90 3,66 3,81 4,62 4,32 3,20 3,38 3,60 3,13 3,32 3,23 5,23 4,80 1,59 1,55 -1,00 -0,56 1,21 0,92 -1,17 -0,96 -0,63 -1,09 3,81 3,56 -0,46 -0,12 -0,11 -0,15 0,58 0,44 -0,39 -0,57 0,15 0,49 0,41 -0,32 0,48 0,27 0,42 1,02 -1,06 -0,56 -1,37 -1,18 3,31 2,94 2,87 2,19 0,39 0,83 -0,02 0,94 0,39

2,45 2,58 1,09 1,87 1,90 1,49 0,79 1,53 0,47 0,06 -0,04 0,99 2,05 2,63 -0,24 -0,06 -1,11 -0,36 -0,55 0,24 -0,84 0,14 -0,90 0,26 4,20 4,42 -0,54 0,05 0,15 0,44 1,15 0,94 -0,61 0,00 -0,91 1,01 -0,49 -0,85 -0,15 -0,41 -0,56 -0,39 -1,64 -2,01 -1,80 -1,11 4,40 5,55 1,16 -1,31 -0,42 0,22 3,38 3,52 -1,14

CNB1344-0018 oxyS CNB1344-0019 tpke11 CNB1344-0019 tpke11 CNB1344-0020 sroA CNB1344-0020 sroA CNB1344-0021 T44 CNB1344-0021 T44 CNB1344-0022 sroC CNB1344-0022 sroC CNB1344-0023 sraA CNB1344-0023 sraA CNB1344-0024 sroB CNB1344-0024 sroB CNB1344-0025 sraD CNB1344-0025 sraD CNB1344-0026 ssrA CNB1344-0026 ssrA CNB1344-0027 sraJ CNB1344-0027 sraJ CNB1344-0028 tke1 CNB1344-0028 tke1 CNB1344-0029 ryfA CNB1344-0029 ryfA CNB1344-0030 sroE CNB1344-0030 sroE CNB1344-0031 ryeE CNB1344-0031 ryeE CNB1344-0032 rygD CNB1344-0032 rygD CNB1344-0033 ryeD CNB1344-0033 ryeD CNB1344-0034 ryeC CNB1344-0034 ryeC CNB1344-0035 rygC CNB1344-0035 rygC CNB1344-0036 gcvB CNB1344-0036 gcvB CNB1344-0037 sraB CNB1344-0037 sraB CNB1344-0038 ryeA CNB1344-0038 ryeA CNB1344-0039 ryeB CNB1344-0039 ryeB CNB1344-0040 rydB CNB1344-0040 rydB CNB1344-0041 tke8 CNB1344-0041 tke8 CNB1344-0042 C0343 CNB1344-0042 C0343 CNB1344-0043 fabH CNB1344-0043 fabH CNB1344-0044 S0749A_ORF CNB1344-0044 S0749A_ORF CNB1344-0045 mlpks CNB1344-0045 mlpks

303

-0,72 -1,75 -1,17 -1,18 -0,32 -4,13 -4,59 -0,41 -0,48 -0,36 0,79 -0,26 -0,89 -1,54 -1,43 1,79 2,52 -1,76 -1,66 -0,75 -0,07 -0,68 -0,84 -1,96 -2,55 1,37 2,66 -0,81 -0,06 -0,57 0,59 -0,35 -0,14 0,23 0,18 -3,49 -3,24 -3,65 -3,84 -0,60 -1,22 -0,70 -0,35 -1,14 0,29 0,06 0,11 2,52 2,40 -2,43 -2,20 -2,40 -1,47 1,35 0,93

1,00 -0,95 -0,87 0,43 0,68 -2,08 -1,94 2,35 2,37 -0,61 -0,04 -0,30 -0,05 -0,17 -0,06 4,30 3,53 1,56 0,46 3,02 2,34 -1,16 -1,29 -1,42 -1,44 -0,05 0,15 -0,56 -0,42 -0,51 -0,43 0,86 0,13 -0,07 -0,38 -2,00 -1,84 -1,69 -1,30 0,64 -0,17 0,26 0,09 0,86 -0,70 -1,12 -0,67 0,97 1,02 -1,69 -1,67 0,41 0,09 0,30 -2,58

-0,75 0,68 1,07 -0,53 -0,46 -6,36 -6,63 2,89 2,09 -1,00 -0,54 -0,19 -0,06 -0,60 -0,60 4,92 5,29 0,03 -0,66 0,27 0,86 -2,23 -1,71 -1,50 -1,09 0,66 1,44 -1,03 -0,68 -1,08 -0,54 0,48 -0,94 -0,93 -0,36 -0,79 -0,85 -2,89 -3,51 0,07 -0,83 0,82 0,63 -0,60 0,12 -0,32 -0,72 1,63 2,61 -2,59 -2,38 -2,17 -1,48 0,62 -1,53

Anexo IV

CNB1344-0046 CNB1344-0046 CNB1344-0047 CNB1344-0047 CNB1344-0048 CNB1344-0048 CNB1344-0049 CNB1344-0049 CNB1344-0050 CNB1344-0050 CNB1344-0051 CNB1344-0051 CNB1344-0052 CNB1344-0052 CNB1344-0053 CNB1344-0053 CNB1344-0054 CNB1344-0054 CNB1344-0055 CNB1344-0055 CNB1344-0056 CNB1344-0056 CNB1344-0057 CNB1344-0057 CNB1344-0058 CNB1344-0058 CNB1344-0059 CNB1344-0059 CNB1344-0060 CNB1344-0060 CNB1344-0061 CNB1344-0061 CNB1344-0062 CNB1344-0062 CNB1344-0063 CNB1344-0063 CNB1344-0064 CNB1344-0064 CNB1344-0065 CNB1344-0065 CNB1344-0066 CNB1344-0066 CNB1344-0067 CNB1344-0067 CNB1344-0068 CNB1344-0068 CNB1344-0069 CNB1344-0069 CNB1344-0070 CNB1344-0070 CNB1344-0071 CNB1344-0071 CNB1344-0072 CNB1344-0072 CNB1344-0073

S0747A_ORF S0747A_ORF S0287A_ORF S0287A_ORF S0364A_ORF S0364A_ORF S0356A_ORF S0356A_ORF S0337A_ORF S0337A_ORF S0336A_ORF S0336A_ORF S0742A_ORF S0742A_ORF S0735A_ORF S0735A_ORF S0732A_ORF S0732A_ORF S0728A_ORF S0728A_ORF S0718A_ORF S0718A_ORF S0717A_ORF S0717A_ORF S0714A_ORF S0714A_ORF S0695A_ORF S0695A_ORF S0691A_ORF S0691A_ORF S0679A_ORF S0679A_ORF S0325A_ORF S0325A_ORF S0323A_ORF S0323A_ORF S0322A_ORF S0322A_ORF S0653A_ORF S0653A_ORF S0634A_ORF S0634A_ORF S0625A_ORF S0625A_ORF S0616A_ORF S0616A_ORF S0608A_ORF S0608A_ORF S0605A_ORF S0605A_ORF S0603A_ORF S0603A_ORF S0318A_ORF S0318A_ORF S0586A_ORF

-1,28 -1,09 -2,32 -2,12 1,08 1,24 -0,88 -0,22 -3,37 -1,76 -4,03 -2,49 -0,38 0,38 1,63 0,83 0,96 0,23 -0,25 1,24 -0,54 0,69 1,12 -0,10 0,31 0,79 -1,05 -1,28 0,23 -0,38 -0,33 1,15 0,12 1,60 1,94 1,87 -0,85 -0,07 -2,79 -1,19 -1,12 -0,56 -0,48 0,28 0,83 0,67 1,57 2,30 -0,78 -0,35 0,25 0,19 -1,27 -1,11 -0,58

0,14 1,81 -0,60 -0,07 0,34 0,64 -1,33 -1,01 -0,91 -0,68 -2,05 -1,64 -0,63 -0,05 0,24 -0,35 0,40 -0,03 -0,56 -0,70 -0,11 -0,87 1,71 -0,47 0,92 1,05 -0,06 0,02 0,99 -0,10 1,26 1,68 -0,62 -0,34 1,59 0,61 0,41 -0,22 -2,04 -1,30 -0,49 -0,07 0,11 -0,56 1,62 2,04 1,78 1,50 0,53 -0,27 0,29 0,57 0,22 -0,04 -0,81

-0,89 -0,06 -5,48 -5,84 0,14 1,94 -0,54 -0,32 -2,55 -2,04 -3,62 -3,25 -0,93 -1,07 1,12 1,78 -0,60 0,94 -0,82 -0,68 0,66 0,34 0,92 0,08 1,61 0,90 -0,13 0,18 0,24 -2,55 -0,98 0,34 0,28 2,04 1,88 2,97 0,41 2,15 -1,05 -2,88 -0,23 -0,33 -0,69 0,16 2,22 2,32 3,18 3,95 0,49 2,64 -0,15 0,16 -0,09 1,04 -1,30

CNB1344-0073 CNB1344-0074 CNB1344-0074 CNB1344-0075 CNB1344-0075 CNB1344-0076 CNB1344-0076 CNB1344-0077 CNB1344-0077 CNB1344-0078 CNB1344-0078 CNB1344-0079 CNB1344-0079 CNB1344-0080 CNB1344-0080 CNB1344-0081 CNB1344-0081 CNB1344-0082 CNB1344-0082 CNB1344-0083 CNB1344-0083 CNB1344-0084 CNB1344-0084 CNB1344-0085 CNB1344-0085 CNB1344-0086 CNB1344-0086 CNB1344-0087 CNB1344-0087 CNB1344-0088 CNB1344-0088 CNB1344-0089 CNB1344-0089 CNB1344-0090 CNB1344-0090 CNB1344-0091 CNB1344-0091 CNB1344-0092 CNB1344-0092 CNB1344-0093 CNB1344-0093 CNB1344-0094 CNB1344-0094 CNB1344-0095 CNB1344-0095 CNB1344-0096 CNB1344-0096 CNB1344-0097 CNB1344-0097 CNB1344-0098 CNB1344-0098 CNB1344-0099 CNB1344-0099 CNB1344-0100 CNB1344-0100

304

S0586A_ORF S0568A_ORF S0568A_ORF S0314A_ORF S0314A_ORF S0544A_ORF S0544A_ORF S0516A_ORF S0516A_ORF S0512A_ORF S0512A_ORF S0507A_ORF S0507A_ORF S0481A_ORF S0481A_ORF S0480A_ORF S0480A_ORF S0479A_ORF S0479A_ORF S0478A_ORF S0478A_ORF S0460A_ORF S0460A_ORF S0431A_ORF S0431A_ORF S0419A_ORF S0419A_ORF yhbE yhbE S0415A_ORF S0415A_ORF S0292A_ORF S0292A_ORF S0266A_ORF S0266A_ORF S0265A_ORF S0265A_ORF S0264A_ORF S0264A_ORF S0269A_ORF S0269A_ORF S0268A_ORF S0268A_ORF S0267A_ORF S0267A_ORF S0260A_ORF S0260A_ORF S0259A_ORF S0259A_ORF S0262A_ORF S0262A_ORF S0263A_ORF S0263A_ORF S0257A_ORF S0257A_ORF

-1,10 -0,57 1,13 -0,09 0,98 -0,16 0,71 -0,75 -0,56 -0,85 -0,60 2,21 2,55 -0,06 1,39 1,88 2,08 1,17 2,09 0,73 1,91 -1,23 -0,27 -1,61 -2,20 -0,97 -1,08 -1,90 -0,35 -2,74 -1,94 -2,91 -1,97 -2,66 -2,88 -0,36 -0,49 -1,42 -0,87 -2,35 -1,40 -2,19 -2,11 -3,35 -3,09 -2,23 -2,68 -3,33 -2,40 -1,36 -0,45 -1,14 -1,27 -0,17 1,69

-1,02 0,54 -1,22 0,03 -0,23 -0,31 -0,24 -0,78 -0,38 -1,41 -0,73 -2,95 -3,16 0,37 1,02 1,09 1,26 1,34 1,05 1,29 0,83 -0,92 -0,37 0,00 -0,38 -1,20 -0,63 -0,02 0,37 -1,66 -1,12 -1,33 -0,57 -1,68 -1,39 -1,64 -3,64 -0,70 -0,06 -1,74 -2,07 -1,94 -1,62 -2,81 -2,18 -2,61 -2,43 -1,48 -1,48 -0,06 -1,07 -2,38 -0,88 0,02 -0,08

-0,95 0,04 -2,17 -0,15 0,85 -0,11 0,81 -0,23 -0,04 0,75 0,43 -1,00 0,16 -0,86 -0,09 -0,25 0,22 -1,09 -0,29 -0,77 0,01 -1,26 -0,21 0,20 -0,80 -0,53 -0,99 -0,94 -0,63 -3,54 -3,94 -5,38 -5,20 -3,34 -3,59 0,17 -0,03 -1,07 -0,76 -2,93 -2,79 -2,97 -2,74 -3,94 -6,10 -3,02 -3,31 -3,65 -3,54 -0,35 -2,11 -0,60 -0,53 2,35 1,50

Anexo IV

CNB1344-0101 CNB1344-0101 CNB1344-0102 CNB1344-0102 CNB1344-0103 CNB1344-0103 CNB1344-0104 CNB1344-0104 CNB1344-0105 CNB1344-0105 CNB1344-0106 CNB1344-0106 CNB1344-0107 CNB1344-0107 CNB1344-0108 CNB1344-0108 CNB1344-0109 CNB1344-0109 CNB1344-0110 CNB1344-0110 CNB1344-0111 CNB1344-0111 CNB1344-0112 CNB1344-0112 CNB1344-0113 CNB1344-0113 CNB1344-0114 CNB1344-0114 CNB1344-0115 CNB1344-0115 CNB1344-0116 CNB1344-0116 CNB1344-0117 CNB1344-0117 CNB1344-0118 CNB1344-0118 CNB1344-0119 CNB1344-0119 CNB1344-0120 CNB1344-0120 CNB1344-0121 CNB1344-0121 CNB1344-0122 CNB1344-0122 CNB1344-0123 CNB1344-0123 CNB1344-0124 CNB1344-0124 CNB1344-0125 CNB1344-0125 CNB1344-0126 CNB1344-0126 CNB1344-0127 CNB1344-0127 CNB1344-0128

S0253A_ORF S0253A_ORF S0252A_ORF S0252A_ORF S0251A_ORF S0251A_ORF S0245A_ORF S0245A_ORF S0244A_ORF S0244A_ORF S0243A_ORF S0243A_ORF S0242A_ORF S0242A_ORF S0241A_ORF S0241A_ORF S0240A_ORF S0240A_ORF S0225A_ORF S0225A_ORF S0224A_ORF S0224A_ORF S0133A_ORF S0133A_ORF S0201A_ORF S0201A_ORF S0199A_ORF S0199A_ORF S0197A_ORF S0197A_ORF S0196A_ORF S0196A_ORF S0191A_ORF S0191A_ORF S0189A_ORF S0189A_ORF S0186A_ORF S0186A_ORF S0184A_ORF S0184A_ORF S0180A_ORF S0180A_ORF S0177A_ORF S0177A_ORF S0176A_ORF S0176A_ORF S0175A_ORF S0175A_ORF S0174A_ORF S0174A_ORF S0128A_ORF S0128A_ORF S0171A_ORF S0171A_ORF S0127A_ORF

-0,13 -0,25 1,42 2,99 1,13 2,45 0,21 1,44 0,48 1,93 1,32 2,46 -0,25 1,31 -0,04 1,66 3,48 0,49 -1,34 -0,10 -0,17 0,47 0,51 2,75 2,04 2,66 -0,28 0,61 0,57 1,55 1,76 2,77 3,09 1,95 -0,89 0,12 0,05 1,14 1,08 1,62 2,51 2,65 0,03 0,89 2,26 3,62 1,66 2,70 -0,44 0,57 0,27 1,20 0,81 0,64 1,88

-0,51 -0,66 1,00 0,32 -0,08 0,01 1,06 0,47 1,97 1,48 0,70 0,51 -0,80 -3,45 1,27 1,80 2,13 0,37 0,06 -0,30 0,20 -1,81 0,86 0,89 1,09 0,80 0,44 0,81 0,88 0,35 -0,18 -0,19 1,59 1,37 0,61 0,37 0,95 1,78 1,33 1,16 0,41 0,29 -0,66 -0,16 1,21 0,97 0,01 0,25 -0,31 -0,65 0,65 0,08 2,09 1,68 -1,26

0,07 -0,29 1,63 3,20 -0,25 0,10 -0,52 0,56 0,22 0,67 0,26 1,07 0,00 -0,64 0,10 1,69 5,78 1,68 -0,45 -0,76 0,10 -0,35 0,34 1,50 0,60 1,22 1,38 1,41 -0,07 0,35 -0,58 1,42 0,01 1,58 -0,18 -0,61 -1,53 -1,53 -0,26 0,37 2,00 2,74 -1,64 0,75 1,10 2,76 0,62 1,33 -0,21 -0,88 0,08 0,38 1,64 -0,23 -0,65

CNB1344-0128 CNB1344-0129 CNB1344-0129 CNB1344-0130 CNB1344-0130 CNB1344-0131 CNB1344-0131 CNB1344-0132 CNB1344-0132 CNB1344-0133 CNB1344-0133 CNB1344-0134 CNB1344-0134 CNB1344-0135 CNB1344-0135 CNB1344-0136 CNB1344-0136 CNB1344-0137 CNB1344-0137 CNB1344-0138 CNB1344-0138 CNB1344-0139 CNB1344-0139 CNB1344-0140 CNB1344-0140 CNB1344-0141 CNB1344-0141 CNB1344-0142 CNB1344-0142 CNB1344-0143 CNB1344-0143 CNB1344-0144 CNB1344-0144 CNB1344-0145 CNB1344-0145 CNB1344-0146 CNB1344-0146 CNB1344-0147 CNB1344-0147 CNB1344-0148 CNB1344-0148 CNB1344-0149 CNB1344-0149 CNB1344-0150 CNB1344-0150 CNB1344-0151 CNB1344-0151 CNB1344-0152 CNB1344-0152 CNB1344-0153 CNB1344-0153 CNB1344-0154 CNB1344-0154 CNB1344-0155 CNB1344-0155

305

S0127A_ORF S0169A_ORF S0169A_ORF S0160A_ORF S0160A_ORF S0159A_ORF S0159A_ORF S0158A_ORF S0158A_ORF vsdF vsdF S0154A_ORF S0154A_ORF S0152A_ORF S0152A_ORF S0149A_ORF S0149A_ORF S0148A_ORF S0148A_ORF S0124A_ORF S0124A_ORF S0141A_ORF S0141A_ORF S0140A_ORF S0140A_ORF S0137A_ORF S0137A_ORF mobC mobC mobA mobA mobB mobB S0117A_ORF S0117A_ORF repA repA sulII sulII S0114A_ORF S0114A_ORF S5271A_ORF S5271A_ORF S5269A_ORF S5269A_ORF S5267A_ORF S5267A_ORF S5259A_ORF S5259A_ORF S5254A_ORF S5254A_ORF S5249A_ORF S5249A_ORF S5242A_ORF S5242A_ORF

2,34 2,15 1,74 1,40 2,32 0,10 1,34 1,18 1,32 0,02 1,22 0,76 2,67 1,71 3,10 1,07 1,78 0,44 1,15 2,19 2,33 1,97 2,05 2,09 2,59 1,70 2,14 3,16 3,73 1,98 2,69 3,81 4,16 2,69 2,75 2,77 3,02 0,98 2,01 3,56 2,91 -1,24 -0,47 -0,39 0,85 -0,67 0,27 1,38 -1,03 -1,42 -1,22 0,95 1,07 -2,59 -1,93

-1,37 1,14 1,06 2,82 2,70 1,21 1,87 1,85 1,66 2,22 1,11 0,12 -0,40 2,00 1,98 2,30 2,50 1,33 -0,48 0,30 -0,03 1,92 1,97 2,48 2,03 2,09 2,42 1,37 1,04 2,05 2,05 2,51 2,39 1,31 1,45 0,67 0,85 0,48 0,54 0,86 0,61 -1,02 -0,82 0,32 0,85 0,82 0,81 0,51 0,42 0,28 -1,29 0,66 0,83 -2,03 -1,73

0,34 0,10 0,89 0,02 1,99 -0,83 -0,66 -0,22 0,58 0,51 1,20 -0,11 0,08 1,83 2,45 0,61 1,90 -0,29 0,58 0,68 -0,02 -1,00 -0,49 -0,57 -0,19 -1,28 -0,23 -0,57 -0,10 -1,10 -1,13 -0,99 -0,77 -0,21 -0,14 -0,32 0,06 -1,58 -1,08 0,09 -1,93 -1,55 -2,02 -0,60 0,29 0,35 0,07 0,56 -0,11 -0,61 -1,26 1,32 2,24 -3,29 -3,17

Anexo IV

CNB1344-0156 CNB1344-0156 CNB1344-0157 CNB1344-0157 CNB1344-0158 CNB1344-0158 CNB1344-0159 CNB1344-0159 CNB1344-0160 CNB1344-0160 CNB1344-0161 CNB1344-0161 CNB1344-0162 CNB1344-0162 CNB1344-0163 CNB1344-0163 CNB1344-0164 CNB1344-0164 CNB1344-0165 CNB1344-0165 CNB1344-0166 CNB1344-0166 CNB1344-0167 CNB1344-0167 CNB1344-0168 CNB1344-0168 CNB1344-0169 CNB1344-0169 CNB1344-0170 CNB1344-0170 CNB1344-0171 CNB1344-0171 CNB1344-0172 CNB1344-0172 CNB1344-0173 CNB1344-0173 CNB1344-0174 CNB1344-0174 CNB1344-0175 CNB1344-0175 CNB1344-0176 CNB1344-0176 CNB1344-0177 CNB1344-0177 CNB1344-0178 CNB1344-0178 CNB1344-0179 CNB1344-0179 CNB1344-0180 CNB1344-0180 CNB1344-0181 CNB1344-0181 CNB1344-0182 CNB1344-0182 CNB1344-0183

S4406A_ORF S4406A_ORF S5218A_ORF S5218A_ORF S4400A_ORF S4400A_ORF S5204A_ORF S5204A_ORF gudP gudP S5185A_ORF S5185A_ORF S5184A_ORF S5184A_ORF S5176A_ORF S5176A_ORF S5157A_ORF S5157A_ORF S5100A_ORF S5100A_ORF S5096A_ORF S5096A_ORF S5095A_ORF S5095A_ORF S5077A_ORF S5077A_ORF S5071A_ORF S5071A_ORF S5068A_ORF S5068A_ORF S5062A_ORF S5062A_ORF S5061A_ORF S5061A_ORF S5055A_ORF S5055A_ORF S4385A_ORF S4385A_ORF S5015A_ORF S5015A_ORF S4380A_ORF S4380A_ORF S4381A_ORF S4381A_ORF S4379A_ORF S4379A_ORF S4378A_ORF S4378A_ORF S4373A_ORF S4373A_ORF S4966A_ORF S4966A_ORF S4371A_ORF S4371A_ORF S4956A_ORF

-0,33 -0,13 -0,40 0,07 -0,10 2,17 1,22 2,26 0,76 1,22 -0,40 -0,27 -1,06 -0,97 2,23 3,07 -1,23 -2,36 -2,21 0,98 -1,78 -1,93 -0,81 -0,74 -1,22 0,19 -1,25 0,61 -1,06 -0,94 -0,05 2,52 -0,79 0,19 -0,22 1,31 1,85 2,04 -0,25 0,86 -0,10 2,60 -0,04 -0,29 -0,59 1,44 -1,24 0,22 0,73 1,15 -0,17 -0,08 -1,13 -0,41 -0,32

0,27 1,17 -1,33 -0,86 0,99 0,76 0,86 0,69 0,43 -1,08 0,38 0,66 -0,59 -0,25 1,22 1,48 0,81 0,49 -0,87 -0,52 -0,25 -0,76 -0,62 -0,83 -1,17 -1,70 0,26 -0,20 0,72 0,41 0,67 0,29 -0,81 -0,97 0,48 -2,00 0,73 -0,03 -1,06 -0,44 -0,34 -0,69 0,16 0,31 -0,18 -1,31 0,56 -1,76 -0,10 -0,19 0,20 0,27 0,22 0,46 0,05

1,23 0,51 -1,24 -0,59 0,30 2,04 1,10 2,23 1,51 0,04 -0,61 0,29 -0,72 -1,39 3,70 3,57 0,16 -0,40 -0,64 -1,03 -1,23 -2,73 -2,09 -1,19 -0,01 -0,49 -0,51 -0,58 1,19 -0,54 0,54 -1,64 -0,84 -0,20 0,40 0,50 1,94 1,81 -1,00 0,16 -0,44 0,16 -0,16 0,32 -0,66 -0,17 -0,46 -0,52 1,73 1,55 -0,85 -0,45 -0,30 0,87 0,38

CNB1344-0183 CNB1344-0184 CNB1344-0184 CNB1344-0185 CNB1344-0185 CNB1344-0186 CNB1344-0186 CNB1344-0187 CNB1344-0187 CNB1344-0188 CNB1344-0188 CNB1344-0189 CNB1344-0189 CNB1344-0190 CNB1344-0190 CNB1344-0191 CNB1344-0191 CNB1344-0192 CNB1344-0192 CNB1344-0193 CNB1344-0193 CNB1344-0194 CNB1344-0194 CNB1344-0195 CNB1344-0195 CNB1344-0196 CNB1344-0196 CNB1344-0197 CNB1344-0197 CNB1344-0198 CNB1344-0198 CNB1344-0199 CNB1344-0199 CNB1344-0200 CNB1344-0200 CNB1344-0201 CNB1344-0201 CNB1344-0202 CNB1344-0202 CNB1344-0203 CNB1344-0203 CNB1344-0204 CNB1344-0204 CNB1344-0205 CNB1344-0205 CNB1344-0206 CNB1344-0206 CNB1344-0207 CNB1344-0207 CNB1344-0208 CNB1344-0208 CNB1344-0209 CNB1344-0209 CNB1344-0210 CNB1344-0210

306

S4956A_ORF S4955A_ORF S4955A_ORF S4950A_ORF S4950A_ORF S4947A_ORF S4947A_ORF S4945A_ORF S4945A_ORF S4932A_ORF S4932A_ORF S4921A_ORF S4921A_ORF S4912A_ORF S4912A_ORF S4907A_ORF S4907A_ORF S4905A_ORF S4905A_ORF S4893A_ORF S4893A_ORF eda eda intC intC S4857A_ORF S4857A_ORF S4854A_ORF S4854A_ORF S4842A_ORF S4842A_ORF S4812A_ORF S4812A_ORF S4810A_ORF S4810A_ORF S4808A_ORF S4808A_ORF S4805A_ORF S4805A_ORF S4359A_ORF S4359A_ORF S4769A_ORF S4769A_ORF S4753A_ORF S4753A_ORF S4752A_ORF S4752A_ORF S4745A_ORF S4745A_ORF S4742A_ORF S4742A_ORF S4731A_ORF S4731A_ORF S4729A_ORF S4729A_ORF

1,01 -0,08 -1,48 0,71 0,59 0,95 1,49 3,26 3,84 -0,21 1,03 0,60 0,79 -0,48 1,01 -0,45 0,03 -0,58 0,31 0,15 0,83 -0,71 0,91 0,55 1,50 -0,60 1,22 -1,49 -1,51 1,72 2,42 1,22 1,78 -1,69 -1,28 -0,44 0,03 0,57 0,37 0,69 2,02 -1,62 -2,57 0,01 0,41 0,00 1,12 -0,54 -0,65 -1,98 -0,56 0,59 0,98 -0,30 0,90

0,44 -0,18 -1,24 0,96 0,70 0,85 -0,43 0,32 -1,06 -0,58 -0,86 -1,43 -0,78 -0,70 -0,46 0,39 -0,13 -0,36 0,48 1,81 2,24 1,14 1,33 0,82 0,22 -0,30 -1,55 0,16 -1,06 0,90 -0,14 -1,59 -1,69 -1,30 -1,24 0,50 0,42 0,62 -0,16 1,34 1,54 -0,95 -1,08 0,21 -0,29 -1,19 -0,75 -0,08 -0,18 -1,46 -2,42 0,47 0,27 -1,29 0,41

2,74 0,05 -0,24 1,53 1,34 -0,60 -0,45 -0,14 0,14 -0,75 0,06 -1,65 -1,16 -0,79 0,63 -0,46 -0,81 0,14 -0,63 0,06 0,26 1,92 2,82 -0,18 0,56 -0,91 0,49 -0,34 -0,41 2,86 3,23 0,43 1,26 0,11 0,12 1,34 1,79 0,44 0,55 1,51 2,61 -0,86 -1,49 -1,13 0,24 -0,30 -0,62 -0,53 -2,88 -1,54 -1,72 1,45 1,93 -0,76 0,63

Anexo IV

CNB1344-0211 CNB1344-0211 CNB1344-0212 CNB1344-0212 CNB1344-0213 CNB1344-0213 CNB1344-0214 CNB1344-0214 CNB1344-0215 CNB1344-0215 CNB1344-0216 CNB1344-0216 CNB1344-0217 CNB1344-0217 CNB1344-0218 CNB1344-0218 CNB1344-0219 CNB1344-0219 CNB1344-0220 CNB1344-0220 CNB1344-0221 CNB1344-0221 CNB1344-0222 CNB1344-0222 CNB1344-0223 CNB1344-0223 CNB1344-0224 CNB1344-0224 CNB1344-0225 CNB1344-0225 CNB1344-0226 CNB1344-0226 CNB1344-0227 CNB1344-0227 CNB1344-0228 CNB1344-0228 CNB1344-0229 CNB1344-0229 CNB1344-0230 CNB1344-0230 CNB1344-0231 CNB1344-0231 CNB1344-0232 CNB1344-0232 CNB1344-0233 CNB1344-0233 CNB1344-0234 CNB1344-0234 CNB1344-0235 CNB1344-0235 CNB1344-0236 CNB1344-0236 CNB1344-0237 CNB1344-0237 CNB1344-0238

S4704A_ORF S4704A_ORF S4350A_ORF S4350A_ORF S4695A_ORF S4695A_ORF S4688A_ORF S4688A_ORF S4684A_ORF S4684A_ORF S4683A_ORF S4683A_ORF S4344A_ORF S4344A_ORF bisC bisC S4649A_ORF S4649A_ORF S4647A_ORF S4647A_ORF S4340A_ORF S4340A_ORF S4635A_ORF S4635A_ORF S4634A_ORF S4634A_ORF S4339A_ORF S4339A_ORF S4629A_ORF S4629A_ORF S4338A_ORF S4338A_ORF S4337A_ORF S4337A_ORF S4618A_ORF S4618A_ORF S4593A_ORF S4593A_ORF S4580A_ORF S4580A_ORF S4578A_ORF S4578A_ORF S4567A_ORF S4567A_ORF S4545A_ORF S4545A_ORF S4531A_ORF S4531A_ORF S4524A_ORF S4524A_ORF S4523A_ORF S4523A_ORF S4521A_ORF S4521A_ORF S4501A_ORF

-0,96 -0,42 -1,24 -0,24 -1,45 -0,67 -1,30 -0,31 -3,56 -2,45 -3,50 -2,55 0,63 0,53 -2,73 -0,95 2,46 2,97 -0,11 0,95 -0,23 -0,50 0,27 1,42 -0,49 -0,52 0,29 1,77 -2,12 -1,26 2,69 2,62 -0,05 0,16 0,09 -0,81 -0,80 0,11 -0,24 0,42 -0,09 0,82 -0,70 0,56 -1,30 -0,97 -2,36 -1,90 0,14 -1,07 0,12 -0,12 -0,04 -0,15 -1,61

0,28 -0,02 -1,04 -1,41 -1,58 -1,58 -0,83 -0,51 -2,02 -1,42 -2,03 -1,38 -0,13 -0,45 -3,03 -2,95 1,14 1,52 0,27 -0,05 0,39 -0,52 -0,77 0,05 -0,21 -0,39 0,14 -0,53 -1,33 -0,81 0,01 3,09 -0,41 0,32 -1,65 -0,97 -0,13 -0,14 -0,51 -1,00 0,56 -0,32 -0,34 -0,36 -0,27 -0,22 -1,32 -0,96 -0,57 -1,45 -0,11 -0,79 1,53 1,09 -0,87

-1,37 -0,76 -0,11 0,93 -1,23 -1,21 -0,66 -0,79 -3,56 -3,16 -3,33 -3,16 0,87 1,23 -2,96 -3,53 3,36 3,97 -0,92 0,11 0,16 -0,71 0,91 1,75 0,53 0,36 -0,35 -0,42 -0,52 -0,33 1,54 3,41 0,05 0,78 -1,02 -1,78 -0,32 0,40 -0,50 -0,68 0,66 -0,06 -1,20 0,31 -1,78 -1,43 -4,35 -2,71 -0,04 0,46 4,51 -2,05 -0,71 0,41 0,74

CNB1344-0238 CNB1344-0239 CNB1344-0239 CNB1344-0240 CNB1344-0240 CNB1344-0241 CNB1344-0241 CNB1344-0242 CNB1344-0242 CNB1344-0243 CNB1344-0243 CNB1344-0244 CNB1344-0244 CNB1344-0245 CNB1344-0245 CNB1344-0246 CNB1344-0246 CNB1344-0247 CNB1344-0247 CNB1344-0248 CNB1344-0248 CNB1344-0249 CNB1344-0249 CNB1344-0250 CNB1344-0250 CNB1344-0251 CNB1344-0251 CNB1344-0252 CNB1344-0252 CNB1344-0253 CNB1344-0253 CNB1344-0254 CNB1344-0254 CNB1344-0255 CNB1344-0255 CNB1344-0256 CNB1344-0256 CNB1344-0257 CNB1344-0257 CNB1344-0258 CNB1344-0258 CNB1344-0259 CNB1344-0259 CNB1344-0260 CNB1344-0260 CNB1344-0261 CNB1344-0261 CNB1344-0262 CNB1344-0262 CNB1344-0263 CNB1344-0263 CNB1344-0264 CNB1344-0264 CNB1344-0265 CNB1344-0265

307

S4501A_ORF S4498A_ORF S4498A_ORF S4495A_ORF S4495A_ORF S4487A_ORF S4487A_ORF S4478A_ORF S4478A_ORF S4476A_ORF S4476A_ORF S4466A_ORF S4466A_ORF S4320A_ORF S4320A_ORF S4460A_ORF S4460A_ORF S4452A_ORF S4452A_ORF S4437A_ORF S4437A_ORF S4414A_ORF S4414A_ORF S4413A_ORF S4413A_ORF S4312A_ORF S4312A_ORF S0014A_ORF S0014A_ORF S0013A_ORF S0013A_ORF S0012A_ORF S0012A_ORF S0011A_ORF S0011A_ORF ygeA ygeA S0112A_ORF S0112A_ORF trbA trbA S0111A_ORF S0111A_ORF ydfB ydfB ydfA ydfA S0108A_ORF S0108A_ORF ygaA ygaA psiA psiA psiB psiB

-2,00 0,88 0,60 0,40 0,05 -1,05 0,72 -0,46 -0,97 0,32 1,35 -0,83 -1,57 -1,39 -1,90 1,33 1,22 2,79 2,91 2,95 5,17 2,95 3,06 1,19 0,57 -0,36 0,14 0,74 1,97 2,00 2,94 -1,39 0,57 0,28 0,11 1,25 1,73 0,30 1,68 2,89 3,10 2,17 2,67 0,92 3,08 0,99 1,91 0,74 1,91 1,03 0,98 1,15 1,01 -0,13 2,03

-0,82 0,69 0,06 0,09 0,19 -0,36 -1,02 -0,19 0,34 0,53 0,77 -0,87 -0,77 -0,08 -0,19 -0,62 -0,57 1,47 1,62 0,40 1,50 1,67 1,75 -0,39 -1,02 -0,31 -1,06 1,64 2,51 0,97 1,31 2,07 2,64 0,83 1,06 1,63 0,74 1,07 1,13 -0,47 -0,42 3,01 2,81 1,30 1,04 1,15 -0,03 0,46 0,12 0,01 0,18 0,84 0,50 0,09 0,43

0,68 0,04 0,08 0,17 0,89 -0,62 0,52 1,74 0,55 0,27 1,57 -0,22 -1,51 0,86 -0,21 -0,58 0,66 3,69 3,86 1,67 5,05 4,38 4,19 1,49 1,03 -0,37 1,16 2,32 3,48 0,40 1,81 -0,99 -0,07 -0,11 0,07 3,80 4,25 3,04 3,64 0,64 1,08 7,02 6,69 1,76 2,68 1,10 1,35 0,29 0,93 0,68 -1,80 0,27 0,47 -0,81 0,61

Anexo IV

CNB1344-0266 CNB1344-0266 CNB1344-0267 CNB1344-0267 CNB1344-0268 CNB1344-0268 CNB1344-0269 CNB1344-0269 CNB1344-0270 CNB1344-0270 CNB1344-0271 CNB1344-0271 CNB1344-0272 CNB1344-0272 CNB1344-0273 CNB1344-0273 CNB1344-0274 CNB1344-0274 CNB1344-0275 CNB1344-0275 CNB1344-0276 CNB1344-0276 CNB1344-0277 CNB1344-0277 CNB1344-0278 CNB1344-0278 CNB1344-0279 CNB1344-0279 CNB1344-0280 CNB1344-0280 CNB1344-0281 CNB1344-0281 CNB1344-0282 CNB1344-0282 CNB1344-0283 CNB1344-0283 CNB1344-0284 CNB1344-0284 CNB1344-0285 CNB1344-0285 CNB1344-0286 CNB1344-0286 CNB1344-0287 CNB1344-0287 CNB1344-0288 CNB1344-0288 CNB1344-0289 CNB1344-0289 CNB1344-0290 CNB1344-0290 CNB1344-0291 CNB1344-0291 CNB1344-0292 CNB1344-0292 CNB1344-0293

orf62 1,62 1,85 1,32 CNB1344-0293 orf62 3,16 1,19 0,91 CNB1344-0294 S0103A_ORF 1,35 0,96 0,04 CNB1344-0294 S0103A_ORF 2,95 0,43 0,81 CNB1344-0295 ssb 3,13 0,41 2,40 CNB1344-0295 ssb 3,09 0,23 2,08 CNB1344-0296 ychA 0,55 -0,45 1,35 CNB1344-0296 ychA 2,07 -0,07 0,55 CNB1344-0297 S0100A_ORF 1,49 1,36 0,98 CNB1344-0297 S0100A_ORF 3,08 1,20 2,37 CNB1344-0298 yfhA 2,20 0,10 -0,05 CNB1344-0298 yfhA 3,03 0,24 0,85 CNB1344-0299 klcA 1,00 0,82 -0,25 CNB1344-0299 klcA 2,33 0,81 -0,48 CNB1344-0300 S0097A_ORF 4,25 -1,58 -0,33 CNB1344-0300 S0097A_ORF 4,46 -2,07 0,21 CNB1344-0301 yceB 2,38 0,88 0,17 CNB1344-0301 yceB 4,16 0,73 2,64 CNB1344-0302 yceA 0,28 0,43 -0,82 CNB1344-0302 yceA 3,13 0,63 3,72 CNB1344-0303 ycdA 3,72 0,81 2,68 CNB1344-0303 ycdA 8,01 1,99 6,45 CNB1344-0304 trbB 0,86 0,27 -0,41 CNB1344-0304 trbB 0,62 -0,32 -0,03 CNB1344-0305 nikA -0,29 0,26 -0,06 CNB1344-0305 nikA 1,75 0,66 -0,62 CNB1344-0306 yccB 1,30 1,92 0,95 CNB1344-0306 yccB 1,97 1,76 0,30 CNB1344-0307 S0092A_ORF 1,52 1,61 0,36 CNB1344-0307 S0092A_ORF 2,73 1,93 1,17 CNB1344-0308 S0091A_ORF 1,79 1,57 -1,04 CNB1344-0308 S0091A_ORF 2,56 1,43 0,73 CNB1344-0309 stbB 1,08 1,82 0,07 CNB1344-0309 stbB 2,49 1,71 0,73 CNB1344-0310 stbA 0,54 1,20 -0,59 CNB1344-0310 stbA 0,92 1,16 -0,65 CNB1344-0311 orf78 2,39 1,31 3,51 CNB1344-0311 orf78 2,90 0,98 3,58 CNB1344-0312 parA 0,32 0,56 0,56 CNB1344-0312 parA -0,44 0,81 0,48 CNB1344-0313 resD 0,16 1,13 0,36 CNB1344-0313 resD 1,07 0,10 -0,48 CNB1344-0314 S0085A_ORF 0,61 0,91 -0,58 CNB1344-0314 S0085A_ORF 1,50 0,70 -0,22 CNB1344-0315 S0084A_ORF 3,56 0,85 0,08 CNB1344-0315 S0084A_ORF 1,24 0,17 1,62 CNB1344-0316 S0083A_ORF -0,57 -0,51 -1,33 CNB1344-0316 S0083A_ORF 0,35 -0,89 0,49 CNB1344-0317 S0082A_ORF 0,98 0,44 -1,26 CNB1344-0317 S0082A_ORF 1,11 0,62 -0,55 CNB1344-0318 S0080A_ORF 0,90 2,08 1,25 CNB1344-0318 S0080A_ORF 0,71 1,22 -1,11 CNB1344-0319 S0081A_ORF 2,62 0,92 0,39 CNB1344-0319 S0081A_ORF 2,73 0,77 -0,43 CNB1344-0320 S0079A_ORF 0,10 2,05 -0,02 CNB1344-0320

308

S0079A_ORF cib cib trbC trbC yagA yagA yafB yafB yafA yafA yaeB yaeB S0073A_ORF S0073A_ORF yggA yggA yadA yadA yacC yacC S0070A_ORF S0070A_ORF yacA yacA S0068A_ORF S0068A_ORF S0067A_ORF S0067A_ORF repA repA S0065A_ORF S0065A_ORF S0064A_ORF S0064A_ORF traA traA S0062A_ORF S0062A_ORF traB traB traC traC S0059A_ORF S0059A_ORF pilI pilI pilJ pilJ pilK pilK pilL pilL pilM pilM

-0,47 -0,29 1,10 0,58 1,86 2,17 3,30 0,96 2,70 1,67 1,77 0,69 2,06 -0,40 1,23 1,67 2,25 1,69 2,92 1,36 2,72 1,44 2,72 1,99 2,27 1,07 2,45 -1,71 -1,40 1,17 2,20 -0,17 0,44 2,50 1,76 0,41 1,72 -0,39 0,92 0,24 0,85 1,69 2,90 1,45 3,24 0,89 1,72 2,95 3,49 0,35 2,58 -0,05 4,08 1,12 3,18

2,14 1,80 2,58 1,12 0,85 2,23 2,40 0,86 0,64 1,38 1,63 1,74 1,54 0,67 0,46 0,56 0,13 1,27 0,69 2,63 2,17 1,38 0,91 2,86 2,53 1,20 -0,03 -0,07 -0,24 -0,18 -0,15 1,12 0,29 1,62 1,09 1,04 1,36 1,96 1,44 1,51 0,10 1,40 0,74 1,16 1,16 0,34 -0,67 0,28 0,21 0,19 -1,53 0,49 -0,75 0,19 -0,32

-0,57 -1,02 1,06 -1,26 -0,50 -0,27 3,37 1,06 1,39 1,78 2,07 0,24 1,20 -0,71 0,58 0,56 0,93 1,21 2,51 0,49 1,21 0,95 1,72 2,68 3,15 0,55 -0,04 -1,77 -0,96 -1,09 0,07 0,79 0,95 2,47 2,32 0,07 0,77 1,07 0,55 0,64 -0,53 0,43 0,94 0,01 1,39 1,41 0,14 0,83 2,53 0,31 -0,01 0,53 2,40 0,07 1,70

Anexo IV

CNB1344-0321 CNB1344-0321 CNB1344-0322 CNB1344-0322 CNB1344-0323 CNB1344-0323 CNB1344-0324 CNB1344-0324 CNB1344-0325 CNB1344-0325 CNB1344-0326 CNB1344-0326 CNB1344-0327 CNB1344-0327 CNB1344-0328 CNB1344-0328 CNB1344-0329 CNB1344-0329 CNB1344-0330 CNB1344-0330 CNB1344-0331 CNB1344-0331 CNB1344-0332 CNB1344-0332 CNB1344-0333 CNB1344-0333 CNB1344-0334 CNB1344-0334 CNB1344-0335 CNB1344-0335 CNB1344-0336 CNB1344-0336 CNB1344-0337 CNB1344-0337 CNB1344-0338 CNB1344-0338 CNB1344-0339 CNB1344-0339 CNB1344-0340 CNB1344-0340 CNB1344-0341 CNB1344-0341 CNB1344-0342 CNB1344-0342 CNB1344-0343 CNB1344-0343 CNB1344-0344 CNB1344-0344 CNB1344-0345 CNB1344-0345 CNB1344-0346 CNB1344-0346 CNB1344-0347 CNB1344-0347 CNB1344-0348

pilN pilN pilO pilO pilP pilP pilQ pilQ pilR pilR pilS pilS pilT pilT S0004A_ORF S0004A_ORF pilU pilU S0045A_ORF S0045A_ORF S0044A_ORF S0044A_ORF S0043A_ORF S0043A_ORF rci rci traE traE traF traF ais ais S0038A_ORF S0038A_ORF traH traH traI traI traJ traJ traK traK sogL sogL traL traL traM traM traN traN traO traO traP traP traQ

0,03 2,11 1,41 2,30 0,46 1,68 2,32 3,05 2,53 3,36 0,71 2,23 0,95 1,71 -0,16 0,29 0,46 0,91 2,21 1,36 1,76 3,25 1,03 2,10 0,35 2,40 1,63 3,83 1,94 -0,48 0,65 1,47 0,40 0,88 -0,35 0,33 0,65 0,28 -1,31 2,12 1,71 2,12 2,57 3,58 1,42 2,11 0,67 2,55 -0,79 0,59 4,11 4,15 3,18 1,88 1,20

0,93 0,40 0,25 0,35 0,20 0,23 1,04 -0,02 0,95 0,58 0,66 0,88 0,04 -0,40 1,18 -0,41 0,22 0,13 2,14 0,22 1,41 1,69 0,88 0,96 0,62 0,40 0,77 -0,06 0,77 -1,10 -0,52 -0,47 -0,19 -0,61 0,00 -0,39 0,95 -0,89 -1,14 -3,19 0,33 0,19 0,39 -0,24 1,28 0,49 -0,29 -0,59 2,21 -0,06 1,75 -0,23 0,28 0,15 0,94

-1,01 1,10 0,95 1,58 -0,89 0,51 1,13 0,77 0,71 1,47 -0,11 1,38 0,52 1,42 -0,63 -0,07 -0,11 -0,69 1,84 0,44 0,34 1,20 1,59 2,95 0,16 0,92 -0,55 2,09 0,05 -0,59 -0,18 0,84 -0,11 0,32 0,84 -0,47 1,39 -0,32 0,35 0,83 0,01 0,87 0,62 2,05 1,06 1,56 0,11 1,20 1,81 1,71 3,25 3,79 -0,02 0,54 0,74

CNB1344-0348 CNB1344-0349 CNB1344-0349 CNB1344-0350 CNB1344-0350 CNB1344-0351 CNB1344-0351 CNB1344-0352 CNB1344-0352 CNB1344-0353 CNB1344-0353 CNB1344-0354 CNB1344-0354 CNB1344-0355 CNB1344-0355 CNB1344-0356 CNB1344-0356 CNB1344-0357 CNB1344-0357 CNB1344-0358 CNB1344-0358 CNB1344-0359 CNB1344-0359 CNB1344-0360 CNB1344-0360 CNB1344-0361 CNB1344-0361 CNB1344-0362 CNB1344-0362 CNB1344-0363 CNB1344-0363 CNB1344-0364 CNB1344-0364 CNB1344-0365 CNB1344-0365 CNB1344-0366 CNB1344-0366 CNB1344-0367 CNB1344-0367 CNB1344-0368 CNB1344-0368 CNB1344-0369 CNB1344-0369 CNB1344-0370 CNB1344-0370 CNB1344-0371 CNB1344-0371 CNB1344-0372 CNB1344-0372 CNB1344-0373 CNB1344-0373 CNB1344-0374 CNB1344-0374 CNB1344-0375 CNB1344-0375

309

traQ traR traR traS traS traT traT traU traU traV traV traW traW traX traX traY traY nikB nikB exc exc S0017A_ORF S0017A_ORF S0016A_ORF S0016A_ORF S0015A_ORF S0015A_ORF S4272A_ORF S4272A_ORF S4252A_ORF S4252A_ORF S4246A_ORF S4246A_ORF S4237A_ORF S4237A_ORF S4236A_ORF S4236A_ORF S4229A_ORF S4229A_ORF S4223A_ORF S4223A_ORF S4222A_ORF S4222A_ORF S4199A_ORF S4199A_ORF S4198A_ORF S4198A_ORF S4190A_ORF S4190A_ORF S4185A_ORF S4185A_ORF S4180A_ORF S4180A_ORF S4150A_ORF S4150A_ORF

2,95 0,86 2,30 2,63 3,86 3,32 3,12 1,39 2,90 1,88 3,01 1,23 3,16 -0,16 0,80 1,45 2,15 2,17 3,44 0,88 1,63 2,37 3,72 2,60 3,63 1,15 3,02 -1,10 -0,63 -0,57 0,37 0,26 -0,99 0,20 1,97 2,48 2,39 -0,83 -0,76 0,25 1,46 0,17 2,54 -0,88 0,40 0,56 1,47 0,04 0,74 -0,56 -0,96 0,07 1,21 -0,99 0,05

-0,50 0,42 -0,40 0,08 0,61 2,08 0,50 0,79 0,60 1,16 0,53 1,87 0,15 0,60 0,22 -0,17 -0,97 0,92 0,79 1,34 0,78 0,77 1,26 2,15 1,79 1,99 1,91 -0,39 -0,24 -0,22 -0,34 0,15 0,11 -0,51 -0,89 -1,95 -3,01 -0,32 -0,39 0,56 -0,64 -0,57 -0,27 -0,14 -0,27 -0,81 -0,63 0,23 -0,20 -0,47 1,09 -1,30 -0,90 -1,81 -1,18

1,35 0,58 1,58 -0,23 1,36 1,61 2,48 1,48 1,01 -0,08 1,81 0,78 1,50 0,70 -0,71 -0,20 1,63 1,38 0,73 0,35 0,64 2,16 3,23 3,03 3,56 2,21 2,86 -0,08 0,52 1,08 1,95 0,33 -0,33 -0,93 -0,18 1,75 1,87 -0,44 -0,14 0,64 1,31 -1,81 0,01 2,40 2,24 0,54 1,26 -0,24 -0,04 -0,52 -0,31 -0,10 -0,09 -0,16 -0,01

Anexo IV

CNB1344-0376 CNB1344-0376 CNB1344-0377 CNB1344-0377 CNB1344-0378 CNB1344-0378 CNB1344-0379 CNB1344-0379 CNB1344-0380 CNB1344-0380 CNB1344-0381 CNB1344-0381 CNB1344-0382 CNB1344-0382 CNB1344-0383 CNB1344-0383 CNB1344-0384 CNB1344-0384 CNB1344-0385 CNB1344-0385 CNB1344-0386 CNB1344-0386 CNB1344-0387 CNB1344-0387 CNB1344-0388 CNB1344-0388 CNB1344-0389 CNB1344-0389 CNB1344-0390 CNB1344-0390 CNB1344-0391 CNB1344-0391 CNB1344-0392 CNB1344-0392 CNB1344-0393 CNB1344-0393 CNB1344-0394 CNB1344-0394 CNB1344-0395 CNB1344-0395 CNB1344-0396 CNB1344-0396 CNB1344-0397 CNB1344-0397 CNB1344-0398 CNB1344-0398 CNB1344-0399 CNB1344-0399 CNB1344-0400 CNB1344-0400 CNB1344-0401 CNB1344-0401 CNB1344-0402 CNB1344-0402 CNB1344-0403

S4140A_ORF S4140A_ORF S4131A_ORF S4131A_ORF S4129A_ORF S4129A_ORF S4125A_ORF S4125A_ORF S3381A_ORF S3381A_ORF S4114A_ORF S4114A_ORF S4085A_ORF S4085A_ORF S4080A_ORF S4080A_ORF S4070A_ORF S4070A_ORF S4063A_ORF S4063A_ORF S4048A_ORF S4048A_ORF S4033A_ORF S4033A_ORF S4029A_ORF S4029A_ORF S4021A_ORF S4021A_ORF S3370A_ORF S3370A_ORF S4002A_ORF S4002A_ORF S3991A_ORF S3991A_ORF S3988A_ORF S3988A_ORF S3972A_ORF S3972A_ORF S3971A_ORF S3971A_ORF S3970A_ORF S3970A_ORF S3963A_ORF S3963A_ORF S3959A_ORF S3959A_ORF S3360A_ORF S3360A_ORF S3924A_ORF S3924A_ORF S3923A_ORF S3923A_ORF S3918A_ORF S3918A_ORF S3917A_ORF

-0,83 0,18 0,75 0,09 0,06 -0,49 -2,58 -2,43 -0,23 -1,04 -1,14 -0,13 -0,73 -0,23 0,36 0,20 -0,75 -0,17 -0,43 0,76 -2,79 0,14 -2,39 -0,60 0,00 -0,96 -0,76 1,02 -0,24 0,93 -1,08 -0,11 -2,51 -2,27 -1,99 -2,24 -0,25 1,14 2,13 2,77 0,44 1,37 2,29 4,43 0,19 1,27 -1,57 -0,06 0,53 0,27 -0,28 0,58 1,03 0,27 -0,33

-0,08 0,08 -0,63 -0,13 -0,48 0,49 1,00 -0,18 -0,57 0,12 -2,52 -3,99 -0,29 0,38 -1,81 -1,82 0,27 0,06 -1,51 -2,36 -0,99 0,37 -1,04 -0,36 -0,55 -0,14 -0,15 -0,02 0,35 0,41 -1,51 -0,62 -0,87 -0,39 -0,54 -0,25 -0,84 -0,34 1,28 1,63 -0,57 -0,57 0,67 1,58 0,10 0,30 -0,67 -0,65 0,27 0,75 -0,04 0,31 1,54 1,06 -0,59

-0,43 0,61 0,58 0,96 1,39 1,63 -0,43 -0,60 0,43 0,28 -2,16 -2,09 1,00 1,44 -1,22 -0,26 0,53 1,46 0,29 0,68 -0,25 -0,22 -1,45 -0,98 -0,57 -1,14 -0,87 0,16 0,11 1,71 -0,56 0,40 -2,27 -2,12 -1,13 -0,21 -0,04 0,93 2,70 2,10 -0,32 0,69 2,21 3,98 0,03 1,60 -0,80 -0,54 1,10 1,95 -0,73 -0,27 2,42 2,06 1,15

CNB1344-0403 CNB1344-0404 CNB1344-0404 CNB1344-0405 CNB1344-0405 CNB1344-0406 CNB1344-0406 CNB1344-0407 CNB1344-0407 CNB1344-0408 CNB1344-0408 CNB1344-0409 CNB1344-0409 CNB1344-0410 CNB1344-0410 CNB1344-0411 CNB1344-0411 CNB1344-0412 CNB1344-0412 CNB1344-0413 CNB1344-0413 CNB1344-0414 CNB1344-0414 CNB1344-0415 CNB1344-0415 CNB1344-0416 CNB1344-0416 CNB1344-0417 CNB1344-0417 CNB1344-0418 CNB1344-0418 CNB1344-0419 CNB1344-0419 CNB1344-0420 CNB1344-0420 CNB1344-0421 CNB1344-0421 CNB1344-0422 CNB1344-0422 CNB1344-0423 CNB1344-0423 CNB1344-0424 CNB1344-0424 CNB1344-0425 CNB1344-0425 CNB1344-0426 CNB1344-0426 CNB1344-0427 CNB1344-0427 CNB1344-0428 CNB1344-0428 CNB1344-0429 CNB1344-0429 CNB1344-0430 CNB1344-0430

310

S3917A_ORF S3913A_ORF S3913A_ORF S3892A_ORF S3892A_ORF S3891A_ORF S3891A_ORF S3878A_ORF S3878A_ORF S3872A_ORF S3872A_ORF S3871A_ORF S3871A_ORF S3867A_ORF S3867A_ORF S3833A_ORF S3833A_ORF S3828A_ORF S3828A_ORF S3827A_ORF S3827A_ORF S3818A_ORF S3818A_ORF cutF cutF S3770A_ORF S3770A_ORF S3766A_ORF S3766A_ORF S3751A_ORF S3751A_ORF S3744A_ORF S3744A_ORF S3726A_ORF S3726A_ORF S3725A_ORF S3725A_ORF S3721A_ORF S3721A_ORF S3718A_ORF S3718A_ORF S3714A_ORF S3714A_ORF S3713A_ORF S3713A_ORF S3712A_ORF S3712A_ORF S3711A_ORF S3711A_ORF S3706A_ORF S3706A_ORF rtcB rtcB S3689A_ORF S3689A_ORF

0,07 0,51 -0,27 0,50 0,98 -1,78 -2,18 -0,56 0,02 -2,57 -3,27 -2,12 -1,31 1,81 1,70 0,11 0,44 -1,17 0,83 -0,79 -1,06 -1,62 -0,37 1,06 2,90 -0,57 0,14 -1,07 -0,37 -0,32 0,83 0,44 0,56 1,54 2,64 -0,82 1,64 2,39 0,95 4,22 6,19 0,86 2,33 0,19 0,95 0,78 1,97 0,31 1,61 -0,55 -0,60 0,14 1,43 -0,35 -1,48

-0,02 -1,04 0,09 0,14 -0,58 -0,12 -1,28 -0,83 -0,83 -1,73 -1,15 -1,39 -0,58 -0,78 -0,58 0,11 0,54 -0,81 -1,24 0,57 1,13 -0,69 -1,50 0,10 0,11 -0,09 0,67 0,12 0,30 -1,55 -1,44 0,75 0,54 1,06 1,04 1,06 0,02 1,99 1,65 1,72 0,86 0,00 -1,08 0,47 0,97 1,23 1,07 0,35 0,44 0,55 -0,64 1,79 1,77 -0,49 -1,02

1,57 -0,74 -0,83 -1,76 -0,94 -1,95 -2,28 -0,59 0,23 -2,95 -3,38 -3,48 -2,46 1,65 2,43 -0,31 0,33 -0,46 1,43 0,55 -0,76 -1,24 -1,49 0,42 -0,13 -0,23 0,06 -1,47 -1,11 -1,09 -0,33 1,53 1,50 2,36 3,17 1,90 1,55 3,13 2,79 3,20 3,90 1,23 1,41 2,20 3,63 0,56 2,60 0,79 2,04 0,66 -0,16 -0,83 -0,30 -0,23 -1,05

Anexo IV

CNB1344-0431 CNB1344-0431 CNB1344-0432 CNB1344-0432 CNB1344-0433 CNB1344-0433 CNB1344-0434 CNB1344-0434 CNB1344-0435 CNB1344-0435 CNB1344-0436 CNB1344-0436 CNB1344-0437 CNB1344-0437 CNB1344-0438 CNB1344-0438 CNB1344-0439 CNB1344-0439 CNB1344-0440 CNB1344-0440 CNB1344-0441 CNB1344-0441 CNB1344-0442 CNB1344-0442 CNB1344-0443 CNB1344-0443 CNB1344-0444 CNB1344-0444 CNB1344-0445 CNB1344-0445 CNB1344-0446 CNB1344-0446 CNB1344-0447 CNB1344-0447 CNB1344-0448 CNB1344-0448 CNB1344-0449 CNB1344-0449 CNB1344-0450 CNB1344-0450 CNB1344-0451 CNB1344-0451 CNB1344-0452 CNB1344-0452 CNB1344-0453 CNB1344-0453 CNB1344-0454 CNB1344-0454 CNB1344-0455 CNB1344-0455 CNB1344-0456 CNB1344-0456 CNB1344-0457 CNB1344-0457 CNB1344-0458

S3684A_ORF S3684A_ORF S3683A_ORF S3683A_ORF S3294A_ORF S3294A_ORF S3664A_ORF S3664A_ORF S3653A_ORF S3653A_ORF S3642A_ORF S3642A_ORF S3640A_ORF S3640A_ORF S3634A_ORF S3634A_ORF S3633A_ORF S3633A_ORF S3621A_ORF S3621A_ORF S3607A_ORF S3607A_ORF S3325A_ORF S3325A_ORF S3604A_ORF S3604A_ORF S3597A_ORF S3597A_ORF S3572A_ORF S3572A_ORF S3320A_ORF S3320A_ORF S3558A_ORF S3558A_ORF S3555A_ORF S3555A_ORF S3510A_ORF S3510A_ORF S3488A_ORF S3488A_ORF S3487A_ORF S3487A_ORF S3442A_ORF S3442A_ORF S3437A_ORF S3437A_ORF S3435A_ORF S3435A_ORF S3427A_ORF S3427A_ORF S3302A_ORF S3302A_ORF S4286A_ORF S4286A_ORF S3288A_ORF

-0,50 1,02 0,20 2,21 -2,60 -1,50 -0,78 0,89 -0,01 0,42 -0,39 -0,68 -0,20 -0,60 -0,77 -1,18 1,11 1,76 -0,69 -0,05 -0,60 -0,89 -0,57 1,14 -2,20 -1,83 -2,45 -2,38 0,23 -0,24 1,15 0,31 -1,66 -2,34 -2,03 -1,41 0,11 1,38 -0,03 -1,21 -0,87 0,40 3,20 5,91 0,35 2,15 -0,36 1,23 -1,61 -0,07 -0,74 -1,41 0,09 1,94 1,15

-0,73 -1,56 -0,91 -1,15 -1,46 -0,96 1,14 0,34 0,74 1,12 1,18 1,02 -0,88 -1,19 -0,74 -0,46 2,04 1,08 2,42 0,08 0,22 -0,13 1,92 2,98 -0,52 -1,55 -1,78 -2,43 0,66 -0,04 -1,96 -0,52 -1,87 -2,22 -2,07 -0,99 0,33 2,32 0,02 0,21 -0,04 0,53 0,88 0,19 0,26 -0,25 0,40 0,42 -0,16 -0,69 0,76 0,04 -0,26 -1,19 0,80

-0,14 -0,55 -1,12 0,68 -2,37 -2,08 0,83 0,23 0,80 1,23 2,76 3,31 -0,45 0,59 -0,13 -0,36 2,03 2,40 1,92 1,93 -0,20 -0,69 1,43 1,73 -0,96 -0,23 -2,53 -3,31 0,68 0,77 -0,81 2,83 -1,16 -1,58 -1,65 -0,23 1,57 1,74 -1,05 -0,52 0,42 -0,70 3,09 4,97 -0,97 0,28 -1,26 -0,23 -1,02 -0,02 0,21 -0,36 0,77 2,14 -0,06

CNB1344-0458 CNB1344-0459 CNB1344-0459 CNB1344-0460 CNB1344-0460 CNB1344-0461 CNB1344-0461 CNB1344-0462 CNB1344-0462 CNB1344-0463 CNB1344-0463 CNB1344-0464 CNB1344-0464 CNB1344-0465 CNB1344-0465 CNB1344-0466 CNB1344-0466 CNB1344-0467 CNB1344-0467 CNB1344-0468 CNB1344-0468 CNB1344-0469 CNB1344-0469 CNB1344-0470 CNB1344-0470 CNB1344-0471 CNB1344-0471 CNB1344-0472 CNB1344-0472 CNB1344-0473 CNB1344-0473 CNB1344-0474 CNB1344-0474 CNB1344-0475 CNB1344-0475 CNB1344-0476 CNB1344-0476 CNB1344-0477 CNB1344-0477 CNB1344-0478 CNB1344-0478 CNB1344-0479 CNB1344-0479 CNB1344-0480 CNB1344-0480 CNB1344-0481 CNB1344-0481 CNB1344-0482 CNB1344-0482 CNB1344-0483 CNB1344-0483 CNB1344-0484 CNB1344-0484 CNB1344-0485 CNB1344-0485

311

S3288A_ORF S3078A_ORF S3078A_ORF S3073A_ORF S3073A_ORF S3071A_ORF S3071A_ORF S3058A_ORF S3058A_ORF S3056A_ORF S3056A_ORF S3045A_ORF S3045A_ORF S3041A_ORF S3041A_ORF S3037A_ORF S3037A_ORF S3033A_ORF S3033A_ORF S2182A_ORF S2182A_ORF S3020A_ORF S3020A_ORF S3019A_ORF S3019A_ORF S3018A_ORF S3018A_ORF S2180A_ORF S2180A_ORF S3014A_ORF S3014A_ORF S2179A_ORF S2179A_ORF S3001A_ORF S3001A_ORF S2998A_ORF S2998A_ORF ALPHA ALPHA S2989A_ORF S2989A_ORF S2988A_ORF S2988A_ORF S2987A_ORF S2987A_ORF S2986A_ORF S2986A_ORF S2985A_ORF S2985A_ORF SID SID PSU PSU S2982A_ORF S2982A_ORF

2,99 0,97 0,86 0,82 0,80 0,48 0,74 -0,69 -0,50 -1,23 1,16 -0,16 0,42 -0,02 2,11 -1,14 -0,58 0,29 1,05 -0,97 1,30 -0,18 1,95 0,18 1,48 0,36 1,13 -0,10 0,90 -0,07 0,26 0,75 1,77 0,55 -0,30 0,00 1,19 1,54 0,83 -0,93 0,36 -0,22 0,30 -0,63 0,79 0,47 0,57 0,68 3,89 0,62 1,55 0,38 0,66 -0,80 -0,37

0,53 0,87 0,37 -2,77 -3,10 0,76 0,89 -0,12 -0,56 0,93 1,05 2,67 2,59 2,10 1,93 -0,19 -0,03 6,31 6,61 1,26 0,74 -0,36 -0,38 0,96 1,01 0,16 -0,17 0,21 0,64 0,27 -0,09 1,13 1,10 -1,55 0,08 -1,03 0,39 1,44 0,46 -0,32 -1,10 -1,09 -0,95 -0,37 -0,04 -0,27 -0,73 -0,83 -0,03 0,02 0,33 1,05 -0,53 -0,68 -0,69

0,42 1,07 1,40 -0,98 -0,67 -0,32 0,36 -0,46 -0,05 -1,64 0,30 2,08 2,48 0,07 0,92 -0,67 -0,49 -0,12 1,54 -0,74 2,52 0,25 1,49 0,66 0,75 1,29 1,58 -0,23 0,93 -1,25 -1,10 -0,69 0,85 -0,18 -2,91 -0,09 1,66 1,99 1,91 -1,92 -0,83 -1,07 -0,40 0,22 1,37 0,05 0,22 0,25 3,16 1,08 1,77 1,32 1,68 -0,59 -0,97

Anexo IV

CNB1344-0486 CNB1344-0486 CNB1344-0487 CNB1344-0487 CNB1344-0488 CNB1344-0488 CNB1344-0489 CNB1344-0489 CNB1344-0490 CNB1344-0490 CNB1344-0491 CNB1344-0491 CNB1344-0492 CNB1344-0492 CNB1344-0493 CNB1344-0493 CNB1344-0494 CNB1344-0494 CNB1344-0495 CNB1344-0495 CNB1344-0496 CNB1344-0496 CNB1344-0497 CNB1344-0497 CNB1344-0498 CNB1344-0498 CNB1344-0499 CNB1344-0499 CNB1344-0500 CNB1344-0500 CNB1344-0501 CNB1344-0501 CNB1344-0502 CNB1344-0502 CNB1344-0503 CNB1344-0503 CNB1344-0504 CNB1344-0504 CNB1344-0505 CNB1344-0505 CNB1344-0506 CNB1344-0506 CNB1344-0507 CNB1344-0507 CNB1344-0508 CNB1344-0508 CNB1344-0509 CNB1344-0509 CNB1344-0510 CNB1344-0510 CNB1344-0511 CNB1344-0511 CNB1344-0512 CNB1344-0512 CNB1344-0513

S2981A_ORF S2981A_ORF INT INT S2979A_ORF S2979A_ORF S2978A_ORF S2978A_ORF S2974A_ORF S2974A_ORF CP80 CP80 S2176A_ORF S2176A_ORF S2967A_ORF S2967A_ORF S2965A_ORF S2965A_ORF S2964A_ORF S2964A_ORF S2963A_ORF S2963A_ORF S2962A_ORF S2962A_ORF smf smf ISPLU3D ISPLU3D S2951A_ORF S2951A_ORF S2174A_ORF S2174A_ORF S2173A_ORF S2173A_ORF S2943A_ORF S2943A_ORF sopE sopE S2940A_ORF S2940A_ORF S2939A_ORF S2939A_ORF S2931A_ORF S2931A_ORF S2170A_ORF S2170A_ORF S2169A_ORF S2169A_ORF S2925A_ORF S2925A_ORF S2924A_ORF S2924A_ORF INT INT S2908A_ORF

0,42 0,30 -1,04 -1,35 1,37 2,09 4,37 2,47 -1,03 -1,01 -0,53 -0,22 -0,22 0,65 0,24 0,60 -0,78 0,99 1,13 -1,02 -0,87 -0,54 0,79 0,52 -0,51 -0,02 0,24 2,67 1,19 3,87 -0,62 1,06 -0,84 0,08 0,32 0,30 -0,65 -0,11 -0,46 -1,57 0,79 1,87 -1,39 -1,10 -0,14 1,06 0,48 1,24 -0,36 -0,27 1,63 1,85 -1,88 -1,80 0,20

1,71 0,63 0,13 0,14 5,08 4,49 1,45 2,43 0,16 -0,44 0,03 -1,00 0,63 0,57 -0,93 -0,53 0,17 0,29 -0,47 -0,75 -0,14 0,42 -0,02 1,89 -0,42 -0,32 -0,54 0,37 1,18 -0,50 -0,25 0,07 -1,35 -1,61 0,41 0,74 -0,43 -1,06 -0,62 -1,06 -0,40 0,20 1,55 1,77 -0,48 0,04 0,37 -0,20 0,98 -0,22 2,24 1,98 0,63 -0,63 -0,13

0,99 0,94 0,47 0,79 5,37 5,78 4,15 5,25 -0,89 0,74 -0,76 -0,91 -1,18 0,77 -1,07 -0,05 -0,68 1,64 -0,59 -1,37 -0,26 -1,18 1,57 0,43 -0,54 -0,18 0,56 2,84 1,09 1,44 -0,62 -0,31 -1,21 -1,11 -0,22 -0,06 0,06 -0,57 0,52 -0,25 0,49 0,63 2,32 2,85 -0,62 0,17 0,18 1,94 1,76 1,80 3,85 3,85 0,44 -2,18 -1,08

CNB1344-0513 CNB1344-0514 CNB1344-0514 CNB1344-0515 CNB1344-0515 CNB1344-0516 CNB1344-0516 CNB1344-0517 CNB1344-0517 CNB1344-0518 CNB1344-0518 CNB1344-0519 CNB1344-0519 CNB1344-0520 CNB1344-0520 CNB1344-0521 CNB1344-0521 CNB1344-0522 CNB1344-0522 CNB1344-0523 CNB1344-0523 CNB1344-0524 CNB1344-0524 CNB1344-0525 CNB1344-0525 CNB1344-0526 CNB1344-0526 CNB1344-0527 CNB1344-0527 CNB1344-0528 CNB1344-0528 CNB1344-0529 CNB1344-0529 CNB1344-0530 CNB1344-0530 CNB1344-0531 CNB1344-0531 CNB1344-0532 CNB1344-0532 CNB1344-0533 CNB1344-0533 CNB1344-0534 CNB1344-0534 CNB1344-0535 CNB1344-0535 CNB1344-0536 CNB1344-0536 CNB1344-0537 CNB1344-0537 CNB1344-0538 CNB1344-0538 CNB1344-0539 CNB1344-0539 CNB1344-0540 CNB1344-0540

312

S2908A_ORF sb29 sb29 S2907A_ORF S2907A_ORF S2906A_ORF S2906A_ORF S2905A_ORF S2905A_ORF S2904A_ORF S2904A_ORF CP80 CP80 S2902A_ORF S2902A_ORF S2901A_ORF S2901A_ORF sb30 sb30 CII CII S2899A_ORF S2899A_ORF S2898A_ORF S2898A_ORF yebY yebY INT INT S2893A_ORF S2893A_ORF sb31 sb31 sb32 sb32 S2883A_ORF S2883A_ORF S2880A_ORF S2880A_ORF sb33 sb33 sb34 sb34 yfdR yfdR S2862A_ORF S2862A_ORF yfdQ yfdQ S2156A_ORF S2156A_ORF S2155A_ORF S2155A_ORF recE recE

1,07 -0,24 0,82 -1,04 -0,84 2,34 1,76 1,01 1,55 1,00 1,21 -0,24 2,05 2,50 2,65 0,03 1,81 -0,46 0,46 -0,97 2,48 -1,15 1,02 -1,38 -0,69 -1,45 0,65 -0,28 0,51 2,87 2,72 -0,32 0,05 -0,21 0,26 -1,48 -0,73 0,51 0,68 0,57 0,96 0,83 1,51 -0,09 -0,25 -0,67 0,17 -0,56 0,31 0,47 0,84 -0,29 0,16 2,80 3,68

0,19 0,73 0,40 0,31 0,70 -0,65 -0,78 -0,01 -0,34 0,28 -0,39 -0,02 -0,46 -2,46 -3,14 0,59 0,53 -0,09 -0,51 -1,58 -0,99 -0,98 -0,75 -0,21 -0,15 -0,32 0,03 0,50 0,60 2,68 2,40 1,39 0,90 0,44 0,22 -0,06 0,01 0,09 0,26 0,89 0,00 -1,05 -1,18 -0,09 0,20 0,12 0,48 0,21 -0,97 0,37 0,60 -1,20 -1,40 0,48 -0,12

-1,21 1,36 1,19 -0,63 0,24 -0,86 1,38 0,29 1,38 0,30 1,27 -0,90 0,63 1,13 3,02 0,34 1,30 0,39 0,30 -1,42 -0,07 -1,86 1,63 -1,51 -1,71 -1,07 -1,05 -0,08 0,26 3,82 3,93 0,02 0,52 -0,30 -0,69 0,98 1,39 0,45 0,58 0,29 0,75 -0,05 1,35 0,47 -0,60 -0,12 0,98 -1,57 -0,36 -1,18 -0,24 -0,27 0,04 -0,12 1,06

Anexo IV

CNB1344-0541 CNB1344-0541 CNB1344-0542 CNB1344-0542 CNB1344-0543 CNB1344-0543 CNB1344-0544 CNB1344-0544 CNB1344-0545 CNB1344-0545 CNB1344-0546 CNB1344-0546 CNB1344-0547 CNB1344-0547 CNB1344-0548 CNB1344-0548 CNB1344-0549 CNB1344-0549 CNB1344-0550 CNB1344-0550 CNB1344-0551 CNB1344-0551 CNB1344-0552 CNB1344-0552 CNB1344-0553 CNB1344-0553 CNB1344-0554 CNB1344-0554 CNB1344-0555 CNB1344-0555 CNB1344-0556 CNB1344-0556 CNB1344-0557 CNB1344-0557 CNB1344-0558 CNB1344-0558 CNB1344-0559 CNB1344-0559 CNB1344-0560 CNB1344-0560 CNB1344-0561 CNB1344-0561 CNB1344-0562 CNB1344-0562 CNB1344-0563 CNB1344-0563 CNB1344-0564 CNB1344-0564 CNB1344-0565 CNB1344-0565 CNB1344-0566 CNB1344-0566 CNB1344-0567 CNB1344-0567 CNB1344-0568

S2852A_ORF S2852A_ORF S2851A_ORF S2851A_ORF S2850A_ORF S2850A_ORF S2849A_ORF S2849A_ORF S2848A_ORF S2848A_ORF eaD eaD S2846A_ORF S2846A_ORF S2845A_ORF S2845A_ORF orf6 orf6 S2843A_ORF S2843A_ORF S2841A_ORF S2841A_ORF S2839A_ORF S2839A_ORF S2836A_ORF S2836A_ORF sb39 sb39 ymfL ymfL sb41 sb41 S2151A_ORF S2151A_ORF sb42 sb42 S2807A_ORF S2807A_ORF S2806A_ORF S2806A_ORF S2805A_ORF S2805A_ORF S2801A_ORF S2801A_ORF S2800A_ORF S2800A_ORF S2799A_ORF S2799A_ORF S2798A_ORF S2798A_ORF sb44 sb44 sb46 sb46 S2779A_ORF

-3,12 -2,03 -1,37 -0,64 -1,39 -1,49 0,67 1,37 1,19 2,30 -0,59 -0,34 0,13 -0,16 0,84 1,52 0,61 1,68 -0,21 1,15 0,69 2,51 2,37 3,74 -1,29 -0,36 -0,76 -1,07 -0,89 -0,31 -1,29 -1,10 -1,04 -0,67 0,06 1,44 0,84 1,81 1,09 1,76 -0,14 1,09 0,50 1,99 -0,51 1,17 -0,03 1,53 0,77 1,99 1,11 2,33 0,62 1,80 1,43

-1,43 -1,27 -0,85 -0,89 -0,14 -0,69 0,67 0,59 0,71 0,07 -0,16 0,76 -1,55 -3,57 0,38 0,41 1,66 1,69 1,69 2,17 1,65 1,59 0,49 1,00 -1,03 -1,56 -0,49 0,00 -0,39 -0,67 -0,42 -1,55 0,25 1,17 -0,44 -0,69 -0,08 0,08 0,16 0,24 -0,19 -0,17 1,42 0,95 -0,24 -0,45 0,05 0,07 -0,17 -0,27 -1,73 -1,07 3,00 2,58 0,48

-2,94 -2,14 -1,58 -1,26 -0,76 -1,37 0,59 0,48 1,28 1,74 -0,35 -0,59 0,08 0,47 -0,24 0,82 0,24 1,03 1,37 1,59 0,21 2,23 -0,06 0,99 -1,29 -0,31 -0,51 -2,62 -0,49 -0,78 -0,22 -0,77 -1,40 -0,36 -0,69 1,01 0,03 -0,59 0,55 0,51 -1,06 0,44 0,51 -0,08 -0,29 0,54 -0,29 1,67 0,71 0,88 -0,43 -1,17 -1,18 -0,33 -0,07

CNB1344-0568 CNB1344-0569 CNB1344-0569 CNB1344-0570 CNB1344-0570 CNB1344-0571 CNB1344-0571 CNB1344-0572 CNB1344-0572 CNB1344-0573 CNB1344-0573 CNB1344-0574 CNB1344-0574 CNB1344-0575 CNB1344-0575 CNB1344-0576 CNB1344-0576 CNB1344-0577 CNB1344-0577 CNB1344-0578 CNB1344-0578 CNB1344-0579 CNB1344-0579 CNB1344-0580 CNB1344-0580 CNB1344-0581 CNB1344-0581 CNB1344-0582 CNB1344-0582 CNB1344-0583 CNB1344-0583 CNB1344-0584 CNB1344-0584 CNB1344-0585 CNB1344-0585 CNB1344-0586 CNB1344-0586 CNB1344-0587 CNB1344-0587 CNB1344-0588 CNB1344-0588 CNB1344-0589 CNB1344-0589 CNB1344-0590 CNB1344-0590 CNB1344-0591 CNB1344-0591 CNB1344-0592 CNB1344-0592 CNB1344-0593 CNB1344-0593 CNB1344-0594 CNB1344-0594 CNB1344-0595 CNB1344-0595

313

S2779A_ORF S2777A_ORF S2777A_ORF sb49 sb49 sb50 sb50 S2734A_ORF S2734A_ORF sb56 sb56 S2725A_ORF S2725A_ORF S2723A_ORF S2723A_ORF sb1 sb1 S2138A_ORF S2138A_ORF ratC ratC S2717A_ORF S2717A_ORF ymfR ymfR sb4 sb4 sb5 sb5 sb6 sb6 S2688A_ORF S2688A_ORF sb7 sb7 sb8 sb8 sb9 sb9 S2683A_ORF S2683A_ORF sb10 sb10 S2677A_ORF S2677A_ORF sb11 sb11 sb12 sb12 sb13 sb13 S2654A_ORF S2654A_ORF sb14 sb14

-0,15 -1,07 0,37 0,49 0,87 -0,38 0,14 -1,94 -1,02 -0,73 -0,71 -0,32 -1,86 -0,60 -0,79 -0,75 0,62 0,24 1,27 -0,80 0,26 -1,09 -1,53 2,05 3,91 3,39 2,49 0,01 0,18 -0,12 1,70 -1,43 -2,75 1,36 2,13 -0,44 -0,21 -1,04 0,36 -1,06 1,12 -0,78 1,01 -1,03 -1,51 -0,55 1,11 0,67 1,11 -1,22 1,82 -1,25 -0,71 -0,27 -0,11

0,97 0,75 0,06 0,41 1,10 0,51 0,43 -0,94 -1,64 -0,20 -0,92 -0,15 -0,87 0,46 -0,72 -0,24 -0,45 0,19 -0,15 -0,64 0,22 -0,36 -0,17 -1,24 -0,09 0,70 1,80 0,93 1,01 -1,22 -1,46 -0,66 -0,05 0,47 0,37 -0,34 -0,74 -0,40 -1,89 0,55 0,14 0,80 0,71 1,05 1,01 0,33 -1,65 -0,36 -0,28 0,52 0,36 -1,03 -1,07 0,49 0,37

0,24 -0,27 -0,33 -0,37 -0,46 1,16 -0,09 -2,69 -1,58 -2,22 -0,56 -0,41 -2,56 0,04 0,45 -0,84 0,81 -0,18 0,65 -0,19 -0,45 -0,37 -0,60 -0,69 2,02 3,79 2,36 -0,62 -0,91 -0,38 1,15 -1,26 -1,00 2,38 3,73 -1,46 -0,99 -0,85 0,45 -1,93 -0,17 -0,08 1,25 0,41 0,74 -0,54 -0,83 -0,85 0,44 -0,07 1,21 -2,25 -1,36 0,51 0,08

Anexo IV

CNB1344-0596 CNB1344-0596 CNB1344-0597 CNB1344-0597 CNB1344-0598 CNB1344-0598 CNB1344-0599 CNB1344-0599 CNB1344-0600 CNB1344-0600 CNB1344-0601 CNB1344-0601 CNB1344-0602 CNB1344-0602 CNB1344-0603 CNB1344-0603 CNB1344-0604 CNB1344-0604 CNB1344-0605 CNB1344-0605 CNB1344-0606 CNB1344-0606 CNB1344-0607 CNB1344-0607 CNB1344-0608 CNB1344-0608 CNB1344-0609 CNB1344-0609 CNB1344-0610 CNB1344-0610 CNB1344-0611 CNB1344-0611 CNB1344-0612 CNB1344-0612 CNB1344-0613 CNB1344-0613 CNB1344-0614 CNB1344-0614 CNB1344-0615 CNB1344-0615 CNB1344-0616 CNB1344-0616 CNB1344-0617 CNB1344-0617 CNB1344-0618 CNB1344-0618 CNB1344-0619 CNB1344-0619 CNB1344-0620 CNB1344-0620 CNB1344-0621 CNB1344-0621 CNB1344-0622 CNB1344-0622 CNB1344-0623

sb15 sb15 sb16 sb16 S2634A_ORF S2634A_ORF xapA xapA orf15 orf15 S2604A_ORF S2604A_ORF sb18 sb18 S2599A_ORF S2599A_ORF S2595A_ORF S2595A_ORF sb19 sb19 S2589A_ORF S2589A_ORF S2120A_ORF S2120A_ORF S2584A_ORF S2584A_ORF sb21 sb21 sb22 sb22 S2117A_ORF S2117A_ORF sb24 sb24 S2560A_ORF S2560A_ORF S2540A_ORF S2540A_ORF S2531A_ORF S2531A_ORF sb26 sb26 sb27 sb27 S2509A_ORF S2509A_ORF S2108A_ORF S2108A_ORF S2106A_ORF S2106A_ORF S2105A_ORF S2105A_ORF S2469A_ORF S2469A_ORF S2459A_ORF

0,06 0,25 0,96 1,90 -3,32 -3,43 -0,47 1,36 -0,34 0,88 -0,62 -0,01 0,56 1,89 -0,98 0,17 0,11 -0,51 3,15 2,76 -0,35 0,46 1,29 2,17 0,27 -0,66 -0,15 1,01 1,72 3,39 0,03 1,08 -0,01 1,35 -1,66 -1,20 3,82 4,47 -3,93 -4,36 0,22 1,50 1,12 3,40 -1,30 -1,08 -1,64 -0,74 -0,56 0,68 -0,71 -0,51 -0,27 -0,12 -2,28

-0,17 0,04 0,56 0,53 -0,72 -0,75 -1,75 -0,39 -0,76 -0,39 -0,29 -0,11 1,49 1,02 -1,90 -1,60 0,52 0,42 0,19 -1,04 -0,11 -0,29 -0,93 -0,90 -0,35 0,41 -0,89 -1,17 0,79 0,90 3,51 4,12 1,70 2,03 -0,71 -0,29 1,35 1,09 -2,01 -1,67 4,09 3,79 3,20 3,70 -1,41 -2,60 -2,00 -1,13 -0,30 -0,38 -1,39 -0,90 -0,99 -0,74 -0,76

0,24 0,25 -0,25 0,99 -2,28 -2,23 -0,14 -0,17 -0,55 0,37 -0,40 0,02 2,74 2,08 -0,23 -0,86 0,83 0,27 1,16 1,35 0,84 0,69 1,11 0,59 -0,60 -0,91 -0,95 -0,08 2,66 1,99 0,12 0,33 0,31 0,75 -3,59 -2,60 3,70 4,22 -2,18 -2,13 0,86 1,59 1,56 3,84 0,81 -0,97 -0,60 -0,48 1,09 0,82 -0,02 -0,61 -0,85 0,12 -5,01

CNB1344-0623 CNB1344-0624 CNB1344-0624 CNB1344-0625 CNB1344-0625 CNB1344-0626 CNB1344-0626 CNB1344-0627 CNB1344-0627 CNB1344-0628 CNB1344-0628 CNB1344-0629 CNB1344-0629 CNB1344-0630 CNB1344-0630 CNB1344-0631 CNB1344-0631 CNB1344-0632 CNB1344-0632 CNB1344-0633 CNB1344-0633 CNB1344-0634 CNB1344-0634 CNB1344-0635 CNB1344-0635 CNB1344-0636 CNB1344-0636 CNB1344-0637 CNB1344-0637 CNB1344-0638 CNB1344-0638 CNB1344-0639 CNB1344-0639 CNB1344-0640 CNB1344-0640 CNB1344-0641 CNB1344-0641 CNB1344-0642 CNB1344-0642 CNB1344-0643 CNB1344-0643 CNB1344-0644 CNB1344-0644 CNB1344-0645 CNB1344-0645 CNB1344-0646 CNB1344-0646 CNB1344-0647 CNB1344-0647 CNB1344-0648 CNB1344-0648 CNB1344-0649 CNB1344-0649 CNB1344-0650 CNB1344-0650

314

S2459A_ORF S2436A_ORF S2436A_ORF S2097A_ORF S2097A_ORF S2424A_ORF S2424A_ORF S2422A_ORF S2422A_ORF S2418A_ORF S2418A_ORF S2417A_ORF S2417A_ORF S2412A_ORF S2412A_ORF S2409A_ORF S2409A_ORF S2407A_ORF S2407A_ORF S2397A_ORF S2397A_ORF S2393A_ORF S2393A_ORF S2376A_ORF S2376A_ORF S2375A_ORF S2375A_ORF S2357A_ORF S2357A_ORF S2352A_ORF S2352A_ORF S2349A_ORF S2349A_ORF S2320A_ORF S2320A_ORF S2298A_ORF S2298A_ORF S2297A_ORF S2297A_ORF S2292A_ORF S2292A_ORF S2077A_ORF S2077A_ORF S2075A_ORF S2075A_ORF S2253A_ORF S2253A_ORF S3284A_ORF S3284A_ORF S3279A_ORF S3279A_ORF S3263A_ORF S3263A_ORF fucP fucP

-3,08 0,47 4,74 -0,91 -1,60 -1,38 -0,93 -0,15 1,35 -0,87 -0,51 -1,15 -0,50 -1,20 -0,09 -0,30 0,65 -0,43 0,99 0,74 2,15 -1,05 -1,02 0,53 1,93 2,20 3,46 1,21 0,79 -1,87 -1,26 -0,69 -1,34 0,30 0,54 -1,05 0,04 -0,94 0,15 1,65 1,04 -2,36 -2,23 -0,92 0,01 -1,75 -0,13 0,57 1,99 -0,19 0,50 1,05 2,00 0,02 0,49

0,03 -0,51 0,30 0,46 0,58 -1,06 -1,29 0,00 -0,35 -1,09 -0,23 -0,35 -0,14 -0,78 -0,49 -0,95 -1,01 0,35 0,23 -0,33 -0,88 -0,80 -2,12 1,13 1,42 4,48 4,39 -0,42 -1,14 -0,95 -0,93 -0,19 -1,00 3,39 3,35 -0,47 -0,48 -1,77 -1,09 -0,83 -1,09 -2,47 -3,22 -2,18 -1,51 0,09 -0,43 0,98 0,39 -1,74 -1,39 0,01 -0,44 -0,25 -0,49

-4,65 0,99 1,53 0,86 1,06 -1,82 -0,40 0,20 0,87 -1,08 -0,81 -2,99 -1,56 -1,35 -0,34 -0,82 0,11 -1,39 -1,11 0,88 -0,03 -0,99 -1,17 1,67 2,02 0,75 0,83 -0,12 0,93 -0,04 0,67 0,19 -0,43 1,39 1,14 -0,40 0,14 -1,03 -0,35 -0,42 0,71 -2,54 -1,26 -1,62 -1,93 -1,55 -2,81 1,29 2,92 -0,33 0,03 1,15 1,17 -0,02 0,32

Anexo IV

CNB1344-0651 CNB1344-0651 CNB1344-0652 CNB1344-0652 CNB1344-0653 CNB1344-0653 CNB1344-0654 CNB1344-0654 CNB1344-0655 CNB1344-0655 CNB1344-0656 CNB1344-0656 CNB1344-0657 CNB1344-0657 CNB1344-0658 CNB1344-0658 CNB1344-0659 CNB1344-0659 CNB1344-0660 CNB1344-0660 CNB1344-0661 CNB1344-0661 CNB1344-0662 CNB1344-0662 CNB1344-0663 CNB1344-0663 CNB1344-0664 CNB1344-0664 CNB1344-0665 CNB1344-0665 CNB1344-0666 CNB1344-0666 CNB1344-0667 CNB1344-0667 CNB1344-0668 CNB1344-0668 CNB1344-0669 CNB1344-0669 CNB1344-0670 CNB1344-0670 CNB1344-0671 CNB1344-0671 CNB1344-0672 CNB1344-0672 CNB1344-0673 CNB1344-0673 CNB1344-0674 CNB1344-0674 CNB1344-0675 CNB1344-0675 CNB1344-0676 CNB1344-0676 CNB1344-0677 CNB1344-0677 CNB1344-0678

S3250A_ORF S3250A_ORF S3237A_ORF S3237A_ORF S3227A_ORF S3227A_ORF S3222A_ORF S3222A_ORF S3221A_ORF S3221A_ORF S3220A_ORF S3220A_ORF S3219A_ORF S3219A_ORF S3204A_ORF S3204A_ORF S3203A_ORF S3203A_ORF S3191A_ORF S3191A_ORF S2057A_ORF S2057A_ORF S3172A_ORF S3172A_ORF S3167A_ORF S3167A_ORF S3165A_ORF S3165A_ORF S3145A_ORF S3145A_ORF S3132A_ORF S3132A_ORF S3116A_ORF S3116A_ORF S1802A_ORF S1802A_ORF S1792A_ORF S1792A_ORF S1789A_ORF S1789A_ORF S1780A_ORF S1780A_ORF S1778A_ORF S1778A_ORF S1776A_ORF S1776A_ORF S1774A_ORF S1774A_ORF S1772A_ORF S1772A_ORF S1763A_ORF S1763A_ORF S1762A_ORF S1762A_ORF S1746A_ORF

0,90 1,08 1,24 2,18 0,54 -0,39 -1,59 -1,04 1,66 2,19 0,49 0,41 0,58 3,20 1,81 0,72 1,65 3,17 -1,64 -0,83 -0,60 1,24 0,53 1,61 1,73 2,18 -0,31 0,40 0,20 1,41 -0,22 -1,07 -0,33 0,88 -2,31 -1,93 -0,96 0,06 -0,64 0,63 -1,88 0,41 -0,65 -0,44 0,47 -0,09 -0,98 -0,83 -0,70 0,56 -0,70 -0,68 -1,87 -0,82 0,40

0,61 0,53 -0,18 0,18 0,19 -0,59 -0,92 -0,92 0,30 0,45 -0,14 0,23 0,47 0,69 0,13 0,64 0,20 0,91 0,49 0,67 -0,82 -1,09 1,46 1,52 0,02 0,58 -0,39 -0,51 -0,21 0,28 0,15 -0,31 -0,26 -0,64 -1,72 -1,59 -0,30 0,22 -0,52 -0,97 0,42 0,37 -0,02 0,59 -1,67 -1,68 -0,86 -1,21 0,74 -0,87 -0,09 -0,54 0,03 -0,29 -0,27

0,71 2,12 1,15 1,88 -0,67 1,73 -0,87 -0,53 -0,49 0,15 -0,71 -1,30 0,32 1,29 -0,36 -0,38 -0,20 1,84 -0,79 -0,58 -1,44 -1,14 0,38 0,22 1,61 3,02 -0,06 0,26 -0,20 0,49 0,06 -0,31 -0,07 1,22 -2,67 -2,39 -0,05 0,79 -1,32 0,49 -1,27 -0,77 0,03 0,16 -1,02 -0,05 -1,29 -0,98 -0,02 0,53 -0,51 0,65 -1,53 -0,51 0,08

CNB1344-0678 CNB1344-0679 CNB1344-0679 CNB1344-0680 CNB1344-0680 CNB1344-0681 CNB1344-0681 CNB1344-0682 CNB1344-0682 CNB1344-0683 CNB1344-0683 CNB1344-0684 CNB1344-0684 CNB1344-0685 CNB1344-0685 CNB1344-0686 CNB1344-0686 CNB1344-0687 CNB1344-0687 CNB1344-0688 CNB1344-0688 CNB1344-0689 CNB1344-0689 CNB1344-0690 CNB1344-0690 CNB1344-0691 CNB1344-0691 CNB1344-0692 CNB1344-0692 CNB1344-0693 CNB1344-0693 CNB1344-0694 CNB1344-0694 CNB1344-0695 CNB1344-0695 CNB1344-0696 CNB1344-0696 CNB1344-0697 CNB1344-0697 CNB1344-0698 CNB1344-0698 CNB1344-0699 CNB1344-0699 CNB1344-0700 CNB1344-0700 CNB1344-0701 CNB1344-0701 CNB1344-0702 CNB1344-0702 CNB1344-0703 CNB1344-0703 CNB1344-0704 CNB1344-0704 CNB1344-0705 CNB1344-0705

315

S1746A_ORF S2054A_ORF S2054A_ORF S2050A_ORF S2050A_ORF S2044A_ORF S2044A_ORF S2034A_ORF S2034A_ORF S2021A_ORF S2021A_ORF S2011A_ORF S2011A_ORF S2010A_ORF S2010A_ORF S2009A_ORF S2009A_ORF hutU hutU S1957A_ORF S1957A_ORF S1925A_ORF S1925A_ORF S1725A_ORF S1725A_ORF S1914A_ORF S1914A_ORF S1895A_ORF S1895A_ORF S1890A_ORF S1890A_ORF yliI yliI S1720A_ORF S1720A_ORF S1860A_ORF S1860A_ORF S1858A_ORF S1858A_ORF S1841A_ORF S1841A_ORF S1813A_ORF S1813A_ORF S1812A_ORF S1812A_ORF S1807A_ORF S1807A_ORF murA murA S1705A_ORF S1705A_ORF S1704A_ORF S1704A_ORF S1701A_ORF S1701A_ORF

1,44 -1,13 -0,03 -0,13 -0,78 0,24 1,20 0,03 0,21 -0,88 -0,97 -0,71 -0,77 -0,19 0,30 -0,43 0,25 0,28 0,47 -0,66 -0,37 0,12 1,15 -0,68 0,64 1,22 1,29 -0,10 -0,12 -0,71 1,26 -0,03 0,99 0,33 0,34 -0,91 0,12 0,94 1,71 -1,78 -1,09 -0,78 -0,20 -1,17 0,07 4,00 -0,94 -1,65 -1,19 -1,61 -1,50 -1,68 -1,19 -4,10 -3,98

-1,36 -1,01 -0,80 0,22 0,25 0,84 -0,02 1,19 0,75 -0,13 0,49 -0,71 -1,08 -0,65 0,01 -0,79 -0,87 -0,73 -1,40 -0,01 -0,86 1,12 0,87 2,78 2,91 2,73 2,60 0,15 -0,68 0,03 -0,56 1,20 1,21 -0,65 -1,01 -0,42 -0,39 0,32 -0,02 0,60 0,88 0,01 0,26 1,37 0,89 -0,87 -1,07 -1,45 -1,06 -2,43 -2,73 -1,82 -2,12 -1,83 -1,43

0,38 -0,48 -0,27 0,31 0,14 1,96 0,91 0,35 0,70 0,34 0,37 0,11 -0,53 0,03 0,45 -1,44 -0,90 0,08 0,82 -0,36 -0,14 0,37 1,32 -0,05 -0,09 5,53 5,91 1,47 1,36 -0,10 -0,61 -0,19 0,35 -0,01 0,46 -0,44 -0,23 1,34 1,17 -1,40 -1,55 -1,14 -0,07 -0,24 0,20 1,59 0,25 -3,03 -2,69 -4,00 -3,15 -1,62 -2,06 -6,06 -6,50

Anexo IV

CNB1344-0706 CNB1344-0706 CNB1344-0707 CNB1344-0707 CNB1344-0708 CNB1344-0708 CNB1344-0709 CNB1344-0709 CNB1344-0710 CNB1344-0710 CNB1344-0711 CNB1344-0711 CNB1344-0712 CNB1344-0712 CNB1344-0713 CNB1344-0713 CNB1344-0714 CNB1344-0714 CNB1344-0715 CNB1344-0715 CNB1344-0716 CNB1344-0716 CNB1344-0717 CNB1344-0717 CNB1344-0718 CNB1344-0718 CNB1344-0719 CNB1344-0719 CNB1344-0720 CNB1344-0720 CNB1344-0721 CNB1344-0721 CNB1344-0722 CNB1344-0722 CNB1344-0723 CNB1344-0723 CNB1344-0724 CNB1344-0724 CNB1344-0725 CNB1344-0725 CNB1344-0726 CNB1344-0726 CNB1344-0727 CNB1344-0727 CNB1344-0728 CNB1344-0728 CNB1344-0729 CNB1344-0729 CNB1344-0730 CNB1344-0730 CNB1344-0731 CNB1344-0731 CNB1344-0732 CNB1344-0732 CNB1344-0733

S1696A_ORF S1696A_ORF S0868A_ORF S0868A_ORF S1678A_ORF S1678A_ORF S1677A_ORF S1677A_ORF S0858A_ORF S0858A_ORF S0857A_ORF S0857A_ORF S1663A_ORF S1663A_ORF S1659A_ORF S1659A_ORF S1655A_ORF S1655A_ORF S1648A_ORF S1648A_ORF putA putA S1642A_ORF S1642A_ORF phoH phoH S0853A_ORF S0853A_ORF S0852A_ORF S0852A_ORF S1632A_ORF S1632A_ORF S0851A_ORF S0851A_ORF S0850A_ORF S0850A_ORF S1623A_ORF S1623A_ORF S1619A_ORF S1619A_ORF S1618A_ORF S1618A_ORF S0849A_ORF S0849A_ORF S0848A_ORF S0848A_ORF S1604A_ORF S1604A_ORF S0846A_ORF S0846A_ORF S1574A_ORF S1574A_ORF S1559A_ORF S1559A_ORF S0842A_ORF

-2,91 -2,80 -2,60 -1,70 -0,51 -0,23 -0,91 -0,79 -0,05 -0,75 0,95 1,61 -0,53 2,00 -1,51 -1,56 -0,06 0,22 -0,01 -0,19 -1,52 0,42 -0,27 1,78 0,07 -0,19 -0,79 0,36 0,01 1,81 -1,21 0,09 0,30 1,32 0,22 0,38 2,06 3,11 -0,57 0,28 1,49 0,86 -0,07 -0,39 1,21 1,89 0,71 0,53 -0,15 5,19 -2,66 -0,91 -1,72 -2,45 1,59

-2,27 -1,89 -1,42 -1,53 -1,03 -0,24 0,15 -1,25 0,35 -1,20 0,36 -1,12 -0,33 0,20 -0,03 -0,47 0,01 0,73 1,09 2,05 -0,68 -0,52 0,80 2,05 0,73 1,08 0,63 0,80 1,03 1,18 -0,92 -0,36 0,50 0,35 1,26 0,05 0,87 -0,20 -1,34 -1,13 -0,84 -1,56 -0,51 -1,38 1,69 1,56 0,27 -0,20 -0,32 1,98 -1,35 -1,07 -2,15 -2,16 -0,19

-3,20 -4,03 -2,68 -1,90 -0,75 0,66 -1,45 -1,28 1,70 0,33 0,50 0,66 0,21 1,29 -0,43 -0,77 0,33 0,61 6,60 7,09 0,09 0,71 2,29 3,83 1,37 1,66 -0,21 -0,03 0,55 1,17 -0,70 -0,25 -0,63 0,46 -0,25 -1,05 3,39 2,84 -0,61 -1,45 -0,58 0,56 0,07 -1,26 2,05 1,80 0,30 0,78 0,41 0,87 -2,32 -0,93 -1,69 -1,60 0,02

CNB1344-0733 CNB1344-0734 CNB1344-0734 CNB1344-0735 CNB1344-0735 CNB1344-0736 CNB1344-0736 CNB1344-0737 CNB1344-0737 CNB1344-0738 CNB1344-0738 CNB1344-0739 CNB1344-0739 CNB1344-0740 CNB1344-0740 CNB1344-0741 CNB1344-0741 CNB1344-0742 CNB1344-0742 CNB1344-0743 CNB1344-0743 CNB1344-0744 CNB1344-0744 CNB1344-0745 CNB1344-0745 CNB1344-0746 CNB1344-0746 CNB1344-0747 CNB1344-0747 CNB1344-0748 CNB1344-0748 CNB1344-0749 CNB1344-0749 CNB1344-0750 CNB1344-0750 CNB1344-0751 CNB1344-0751 CNB1344-0752 CNB1344-0752 CNB1344-0753 CNB1344-0753 CNB1344-0754 CNB1344-0754 CNB1344-0755 CNB1344-0755 CNB1344-0756 CNB1344-0756 CNB1344-0757 CNB1344-0757 CNB1344-0758 CNB1344-0758 CNB1344-0759 CNB1344-0759 CNB1344-0760 CNB1344-0760

316

S0842A_ORF S0839A_ORF S0839A_ORF S1537A_ORF S1537A_ORF S1520A_ORF S1520A_ORF S0835A_ORF S0835A_ORF S1513A_ORF S1513A_ORF S1507A_ORF S1507A_ORF S1506A_ORF S1506A_ORF S1488A_ORF S1488A_ORF S1478A_ORF S1478A_ORF S1466A_ORF S1466A_ORF S1463A_ORF S1463A_ORF S1447A_ORF S1447A_ORF S0825A_ORF S0825A_ORF S1424A_ORF S1424A_ORF S1412A_ORF S1412A_ORF S0820A_ORF S0820A_ORF S1406A_ORF S1406A_ORF S1393A_ORF S1393A_ORF S1392A_ORF S1392A_ORF S0816A_ORF S0816A_ORF S1358A_ORF S1358A_ORF S1322A_ORF S1322A_ORF S1289A_ORF S1289A_ORF S1288A_ORF S1288A_ORF S1276A_ORF S1276A_ORF S1271A_ORF S1271A_ORF S1270A_ORF S1270A_ORF

1,55 0,95 1,96 -0,89 -0,25 -0,36 0,18 1,68 2,56 0,40 0,58 0,61 1,51 -0,16 -0,05 -0,67 -0,44 -0,71 0,11 -1,09 -0,10 -3,23 -3,44 2,73 3,20 0,84 1,92 -2,07 -0,29 -0,63 0,08 -0,86 0,59 -0,83 -2,03 0,06 2,53 -1,21 -0,08 0,53 1,05 -0,79 1,76 -1,55 0,72 -0,81 -0,06 -1,69 -0,31 -2,46 -1,57 -0,43 -0,48 1,08 2,25

0,12 0,51 0,76 3,65 3,61 -0,87 -0,89 1,18 0,80 2,96 3,53 -1,17 -0,64 -0,39 -0,57 0,22 1,01 0,28 0,37 -0,71 -1,15 -0,50 -2,03 2,14 1,30 3,37 2,78 -1,46 -1,46 0,43 0,03 -0,25 0,37 -0,04 0,27 -2,25 -2,10 -0,76 -1,03 0,03 -0,08 1,06 1,71 0,71 1,32 -0,71 -0,91 -1,21 -1,59 -1,45 -2,00 0,51 -0,47 1,14 1,64

0,79 -0,94 0,26 -1,08 -1,31 -0,14 0,71 1,32 2,47 0,72 0,52 -0,33 -0,04 -1,05 -0,25 -0,55 -0,21 -0,13 -0,42 -1,39 -0,97 -1,94 -2,13 4,59 4,58 1,98 2,48 -1,80 -0,09 -0,33 0,47 -1,33 -0,84 -0,15 -0,99 -1,13 2,86 -1,21 -0,38 -0,84 0,45 0,23 1,13 -1,22 -0,53 -0,91 -0,99 -1,24 -0,75 -2,23 -2,20 -0,45 -1,51 1,77 1,88

Anexo IV

CNB1344-0761 CNB1344-0761 CNB1344-0762 CNB1344-0762 CNB1344-0763 CNB1344-0763 CNB1344-0764 CNB1344-0764 CNB1344-0765 CNB1344-0765 CNB1344-0766 CNB1344-0766 CNB1344-0767 CNB1344-0767 CNB1344-0768 CNB1344-0768 CNB1344-0769 CNB1344-0769 CNB1344-0770 CNB1344-0770 CNB1344-0771 CNB1344-0771 CNB1344-0772 CNB1344-0772 CNB1344-0773 CNB1344-0773 CNB1344-0774 CNB1344-0774 CNB1344-0775 CNB1344-0775 CNB1344-0776 CNB1344-0776 CNB1344-0777 CNB1344-0777 CNB1344-0778 CNB1344-0778 CNB1344-0779 CNB1344-0779 CNB1344-0780 CNB1344-0780 CNB1344-0781 CNB1344-0781 CNB1344-0782 CNB1344-0782 CNB1344-0783 CNB1344-0783 CNB1344-0784 CNB1344-0784 CNB1344-0785 CNB1344-0785 CNB1344-0786 CNB1344-0786 CNB1344-0787 CNB1344-0787 CNB1344-0788

S1269A_ORF S1269A_ORF S1265A_ORF S1265A_ORF asr asr S1263A_ORF S1263A_ORF S1260A_ORF S1260A_ORF S0806A_ORF S0806A_ORF S0805A_ORF S0805A_ORF ydfJ ydfJ S1239A_ORF S1239A_ORF S1233A_ORF S1233A_ORF S1231A_ORF S1231A_ORF S1230A_ORF S1230A_ORF S1229A_ORF S1229A_ORF S1205A_ORF S1205A_ORF S1194A_ORF S1194A_ORF S1192A_ORF S1192A_ORF RS04283 RS04283 S1188A_ORF S1188A_ORF bisC bisC S1163A_ORF S1163A_ORF S1156A_ORF S1156A_ORF S1149A_ORF S1149A_ORF S0791A_ORF S0791A_ORF S1140A_ORF S1140A_ORF S0759A_ORF S0759A_ORF S1110A_ORF S1110A_ORF S1107A_ORF S1107A_ORF S1106A_ORF

-0,90 -0,16 -0,06 -0,67 1,54 3,71 0,79 1,39 -0,98 0,35 -0,36 -1,23 1,07 1,48 -0,89 0,03 -0,22 1,53 -1,13 1,61 -0,39 0,20 -0,51 0,00 0,16 1,13 -0,18 0,38 -1,85 -1,73 0,59 1,56 -0,04 -0,40 1,60 1,26 -0,61 -1,22 -1,12 0,00 -0,49 0,62 0,72 1,80 -1,58 -0,31 -1,23 -0,08 -0,71 0,38 0,03 -1,89 6,04 8,63 0,48

0,24 -0,06 0,64 -0,87 1,54 0,67 0,79 0,39 -0,16 0,40 1,22 -0,14 -0,32 -1,26 0,56 0,20 0,50 -0,15 0,61 0,43 0,17 0,94 1,54 1,55 1,03 1,25 1,03 0,01 0,04 -0,06 0,78 1,33 1,04 -0,77 0,17 -0,57 -2,29 -2,38 0,36 -0,29 -0,36 -0,66 0,65 0,59 -0,77 -0,72 0,67 0,81 -0,62 -0,74 0,13 -0,68 1,08 2,62 1,00

-0,28 0,14 2,54 0,19 2,50 3,88 1,69 2,79 -0,62 1,07 0,36 -1,57 1,50 -0,45 0,11 -0,52 -0,60 0,02 1,26 1,92 1,77 2,06 2,20 2,38 4,98 5,25 0,48 -0,02 -0,92 -1,49 0,76 1,38 1,89 -0,17 0,75 1,95 -2,43 -1,97 0,49 -0,76 -0,52 0,68 1,99 2,53 -2,15 -0,87 1,52 1,95 -1,12 1,26 0,74 0,16 5,19 7,43 1,86

CNB1344-0788 CNB1344-0789 CNB1344-0789 CNB1344-0790 CNB1344-0790 CNB1344-0791 CNB1344-0791 CNB1344-0792 CNB1344-0792 CNB1344-0793 CNB1344-0793 CNB1344-0794 CNB1344-0794 CNB1344-0795 CNB1344-0795 CNB1344-0796 CNB1344-0796 CNB1344-0797 CNB1344-0797 CNB1344-0798 CNB1344-0798 CNB1344-0799 CNB1344-0799 CNB1344-0800 CNB1344-0800 CNB1344-0801 CNB1344-0801 CNB1344-0802 CNB1344-0802 CNB1344-0803 CNB1344-0803 CNB1344-0804 CNB1344-0804 CNB1344-0805 CNB1344-0805 CNB1344-0806 CNB1344-0806 CNB1344-0807 CNB1344-0807 CNB1344-0808 CNB1344-0808 CNB1344-0809 CNB1344-0809 CNB1344-0810 CNB1344-0810 CNB1344-0811 CNB1344-0811 CNB1344-0812 CNB1344-0812 CNB1344-0813 CNB1344-0813 CNB1344-0814 CNB1344-0814 CNB1344-0815 CNB1344-0815

317

S1106A_ORF S1105A_ORF S1105A_ORF S1103A_ORF S1103A_ORF S1095A_ORF S1095A_ORF S1084A_ORF S1084A_ORF S1081A_ORF S1081A_ORF S1076A_ORF S1076A_ORF S1070A_ORF S1070A_ORF S1061A_ORF S1061A_ORF S0757A_ORF S0757A_ORF S1055A_ORF S1055A_ORF S1054A_ORF S1054A_ORF S1040A_ORF S1040A_ORF S1034A_ORF S1034A_ORF S1021A_ORF S1021A_ORF S1011A_ORF S1011A_ORF S1010A_ORF S1010A_ORF S1009A_ORF S1009A_ORF S0984A_ORF S0984A_ORF S0982A_ORF S0982A_ORF yciU yciU S0960A_ORF S0960A_ORF S0942A_ORF S0942A_ORF S0934A_ORF S0934A_ORF S0932A_ORF S0932A_ORF S0931A_ORF S0931A_ORF S0911A_ORF S0911A_ORF S0907A_ORF S0907A_ORF

-1,18 -1,22 -0,29 1,36 0,97 3,67 1,81 -1,47 -1,12 -1,68 -1,62 0,04 -0,54 0,87 -0,24 0,79 1,42 -0,71 -0,04 0,47 1,02 -0,80 -0,72 0,99 2,19 1,04 1,75 -1,53 -0,45 -1,82 -1,68 0,10 -0,20 -0,58 0,15 -1,37 -2,02 1,25 3,51 -1,03 -0,13 0,53 2,11 -1,91 -1,25 -1,37 -1,33 -0,22 2,05 0,12 1,24 -0,63 1,42 0,03 0,16

0,40 -0,36 -0,13 4,03 4,51 -0,07 0,20 -0,19 -0,49 -0,22 -0,42 -1,03 -0,71 1,38 0,79 -0,09 0,21 -0,90 -0,87 0,10 0,75 0,06 0,08 2,40 2,59 3,88 4,42 -0,01 0,14 -0,30 1,09 1,17 1,51 0,81 1,43 0,53 0,09 0,88 0,78 0,15 0,45 0,56 0,13 -1,56 -0,37 -0,38 -0,56 -0,35 -0,88 0,24 -0,75 0,30 0,55 0,92 0,87

-1,23 -0,41 -0,55 1,35 1,94 0,35 4,67 -0,17 -0,36 -1,07 0,45 -1,34 -0,89 1,46 1,11 -0,92 0,10 -0,08 -0,16 -0,75 1,13 0,00 -0,39 -0,10 0,39 0,33 0,45 -1,45 -0,85 -0,11 0,40 -0,48 0,38 -1,17 -0,43 -0,32 -0,69 3,19 0,16 -0,44 -0,71 0,38 1,51 -1,63 -1,07 -1,49 -0,96 -0,46 0,94 1,11 0,93 -0,19 0,94 1,66 2,61

Anexo IV

CNB1344-0816 CNB1344-0816 CNB1344-0817 CNB1344-0817 CNB1344-0818 CNB1344-0818 CNB1344-0819 CNB1344-0819 CNB1344-0820 CNB1344-0820 CNB1344-0821 CNB1344-0821 CNB1344-0822 CNB1344-0822

S0769A_ORF S0769A_ORF S0880A_ORF S0880A_ORF S0878A_ORF S0878A_ORF S0874A_ORF S0874A_ORF S0002A_ORF S0002A_ORF S0001A_ORF S0001A_ORF S0003A_ORF S0003A_ORF

-0,36 0,26 -1,48 1,04 -1,75 -0,91 -0,69 -1,07 1,25 3,71 1,06 2,88 0,88 1,43

-0,07 -1,13 -0,33 -1,18 -0,98 -0,77 0,16 0,47 0,42 0,46 0,67 0,75 0,17 -0,06

1,29 -1,98 -0,84 -0,04 -1,07 -0,70 -0,09 0,25 0,41 1,33 -1,38 1,67 1,10 0,13

318