HEMOFILIA ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND
PREVALENCIA - Hemofilia A 1/5000 - Hemofilia B 1/25000 - VWD 3% población
FVIII-VWF FVIIIa
A1 C2
A2 C1
A3
IIa, FXa
372
A2 A1
C1
FVIII
740
A3 B
VWF
C2
N
N
S-S Vlot et al., 1998
1689
C C S-S
Factor von Willebrand Propéptido Subunidad Madura 1
D1
D2
I S
2050
D’ D3
A1A2 A3
D4BC1C2 S I S
D’ D3 S I
A1A2 A3
D4BC1C2
RGD RGD Colágeno GPIIb-IIIa FVIII GPIb Heparina Heparina Colágeno Sulfátidos
protómero dominios funcionales ligandos
Proteolisis aumentada (vWD2A) ADAMTS-13
kproteolisis
Inicial
Plasma
vWF Ensamble y Catabolismo
ksecreción
kdepuración
Depuración aumentada (vWD1 Vicenza) Sadler JE, 2005
FACTOR VIII NH 2
A1
A2
B
A3
C1 C2
Secreción 200kD
Preactivación
1648
IIa
90kD
80kD
HRG
80kD
IIa 740
Activación 50kD
IIa
43kD 372
Inactivación
APC IIa Xa
73kD 1689
45kD
67kD 336
Lollar P & Parker CG, 1989
Xa
1721
FVIII/VWF - Propiedades FVIII
VWF
Clínica Producción
Hemofilia S. Hepáticos
Gen Molécula Función
Cromosoma X Heterodímero Coagulación Procofactor
vWD C. Endoteliales Megacariocitos Cromosoma 12 Multímero Adhesión Endotelio/Sub Transporta FVIII
FVIII/VWF - Nomenclatura Factor VIII Antígeno Función
Factor von Proteína Madura Willebrand Antígeno
FVIII:Ag FVIII VWF VWF:Ag
Cofactor Ristocetina VWF:RCo Unión al Colágeno
VWF:CB
Unión al Factor VIII
VWF:FVIIIB ISTH
HEMOFILIA A Recesiva Ligada al sexo (gen FVIIICr X) PORTADORA
HEMOFILICO
HEMOFILIA Modo de Herencia
HEMOFILIA Modo de Herencia
Hemofilia A severa 4%
15%
42%
inversiones grandes deleciones mutaciones sin sentido corrimiento de la lectura
17%
cambio de sentido 14%
desconocida
8%
Hemofila A moderada 2%
2%
10% cambio de sentido splicing corrimiento de la lectura desconocida 86%
HEMOFILIA Diagnóstico “sencillo” - APTT prolongado - FVIII disminuido
HEMOFILIA - Clasificación Severa Moderada Leve
< 1% VIII 1-5% VIII >5% VIII
HEMOFILIA Diagnóstico de Portadoras
PORTADORA OBLIGADA Padre hemofílico Hijo hemofílico y antecedentes (vía materna) 2 o más hijos, sin antecedentes familiares No requiere estudio
PORTADORA POTENCIAL Hijo hemofílico, sin antecedentes familiares Sin hijos y con antecedentes (vía materna) Dificultad diagnóstica
PORTADORAS Lyonización Ovulo Fertilizado
XM XP
Heterocigota
XP
XM
XP
XM
XM
XP
XP
XM
XM
XP
XM
XP
Clones
PORTADORAS HEMOFILIA Factor VIII probabilidad
Portadoras Normales
50
100
FVIII
Bioensayos DESVENTAJAS Probabilidad Error por lyonización extrema
Análisis de ADN VENTAJAS Certeza Independiente de lyonización
Análisis de ADN Complejo
Alteración heterogénea Afecta diferentes regiones del gen No aplicable a todos los casos
IDENTIFICACION No Certeza INDIRECTA Análisis de segregación de RFLP -/+ -
?
-/-
PORTADORA (-) asociado al defecto
IDENTIFIACION DIRECTA Certeza Inversión del intrón 22
↓ 50% hemofílicos severos
IDENTIFIACION DIRECTA Inversiones Deleciones Inserciones Mutaciones “sin sentido” Mutaciones “sentido falso”
Sintomas clinicos
Sintomas clinicos
Sintomas clinicos
HEMOFILIA B Recesiva Ligada al sexo (gen FIXCr X) PORTADORA
HEMOFILICO
HEMOFILIA - Clasificación Severa Moderada Leve
< 1% IX 1-5% IX >5% IX
HEMOFILIA B Diagnóstico “sencillo” - APTT prolongado - FIX disminuido
Factor von Willebrand Propéptido Subunidad Madura 1
D1
D2
I S
2050
D’ D3
A1A2 A3
D4BC1C2 S I S
D’ D3 S I
A1A2 A3
D4BC1C2
RGD RGD Colágeno GPIIb-IIIa FVIII GPIb Heparina Heparina Colágeno Sulfátidos
protómero dominios funcionales ligandos
VWD Clasificación Revisada Sadler E, 1994
Tipo 1 Deficiencia cuantitativa parcial Tipo 2 Alteración cualitativa Tipo 3 “Ausencia”de VWF
VWD Genética
VWF Cromosoma 12
(12p1212pter)
VWF Expresión Variable Penetrancia Incompleta
Enfermedad primariamutación
Modificadires Ambientales edad, género, trauma Chance
? Genes modificadores
Ginsburg D, 2001
Niveles Variables VWF Difícil Diagnóstico
VWF-Variabilidad Individual Familiar
VWF-Variabilidad Factores 40%
no genéticos
60%
genéticos
VWF-Variabilidad Factores no-genéticos Edad
H. Tiroideas
Estrés
Estrógenos
Ejercicio
F.Aguda
VWF-Variabilidad Factores genéticos Grupo ABO 20-30% variabilidad Grupo “O” VWF Hipótesis Alteración Glicosilación procesamiento estabilidad secreción
VWD Distribución según grupo ABO “AB” 0,6% difícil diagnóstico “O” 70% más sintomático > frecuencia de consulta Woods AI, 2001
vWD-Tipo 2 Clasificación Revisada Sadler E, 1994
2A 2B 2M 2N
función plaquetaria Multímeros APM afinidad VWF-GPIb-IX función plaquetaria c/Multímeros APM afinidad VWF-FVIII*
*símil Hemofilia A, autosómica
VWF Pruebas Específicas Cuantitativa Cualitativa VWF:Ag
SI
NO
VWF:RCo
SI
SI
VWF:CB
SI
SI
SEMI
SI
Multímeros
VWF-ELISA
1 a-vWF
2 vWF
3 a-vWF-HRP
4 Color-Abs
1. Anti-VWF inmovilizado 2. Incubación con muestra o control 3. Incubación con anti-VWF-conjugado 4. Incubación con sustrato cromogénico
VWF:RCo Plaquetas normales Plasma del paciente
VWF:RCo Plaquetas normales Plasma del paciente
Ristocetina
Agregometría
Agregación c/Ristocetina
VWF:RCo Plaquetas normales Plasma del paciente
Ristocetina
Agregometría
Agregación c/Ristocetina PRP
Plaquetas del paciente Plasma del paciente
VWF:RCo Plaquetas normales Plasma del paciente
Ristocetina
Agregometría
Agregación c/Ristocetina PRP
Plaquetas del paciente Plasma del paciente
Ristocetina
Agregometría
Normal
Agregación c/Ristocetina
vWD-Tipo 1
vWD-Tipo 2A
Kasper C, 2005
vWD-Tipo 3
VWF:CB Unión Colágeno 1 Colágeno Tipo III
2 BSA 3 a-vWFconejo Muestra 4
Esferas poliestireno
IgG F(ab’)2*
1. Inmovilización 5 2. Bloqueo 3. Colágeno VWF 4. VWF a-VWF 5. a-VWF IgGF(ab’)2fluoresceína 6. Adquisición
6 Citometría de flujo
Actividad VWF-ELISA
1
2
a-vWF
vWF
3 a-vWF-HRP
4 Color-Abs
1. AcMo a-vWFepitope funcional inmovilizado 2. Incubación con muestra o control 3. Incubación con anti-vWF-conjugado 4. Incubación con sustrato cromogénico
Agregación c/Ristocetina
Kasper C, 2005
VWF:FVIIIB Enlace FVIII VWF
1 a-vWF
2 vWF
3 FVIII CaCl2 0,4M
4 Color-Abs
1. Anticuerpo a-vWF inmovilizado 2. Incubación con muestra o control 3. Incubación FVIII purificado/CaCl2 4. Incubación con sustrato cromogénico
2N-Variante Normandy Biología Molecular -
Secuenciación Enz. restricción
VWF- Arg19Trp (C2594T) Exón 18 Enzima BspMI 1
1-244 pb
2-148 pb 3-96 pb
Normal
148 pb 96 pb
Mutado
244 pb
Mutación Normal
2
3
VWD Estrategia Diagnóstica
Screening * T. Sangría APTT (fVIII) Adhesividad Tiempo de obstrucción (PFA) *no permiten excluir VWD
VWD Estrategia Diagnóstica Diagnóstico -VWF plasma/plaquetas VWF:Ag VWF:RCo VWF:CB
-FVIII en plasma
VWD Estrategia Diagnóstica
Clasificación Multímeros RIPA Unión GP plaquetarias VWF:FVIIIB Biología Molecular
vWD- Importancia Dignóstica VWF:RCo
Prueba más sensible
VWF:Ag
CorrelacionaVWF:RCo Ratio=1Tipo1 Ratio