Arbeitsanleitung / Manual

Biotin ELISA Zur in-vitro-Bestimmung von Biotin (Vitamin H) in Serum, Plasma, Arznei-, Lebens- und Futtermitteln For the in vitro determination of biotin (vitamin H) in serum, plasma, drugs and food

Gültig ab / Valid from 2015-12-16 +8 °C

K 8140 96

+2 °C

Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, 64625 Bensheim, Germany Tel.: +49 6251 70190-0

Fax: + 49 6251 849430

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Arbeitsanleitung

Biotin

Inhalt 1.

VERWENDUNGSZWECK_________________________________________________ 2

2.

EINLEITUNG___________________________________________________________ 2

3.

INHALT DER TESTPACKUNG_ ____________________________________________ 2

4.

ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL________________________ 3

5.

LAGERUNG UND VORBEREITUNG DER REAGENZIEN________________________ 3

6.

PROBENLAGERUNG UND -VORBEREITUNG________________________________ 4 Probenlagerung_ ________________________________________________________ 4 Probenvorbereitung_ _____________________________________________________ 4

7.

TESTDURCHFÜHRUNG__________________________________________________ 5 Testprinzip_ ____________________________________________________________ 5 Pipettierschema_ ________________________________________________________ 5

8.

ERGEBNISSE___________________________________________________________ 6

9.

EINSCHRÄNKUNGEN_ __________________________________________________ 7

10. QUALITÄTSKONTROLLE_________________________________________________ 7 Referenzwerte___________________________________________________________ 7 11. TESTCHARAKTERISTIKA_ _______________________________________________ 8 Präzision und Reproduzierbarkeit____________________________________________ 8 Sensitivität_ ____________________________________________________________ 8 Wiederfindung_ _________________________________________________________ 9 Spezifität_______________________________________________________________ 9 Linearität_ _____________________________________________________________ 9 Variation der Kalibrierkurve_ ______________________________________________ 10 12. VORSICHTSMASSNAHMEN1�������������������������������������������� 10 13. TECHNISCHE MERKMALE_ _____________________________________________ 10 14. ALLGEMEINE HINWEISE ZUM TEST______________________________________ 11

1

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1. VERWENDUNGSZWECK Der hier beschriebene Assay ist für die Bestimmung von Biotin in Serum, Plasma und anderen biologischen Flüssigkeiten und Nahrungsmitteln geeignet. Nur zur in-vitroDiagnostik.

2. EINLEITUNG Biotin (Vitamin H) findet sich weit verbreitet in Bakterien, Pilzen, höheren Pflanzen und tierischen Geweben. In Nahrungsmitteln tritt der Großteil des Biotins kovalent an Protein gebunden auf, während nur ein geringer Teil in freier Form zur Verfügung steht. Während des Verdauungsvorgangs wird das Biozytin (Biotinyl-Lysin) aus den Proteinen freigesetzt, das ähnlich dem Biotin leicht aus dem Intestinaltrakt resorbiert werden kann. Biotin wird anschließend im Plasma und in den Erythrozyten durch das Einwirken des Enzyms Biozytinase aus dem Biozytin freigesetzt und steht danach als prosthetische Gruppe für eine Reihe von biotinabhängigen Enzymen zur Verfügung. Der tägliche Bedarf an Biotin ist schwer abzuschätzen, da eine gesunde Darmflora durch endogene Synthese wesentlich zur Deckung des Vitamin-H-Bedarfs beiträgt. Nach neuesten Kenntnissen wird für Erwachsene eine tägliche Zufuhr von 100– 200 µg empfohlen. Bei chronischen Hämodialysepatienten zeigt eine Supplementierung im Milligrammbereich eine deutliche Verbesserung der neuropathologischen Lage und des Glukosestoffwechsels. Biotin-Mangelerscheinungen werden z. B. verursacht durch eine Zerstörung der Darmflora oder durch extreme Ernährungsgewohnheiten (z. B. häufiger Verzehr von rohen Eiern). Folgen des Biotinmangels können sein: Dermatitis, Haarausfall, Anorexie, muskuläre Hypotonie, Depressionen und Störungen der Fortpflanzung.

3. INHALT DER TESTPACKUNG

2

Art.-Nr.

Bezeichnung

Kit-Komponenten

Menge

K 8140

PLATE

Mikrotitermodul, vorbeschichtet

12 x 8 Vertiefungen

K 8140

WASHBUF

ELISA-Waschpufferkonzentrat, 10 x

1 x 100 ml

K 8140

CONJ

Konjugatkonzentrat, StreptavidinMeerretich-Peroxidase; grüner Verschluss 

1 x 300 µl

K 8140

STD

Standards, gebrauchsfertig (0; 37,5; 75; 150; 300; 600 ng/l); roter Verschluss

6 x 1 ml

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Biotin

Art.-Nr.

Bezeichnung

Kit-Komponenten

Menge

K 8140

CTRL A

Kontrolle, gebrauchsfertig gelber Verschluss

1 x 1 ml

K 8140

CTRL B

Kontrolle, gebrauchsfertig gelber Verschluss

1 x 1 ml

K 8140

SAMPLEBUF

Probenverdünnungspuffer, gebrauchsfertig

1 x 15 ml

K 8140

CONJBUF

Konjugatverdünnungspuffer, gebrauchsfertig

1 x 25 ml

K 8140

SUB

TMB-Substrat (Tetramethylbenzidin), gebrauchsfertig

1 x 15 ml

K 8140

STOP

ELISA-Stopplösung, gebrauchsfertig

1 x 15 ml

Für Nachbestellungen von Einzelkomponenten verwenden Sie als Bestellnummer die Artikelnummer gefolgt von der Bezeichnung.

4. ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL • Reinstwasser* • Präzisionspipetten und Pipettenspitzen für den Einmalgebrauch mit variablen Volumina von 2–1000 µl • Folie zum Abkleben der Mikrotiterplatte • Laborübliche Glas- oder Plastikröhrchen (Einmalartikel) • Absorptionspapier • Vortex-Mixer • Mikrotiterplattenphotometer (benötigte Filter siehe Kapitel 7) * Immundiagnostik AG empfiehlt die Verwendung von Reinstwasser nach ISO 3696. Es handelt sich dabei um Wasser des Typs 1, welches frei von ungelösten und kolloidalen Ionen und organischen Molekülen ist (frei von Partikeln > 0,2 µm) mit einer elektrischen Leitfähigkeit von 0,055 µS/cm bei 25 °C (≥ 18,2 MΩ cm).

5. LAGERUNG UND VORBEREITUNG DER REAGENZIEN • Bitte achten Sie bei mehrfachem Einsatz des Kits darauf, dass die Reagenzien wie in der Vorschrift beschrieben gelagert und nur die für den jeweiligen Ansatz benötigten Reagenzienmengen frisch angesetzt werden. Der Kit kann so bis zu 4 x je nach Probenaufkommen bis zum angegebenen Haltbarkeitsdatum verwendet werden.

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Biotin

• Reagenzien mit einem Volumen kleiner 100 µl sollten vor Gebrauch kurz anzentrifugiert werden, um Volumenverluste zu vermeiden. • Vorbereitung des Waschpuffers: Das Waschpufferkonzentrat (WASHBUF) muss vor Gebrauch 1:10 in Reinstwasser verdünnt werden (100 ml WASHBUF + 900 ml Reinstwasser), gut mischen. Aufgrund der hohen Salzkonzentration in den Stammlösungen kann es zu Kristallbildungen kommen. Die Kristalle lösen sich bei Raumtemperatur bzw. im Wasserbad bei 37 °C auf. Der WASHBUF kann bei 2–8 °C bis zum angegebenen Haltbarkeitsdatum aufbewahrt werden. Der Waschpuffer (1:10 verdünnter WASHBUF) ist bei 2–8 °C einen Monat in einem geschlossenen Gefäß haltbar. • Vorbereitung des Konjugats: Das Streptavidin-Enzymkonjugat-Konzentrat (CONJ) wird vor Gebrauch 1:101 in Konjugatverdünnungspuffer verdünnt (z. B. 100 µl CONJ + 10 ml CONJBUF). Das CONJ ist bei 2–8 °C bis zum angegebenen Haltbarkeitsdatum stabil. Konjugat (1:101 verdünntes CONJ) ist für etwa 8 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur (15–30 °C) haltbar. • Alle anderen Testreagenzien sind bei 2–8 °C zu lagern und bei entsprechender Lagerung bis zum angegebenen Verfallsdatum (siehe Etikett) verwendbar.

6. PROBENLAGERUNG UND -VORBEREITUNG Probenlagerung Serum und Plasma Serumproben können bei 2–8 °C bis zu 24 h gelagert werden. Bei längerer Lagerzeit ist das Material bei -20 °C einzufrieren. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden.

Probenvorbereitung Serum und Plasma Humanes Serum bzw. Plasma kann im Assay direkt eingesetzt werden, sollte aber frei von unlöslichen Partikeln sein. Trübe Serumproben sollten vor Verwendung anzentrifugiert werden (3000 g). Serum- und Plasmaproben mit erwarteter hoher Biotinkonzentration (über 600 ng/l) müssen mit dem in der Kitpackung enthaltenen Probenverdünnungspuffer (SAMPLE­ BUF) entsprechend vorverdünnt werden.

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Milch Milchproben müssen mindestens 1:100 mit dem in der Kitpackung enthaltenen Probenverdünnungspuffer (SAMPLEBUF) verdünnt werden.

7. TESTDURCHFÜHRUNG Testprinzip Der vorliegende Assay ist als kompetitiver Enzyme-Linked-Assay aufgebaut und wurde speziell zum Nachweis von Biotin in humanem Serum und Plasma entwickelt. Proben, Standards und Kontrollen werden mit einem Streptavidin-Enzym­konjugat vorinkubiert. Danach werden jeweils 100 µl in Kavitäten einer Mikrotiterplatte überführt, wobei die Vertiefungen der Mikrotiterplatte bereits mit einem Biotin-­ Albumin-­Konjugat beschichtet sind. Falls die Streptavidin-Enzymkonjugate noch freie Valenzen für Biotin haben, findet eine Bindung der Konjugate an die Kavitäten der Mikrotiterplatte statt. Nach Zugabe des Enzymsubstrates wird die Absorption bestimmt, die sich umgekehrt proportional der Biotinkonzentration in den Proben, Standards und Kontrollen verhält. Anhand der mitgeführten Standardkurve – optische Dichte (Absorption bei 450 nm) versus Standardkonzentration – lässt sich die Konzentration der Probe ermitteln.

Pipettierschema Vor Gebrauch alle Reagenzien und Proben auf Raumtemperatur (15–30 °C) bringen, gut mischen. Markieren Sie die Positionen für STD/SAMPLE/CTRL (Standards/Proben/Kontrollen) im Protokollblatt. Die benötigten Mikrotiterstreifen aus dem Kit nehmen. Nicht verwendete Mikrotiterstreifen können abgeklebt bis zum angegebenen Haltbarkeitsdatum bei 2–8 °C gelagert werden. Im Fall einer automatisierten Abarbeitung des Tests können automatenspezifische Anpassungen der Prozedur notwendig sein, um den jeweiligen technischen Gegebenheiten gerecht zu werden. Für Unterstützung und Rückfragen wenden Sie sich bitte an Ihren Anbieter oder Immundiagnostik AG. Wir empfehlen, die Bestimmungen in Doppelwerten durchzuführen. 1.

150 µl Standard (STD), Kontrollen (CTRL) und Proben in individuelle Teströhrchen vorgelegen.

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2.

Biotin

150 µl Konjugat in jedes Teströhrchen pipettieren und auf dem Vortexer­ mischen.

3. 30 min bei Raumtemperatur (15-30 °C) inkubieren. 4.

100 µl von jedem Teströhrchen in individuelle Kavitäten der Mikrotiterplatte überführen.

5. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Inhalt der Vertiefungen verwerfen und 5 x mit je 250 µl Waschpuffer 6. waschen. Nach dem letzten Waschschritt Reste von Waschpuffer durch Ausklopfen auf saugfähigem Papier entfernen. 7. 100 µl SUB (Substrat) in alle Vertiefungen pipettieren. 8. 5–20 min* bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. 9.

100 µl STOP (Stopplösung) in alle Vertiefungen pipettieren, vorsichtig schütteln.

Extinktion sofort im Mikrotiterplattenphotometer bei 450 nm gegen die Referenzwellenlänge 620 nm (oder 690 nm) messen. Ist keine Referenzwellenlänge vorhanden, wird nur bei 450 nm gemessen. Falls die 10. Extinktion des höchsten Standards den Messbereich des Photometers übersteigt, sollte sofort bei 405 nm gegen 620 nm (690 nm) gemessen werden. * Die Intensität der Farbentwicklung ist temperaturabhängig. Es wird empfohlen, den Farbumschlag während der Inkubationszeit zu beobachten und entsprechend der Farbentwicklung die Reaktion zu stoppen.

8. ERGEBNISSE Die unten beschriebenen mathematischen Modelle können alternativ zur Auswertung benutzt werden. Wir empfehlen die 4-Parameter-Funktion: 1. 4-Parameter-Funktion Für die optische Dichte empfehlen wir eine lineare Ordinate und für die Konzentration eine logarithmische Abszisse (bei einer logarithmischen Abszisse muss für den Standard mit der Konzentration 0 ein Wert kleiner 1 eingegeben werden z. B. 0,001).

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Biotin

2. Punkt-zu-Punkt-Auswertung Für die optische Dichte und für die Konzentration empfehlen wir eine lineare Ordinate bzw. Abszisse. 3. Gewichtete Spline-Funktion Für die optische Dichte und für die Konzentration empfehlen wir eine lineare Ordinate bzw. Abszisse. Vor jeder automatischen Auswertung sollte stets eine Kontrolle der Doppelwerte auf Plausibilität („Ausreißerkontrolle“) durchgeführt werden; falls dies nicht durch das verwendete Programm erfolgt, sollte die Kontrolle manuell durchgeführt werden. Serum/Plasma Der ermittelte Biotin-Spiegel der Proben kann direkt abgelesen werden. Sollte ein Verdünnungsfaktor verwendet worden sein, so ist die ermittelte Konzentration mit dem verwendeten Verdünnungsfaktor zu multiplizieren. Milch Der ermittelte Biotin-Spiegel der Milchproben wird mit dem Verdünnungsfaktor 100 multipliziert. Sollte ein anderer Verdünnungsfaktor verwendet worden sein, so ist die ermittelte Konzentration mit dem verwendeten Verdünnungsfaktor zu multiplizieren.

9. EINSCHRÄNKUNGEN Proben, deren OD höher ist als die des höchsten Standards, sollten mit Probenverdünnungspuffer stärker verdünnt und nochmals im Assay eingesetzt werden. Bei der folgenden Auswertung ist der veränderte Verdünnungsfaktor zu beachten.

10. QUALITÄTSKONTROLLE Immundiagnostik empfiehlt den Einsatz von externen Kontrollen für die interne Qualitätskontrolle, wenn möglich. Wir empfehlen, bei jedem Testansatz Kontrollen mitzumessen. Die Ergebnisse der Kontrollen müssen auf Richtigkeit überprüft werden. Liegen eine oder mehrere Kontrollen außerhalb des angegebenen Bereiches, kann Immundiagnostik die Richtigkeit der Messergebnisse nicht gewährleisten.

Referenzwerte Gesunde:

≥ 200 ng/l 7

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Suboptimaler Status: 100–200 ng/l Avitaminose: < 100 ng/l Wir empfehlen jedem Labor, einen eigenen Referenzbereich zu etablieren.

11. TESTCHARAKTERISTIKA Präzision und Reproduzierbarkeit Intra- und Interassayvariation Die Intra- und Interassayvariation beträgt 1,5 %, bzw. 4,9 %. Präzision Das Präzisionsprofil wurde durch die Messung von jeweils 5 Replikaten jedes einzelnen Standards und die Bestimmung des Variationskoeffizienten für jeden einzelnen Konzentrationswert ermittelt. Der mittlere Variationskoeffizient der Standards lag bei 1,8 %.

Sensitivität Die Sensitivität wurde entsprechend der Richtlinien der internationalen Gesellschaft für Klinische Chemie definiert: die Nachweisgrenze ist der geringste vom Nullstandard zu unterscheidende Wert der Biotin-konzentration minus 3 SD. Die Nachweisgrenze beträgt 15 ng Biotin/l. Die effektive Dosis für 50 % des Maximalwertes lag bei 100 ng Biotin/l.

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Biotin

Wiederfindung Humanserum mit 86 ng/l endogenem Biotin wurde mit unterschiedlichen Mengen Biotin versetzt und mit dem Testkit ausgewertet: Spike [ng/l]

Biotin erwartet [ng/l]

Biotin gemessen [ng/l]

Wiederfindung [%]

250

336

366

109

125

211

213

101

62,5

147,5

141

95

31,25

117,25

110

94

Die durchschnittliche Wiederfindung beträgt 100 % ± 7 %.

Spezifität Die Spezifität wurde durch Bestimmung der Kreuzreaktivität verwandter Substanzen nachgewiesen. Die Kreuzreaktivität bezogen auf die Biotin-Reaktivität ist in Prozent angegeben: Biotin-4-Amidobenzoesäure: 81% Biozitin: 106%

Linearität Die Verdünnungsechtheit wurde durch Verdünnung von Serum mit Probenverdünnungspuffer bestimmt.

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Variation der Kalibrierkurve Durch die Messung von jeweils 5 Replikaten jedes einzelnen Standards wurde das Präzisionsprofil bestimmt und der Variationskoeffizient für jeden einzelnen Konzentrationswert berechnet. Der mittlere Variationskoeffizient der Standards lag bei 1,8 %.

12. VORSICHTSMASSNAHMEN • Alle im Kit enthaltenen Reagenzien dürfen ausschließlich zur in-vitro-Diagnostik verwendet werden. • Das für Kitkomponenten verwendete humane Material wurde auf HIV, Hepatitis B und Hepatitis C getestet und für negativ befunden. Dennoch wird empfohlen, die Kitkomponenten als Vorsichtsmaßnahme immer wie potentiell infektiöses Material zu behandeln. • Die Kitkomponenten enthalten zum Schutz vor bakteriellen Kontaminationen Natriumazid. Natriumazid ist giftig. Auch Substrate für enzymatische Farbreaktionen sind als giftig und karzinogen beschrieben. Jeder Kontakt mit Haut oder Schleimhaut ist zu vermeiden. • Die Stopplösung besteht aus verdünnter Schwefelsäure (H2SO4). H2SO4 ist eine starke Säure und muss auch in verdünnter Form mit Vorsicht benutzt werden. H2SO4 verursacht bei Kontakt mit der Haut Verätzungen. Es sollte daher mit Schutzhandschuhen, Schutzkleidung und Schutzbrille gearbeitet werden. Bei Kontakt mit der Säure muss die verätzte Stelle sofort mit viel Wasser gespült werden.

13. TECHNISCHE MERKMALE • Reagenzien der Testpackung dürfen nicht mit anderen Chargen gemischt werden. Ferner dürfen Kavitäten unterschiedlicher Mikrotiterplatten, selbst der gleichen Charge, nicht zusammengefügt und zur Analyse verwendet werden. • Qualitätskontrollen sollten immer mitgemessen werden. • Die Reagenzien dürfen nach Ablauf des Mindesthaltbarkeitsdatums nicht mehr verwendet werden. • Substratlösung muss vor Gebrauch farblos sein.

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• Mikrotiterstreifen müssen während den Inkubationen mit Folie abgedeckt sein. • Vermeiden Sie Schaumbildung beim Mischen der Reagenzien. • Stopfen und Verschlüsse verschiedener Reagenzien dürfen nicht vertauscht werden. • Der Assay ist immer nach der im Kit beigefügten Arbeitsanleitung durchzuführen.

14. ALLGEMEINE HINWEISE ZUM TEST • Dieser Kit wurde nach der IVD-Richtlinie 98/79/EG hergestellt und in den Verkehr gebracht. • Für die Qualitätskontrolle sind die für medizinische Laboratorien erstellten Richtlinien zu beachten. • Die Testcharakteristika wie Inkubationszeiten, Inkubationstemperaturen und Pipettiervolumina der verschiedenen Komponenten wurden vom Hersteller festgelegt. Nicht mit dem Hersteller abgesprochene Veränderungen in der Testdurchführung können die Resultate beeinflussen. Die Firma Immundiagnostik AG übernimmt für die hierdurch entstandenen Schäden und Folgeschäden keine Haftung. • Bei Gewährleistungsansprüchen ist das beanstandete Material mit schriftlicher Erklärung innerhalb von 14 Tagen zum Hersteller, der Immundiagnostik AG, zurückzusenden.

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Table of Contents 1.

INTENDED USE_ ______________________________________________________ 15

2.

INTRODUCTION_______________________________________________________ 15

3.

MATERIAL SUPPLIED_ _________________________________________________ 15

4.

MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED________________________________ 16

5.

STORAGE AND PREPARATION OF REAGENTS_ ____________________________ 16

6.

STORAGE AND PREPARATION OF SAMPLES_ _____________________________ 17 Sample storage_________________________________________________________ 17 Sample preparation_ ____________________________________________________ 17

7.

ASSAY PROCEDURE_ __________________________________________________ 17 Principle of the test______________________________________________________ 17 Test procedure__________________________________________________________ 17

8.

RESULTS_ ____________________________________________________________ 18

9.

LIMITATIONS_ ________________________________________________________ 19

10. QUALITY CONTROL____________________________________________________ 19 Reference range_ _______________________________________________________ 20 11. PERFORMANCE CHARACTERISTICS_ ____________________________________ 20 Specificity _____________________________________________________________ Sensitivity_____________________________________________________________ Recovery______________________________________________________________ Intra- and interassay variation_____________________________________________ Variation in calibration curve______________________________________________ Dilution linearity________________________________________________________

20 20 20 21 21 21

12. PRECAUTIONS________________________________________________________ 22 13. TECHNICAL HINTS_ ___________________________________________________ 22 14. GENERAL NOTES ON THE TEST AND TEST PROCEDURE_ ___________________ 22 15. REFERENCES_ ________________________________________________________ 23

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1. INTENDED USE This Immundiagnostik assay is intended for the quantitative determination of biotin in serum, plasma and foods. For in vitro diagnostic use only.

2. INTRODUCTION In the late 1950s, Lynen (1) and Wakil (2) reported the discovery of covalently bound biotin with a coenzyme function. Biotin is a growth factor present in minute amounts in every living cell. It plays an indispensable role in numerous naturally occurring carboxylation reactions. The daily biotin requirements for adults lie between 100 and 200 mg. Renewed interest in the role of biotin in human nutrition and therapy stems from the accumulating reports of various biotin-responsive syndromes (3–5). A variety of methods for the assay of biotin are currently available (6–11). However, most of them are either cumbersome to perform or based on the use of radioactive materials. This assay is a convenient reciprocal assay for biotin. It is extremely sensitive, easy to perform and doesn’t use radiolabels.

3. MATERIAL SUPPLIED Cat. No.

Label

Kit components

Quantity

K 8140

PLATE

Holder with precoated strips

12 x 8 wells

K 8140

WASHBUF

ELISA wash buffer concentrate, 10 x

1 x 100 ml

K 8140

SAMPLEBUF

Sample dilution buffer, ready-to-use

1 x 15 ml

K 8140

CONJBUF

Conjugate dilution buffer, ready-to-use

1 x 25 ml

K 8140

STD

Calibrators, ready-to-use (red cap) (0; 37.5; 75; 150; 300; 600 ng/l)

6 x 1 ml

K 8140

CONJ

Conjugate, horseradish peroxidaselabelled streptavidin (green cap)

1 x 300 µl

K 8140

CTRL A

Control A, ready-to-use (yellow cap)

1 x 1 ml

K 8140

CTRL B

Control B, ready-to-use (yellow cap)

1 x 1 ml

K 8140

SUB

TMB substrate (tetramethylbenzidine), ready-to-use

1 x 15 ml

K 6750

STOP

ELISA stop solution, ready-to-use

1 x 15 ml

For reorders of single components, use the catalogue number followed by the label as product number.

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Biotin

4. MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED • • • • • • •

Ultra pure water* Calibrated precision pipettors and 2–1000 µl tips Foil to cover the microtiter plate Absorbent paper Vortex Standard laboratory glass or plastic vials, cups, etc. Microtiter plate reader (required filters see chapter 7) * Immundiagnostik AG recommends the use of Ultra Pure Water (Water Type 1; ISO 3696), which is free of undissolved and colloidal ions and organic molecules (free of particles > 0.2 µm) with an electrical conductivity of 0.055 µS/cm at 25 °C (≥ 18.2 MΩ cm).

5. STORAGE AND PREPARATION OF REAGENTS • To run the assay more than once, ensure that reagents are stored at the conditions stated on the label. Prepare only the appropriate amount necessary for each run. The kit can be used up to 4 times within the expiry date stated on the label. • Reagents with a volume less than 100 µl should be centrifuged before use to avoid loss of volume. • Preparation of the wash buffer: The wash buffer concentrate (WASHBUF) has to be diluted with ultra pure water 1:10 before use (100 ml WASHBUF + 900 ml ultra pure water), mix well. Crystals could occur due to high salt concentration in the stock solutions. The crystals must be redissolved in a water bath at 37 °C before dilution of the buffer solutions. The WASHBUF is stable at 2–8 °C until the expiry date stated on the label. Wash buffer (1:10 diluted WASHBUF) can be stored in a closed flask at 2–8 °C for one month. • Preparation of the conjugate: Before use, the conjugate concentrate (CONJ) has to be diluted 1:101 in conjugate dilution buffer (100 µl CONJ + 10 ml CONJBUF). The CONJ is stable at 2–8 °C until the expiry date stated on the label. Conjugate (1:101 diluted CONJ) is stable for 8 hours at room temperature (15-30 °C) in the dark. • All other test reagents are ready to use. Test reagents are stable until the expiry date (see label of test package) when stored at 2–8 °C.

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6. STORAGE AND PREPARATION OF SAMPLES Sample storage Serum and plasma Serum samples can be stored at 2–8 °C for up to 24  hours. For long time storage, serum samples should be frozen at -20 °C. Repeated freezing and thawing should be avoided.

Sample preparation Serum and plasma Human serum can directly be processed, but it should be free from insoluble particles. Remove insoluble particles by short centrifugation (3000 g). Serum samples with an expected high biotin concentration (more than 600 ng/l) have to be diluted appropriately with the sample dilution buffer (SAMPLEBUF) provided. Milk Milk can be assayed without pre-treatment but have to be diluted at least 1:100 in the sample dilution buffer (SAMPLEBUF) provided.

7. ASSAY PROCEDURE Principle of the test This test is a competitive enzyme-linked assay for biotin determination in human serum. Samples, standards and controls are incubated with streptavidin-enzyme conjugate for 15 minutes at 15–30 °C. Then 100 µl of each incubation mixture is transferred in duplicate into microtiter plate wells coated with biotin-albumin conjugate. After a second incubation step of 30 minutes at 15–30 °C, the enzyme substrate TMB is added. Finally, the reaction is terminated by an acidic stop solution causing a color change from blue to yellow. The color intensity is inversely proportional to the biotin concentration. A dose response curve of the absorbance unit (optical density, OD at 450 nm) vs. concentration is generated using the values obtained from the standards. Biotin present in the patient samples is determined from this curve.

Test procedure Bring all reagents and samples to room temperature (15–30 °C) and mix well. 17

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Mark the positions of STD /SAMPLE/CTRL (standards/sample/controls) on a protocol sheet. Take as many microtiter strips as needed from kit. Store unused strips covered at 2–8 ° C. Strips are stable until expiry date stated on the label. For automated ELISA processors, the given protocol may need to be adjusted according to the specific features of the respective automated platform. For further details please contact your supplier or Immundiagnostik AG. We recommend to carry out the tests in duplicate. 1.

Add 150 µl of STD/CTRL/SAMPLE (standard/controls/sample) into individual test tubes.

2. Add 150 µl conjugate into each test tube and mix well. 3. Incubate for 30 min at room temperature (15–30 °C). 4.

Transfer 100 µl of the content of each tube into individual microtiter wells.

5.

Cover the strips and incubate for 30 min at room temperature (15– 30 °C).

Discard the contents of each well and wash 5 times with 250 µl wash 6. buffer. After the final washing step, the inverted microtiter plate should be firmly tapped on absorbent paper. 7. Add 100 µl SUB (TMB substrate) into each well. 8. Incubate for 5–20 minutes* at room temperature (15–30 °C) in the dark. 9. Add 100 µl STOP (ELISA stop solution) and mix well. Determine absorption immediately with an ELISA reader at 450 nm against 620 nm (or 690 nm) as a reference. If no reference wavelength is 10. available, read only at 450 nm. If the extinction of the highest standard exceeds the range of the photometer, absorption must be measured immediately at 405 nm against 620 nm as a reference. * The intensity of the color change is temperature sensitive. We recommend observing the color change and stopping the reaction upon good differentiation.

8. RESULTS The following algorithms can be used alternatively to calculate the results. We recommend using the “4 parameter algorithm“. 18

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1. 4 parameter algorithm It is recommended to use a linear ordinate for the optical density and a logarithmic abscissa for the concentration. When using a logarithmic abscissa, the zero standard must be specified with a value less than 1 (e. g. 0.001). 2. Point-to-point calculation We recommend a linear ordinate for the optical density and a linear abscissa for the concentration. 3. Spline algorithm We recommend a linear ordinate for the optical density and a linear abscissa for the concentration. The plausibility of the duplicate values should be examined before the automatic evaluation of the results. If this option is not available with the programme used, the duplicate values should be evaluated manually. Serum / plasma In case a dilution factor has been used, multiply the obtained result with the dilution factor used. Milk The obtained results have to be multplied with the dilution factor of 100 to get the actual concentrations. In case another dilution factor has been used, multiply the obtained result with the dilution factor used.

9. LIMITATIONS Samples with an OD higher than the OD of the highest standard should be further diluted and re-assayed. For the following analysis, the changed dilution factor has to be taken into consideration.

10. QUALITY CONTROL Immundiagnostik recommends the use of external controls for internal quality control, if possible. Control samples should be analysed with each run. Results, generated from the analysis of control samples, should be evaluated for acceptability using appropriate statistical methods. The results for the patient samples may not be valid if within the 19

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same assay one or more values of the quality control sample are outside the acceptable limits.

Reference range Healthy: ≥ 200 ng/l Suboptimal status: 100–200 ng/l Vitamin deficiency: < 100 ng/l We recommend each laboratory to establish its own reference range.

11. PERFORMANCE CHARACTERISTICS Specificity The specificity of the biotin assay was established by analyzing the cross-reactivity with related compounds. The values represent the cross-reactivity as a percentage of the biotin reactivity: biotin-4-amidobenzoic acid: 81 % biocytin: 106 %

Sensitivity The limit of detection was defined as the lowest biotin concentration distinguishable from the zero standard and calculated as the concentration causing an absorbance value lower than the absorbance of the zero standard minus 3 SD, according to the recommendation of the International Federation of Clinical Chemistry (12). The detection limit was determined to be 15 ng biotin/liter. The effective dose for 50 % of maximal response was 100 ng biotin/l.

Recovery Human serum with 86 ng/l endogenous biotin was spiked with variable amounts of biotin and assayed with the in vitro test biotin.

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Spiked with biotin [ng/l]

Biotin expected [ng/l]

Biotin measured [ng/l]

Recovery [%]

250

336

366

109

125

211

213

101

62.5

148.5

141

95

31.25

117.25

110

94

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The overall recovery is 100 % ± 7 %.

Intra- and interassay variation The intra- and interassay variation was 1.5 % and 4.9 %, respectively.

Variation in calibration curve The precision profile was generated by preparing five replicates of each of the standards and calculating the standard variation and percent coefficient of variation (CV) at each concentration. The average CV between the standards was 1.8 %.

Dilution linearity The dilution linearity profile was generated by diluting serum, with a normal amount of endogenous biotin, with sample diluent. The assay was carried out as described.

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Biotin

12. PRECAUTIONS • All reagents in the kit package are for in vitro diagnostic use only. • Human materials used in kit components were tested and found to be negative for HIV, hepatitis B and hepatitis C. However, for safety reasons, all kit components should be treated as potentially infectious. • Kit reagents contain sodium azide or ProClin as bactericides. Sodium azide and ProClin are toxic. Substrates for the enzymatic color reactions are toxic and carcinogenic. Avoid contact with skin or mucous membranes. • The stop solution consists of diluted sulphuric acid, a strong acid. Although diluted, it still must be handled with care. It can cause burns and should be handled with gloves, eye protection, and appropriate protective clothing. Any spill should be wiped up immediately with copious quantities of water. Do not breath vapour and avoid inhalation.

13. TECHNICAL HINTS • Do not interchange different lot numbers of any kit component within the same assay. Furthermore we recommend not assembling wells of different microtiter plates for analysis, even if they are of the same batch. • Control samples should be analyzed with each run. • Reagents should not be used beyond the expiration date stated on kit label. • Substrate solution should remain colourless until use. • To ensure accurate results, proper adhesion of plate sealers during incubation steps is necessary. • Avoid foaming when mixing reagents. • Do not mix plugs and caps from different reagents. • The assay should always be performed according the enclosed manual.

14. GENERAL NOTES ON THE TEST AND TEST PROCEDURE • This assay was produced and distributed according to the IVD guidelines of 98/79/EC. • The guidelines for medical laboratories should be followed. 22

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• Incubation time, incubation temperature and pipetting volumes of the components are defined by the producer. Any variation of the test procedure, which is not coordinated with the producer, may influence the results of the test. Immundiagnostik AG can therefore not be held responsible for any damage resulting from incorrect use. • Warranty claims and complaints regarding deficiencies must be logged within 14 days after receipt of the product. The product should be send to Immundiagnostik AG along with a written complaint.

15. REFERENCES 1. Lynen, F., Knappe, J., Lorch, E., Jutting, G. and Ringelmann, E. (1959) Angew. Chem. 71, 481. 2. Wakil, S. J. and Gibson, D.M. (1960) Biochim. Biophys. Acta 41, 122. 3. Bonjour, J.P. (1977) Int. J. Vit. Nutr. Res. 47, 107. 4. Dakshinamurti, K. and Bhagavan, H.N. eds. (1985) Biotin, Vol. 447, pp. 1-441, Ann. N.Y. Acad, Sci., New York 5. Watanabe, T. (1983) J. Nutr. 113, 574. 6. Green, N.M. (1970) in Methods in Enzymology (McCormick, D.B. and Wright, L.D., eds), Vol. 18, pp. 383-385, Academic press, New York. 7. Hood, R.L. (1979) in Methods in Enzymology (McCormick. D.B. and Wright, L.D., eds.), Vol. 62, pp. 279-283, Academic Press, New York. 8. Dakshinamurtik. and Allan, L. in Methods in Enzymology (McCormick, D.B. and Wright, L.D., eds), Vol. 62, pp. 284-287, Academic press, New York. 11 January 20069. 9. Green, N.M. (1970) in Methods in Enzymology (McCormick, D.B. and Wright, L.D., eds), Vol. 18, pp. 418-424, Academic press, New York. 10. Lin. H.J. and Kirsch, J.F. (1979) in Methods in Enzymology (McCormick, D.B. and Wright, L.D., eds), Vol. 62, pp. 287-289, Academic press, New York. 11. Al-Hakiem, M.H.H., Landon, J., Smith, D.S. and Nargessi, R.D. (1981) Anal. Biochem. 116, 264. 12. Büttner, J., Borth, R., Boutwell, J.H., Broughton, P.M.G. and Bowyer, R.C. (1979) Quality control in clinical chemistry. Clin. Chim. Acta 98, 145F-162F. 13. Livaniou, E., Evangelatos, G.P. and Ithakissios, D.S. (1987) Clin. Chem. 33, 19831988. 23

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