Anti-Gliadin (GAF-3X)-ELISA (IgG) Arbeitsanleitung BESTELL-NR. EV 3011-9601 G
ANTIKÖRPER GEGEN Gliadin (GAF-3X)
IG-KLASSE
SUBSTRAT
FORMAT
IgG
Ag-beschichtete Mikrotitergefäße
96 x 01 (96)
Indikationen: Gluten-sensitive Enteropathie (Zöliakie), Dermatitis herpetiformis Duhring. Testprinzip: Der vorliegende ELISA-Testsatz dient der semiquantitativen oder quantitativen in-vitroBestimmung humaner Antikörper der Immunglobulinklasse IgG gegen Gliadin (GAF-3X) aus Serum oder Plasma. Die Testpackung enthält Mikrotiterstreifen zu je 8 vereinzelbaren Reagenzgefäßen, die mit Gliadin (GAF-3X) beschichtet sind. Die Reagenzgefäße werden im ersten Analyseschritt mit verdünnten Patientenproben inkubiert. Bei positiven Proben binden sich spezifische Antikörper der Klasse IgG (und IgA, IgM) an die jeweiligen Antigene. Zur Darstellung dieser Antikörper inkubiert man in einem zweiten Schritt mit einem Enzym-markierten Anti-Human-IgG (Enzymkonjugat), das eine sich anschließende Farbreaktion katalysiert. Inhalt einer Testpackung: Bezeichnung 1. Antigen-beschichtete Reagenzgefäße 12 Mikrotiterstreifen zu je 8 vereinzelbaren Reagenzgefäßen im Rahmen, gebrauchsfertig 2. Kalibrator 1 200 RE/ml (IgG, human), gebrauchsfertig 3. Kalibrator 2 25 RE/ml (IgG, human), gebrauchsfertig 4. Kalibrator 3 2 RE/ml (IgG, human), gebrauchsfertig 5. Positive Kontrolle (IgG, human), gebrauchsfertig 6. Negative Kontrolle (IgG, human), gebrauchsfertig 7. Enzymkonjugat Peroxidase-markiertes Anti-Human-IgG (Kaninchen), gebrauchsfertig 8. Probenpuffer gebrauchsfertig 9. Waschpuffer 10fach konzentriert 10. Chromogen/Substrat-Lösung TMB/H2O2, gebrauchsfertig 11. Stopplösung 0,5 M Schwefelsäure, gebrauchsfertig 12. Arbeitsanleitung 13. Protokoll mit Sollwertvorgaben .LOT. Chargen-Bezeichnung .IVD. In vitro-Diagnostikum
Farbe
Format
Symbol
---
12 x 8
.STRIPS.
dunkelrot
1 x 2,0 ml
.CAL 1.
rot
1 x 2,0 ml
.CAL 2.
hellrot
1 x 2,0 ml
.CAL 3.
blau
1 x 2,0 ml
.POS CONTROL.
grün
1 x 2,0 ml
.NEG CONTROL.
grün
1 x 12 ml
hellblau
1 x 100 ml
.SAMPLE BUFFER.
farblos
1 x 100 ml
.WASH BUFFER 10x.
farblos
1 x 12 ml
.SUBSTRATE.
farblos
1 x 12 ml
.STOP SOLUTION.
-----
1 Heft 1 Protokoll Lagertemperatur ungeöffnet verwendbar bis
.CONJUGATE.
Lagerung und Haltbarkeit: Die Testpackung ist bei +2 °C bis +8 °C aufzubewahren, nicht einfrieren! Ungeöffnet sind die Testsatzkomponenten bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. Entsorgung: Patientenproben, Kalibrator, Kontrollen und inkubierte Mikrotiterstreifen sind wie infektiöser Abfall zu handhaben. Alle Reagenzien sind nach den gesetzlichen Vorschriften zu entsorgen.
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Vorbereitung und Haltbarkeit der Reagenzien Hinweis: Sämtliche Reagenzien müssen ca. 30 Minuten vor Gebrauch auf Raumtemperatur (+18 °C bis +25 °C) gebracht werden. Nach erstmaligem Öffnen sind die Reagenzien bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar, wenn sie bei +2 °C bis +8 °C gelagert und gegen Kontamination geschützt werden, und es im nachfolgenden Text nicht ausdrücklich anders beschrieben ist. - Beschichtete Reagenzgefäße: Gebrauchsfertig. Die wiederverschließbare Schutzhülle der Mikrotiterplatte an den Einkerbungen oberhalb der Gripnaht aufreißen. Schutzhülle erst öffnen, wenn der Inhalt Raumtemperatur angenommen hat, damit die Präparate nicht feucht werden! Nicht gebrauchte Reagenzgefäße einer angebrochenen Mikrotiterplatte sofort wieder in die Schutzhülle legen und mit der integrierten Gripnaht dicht verschließen (Trockenbeutel nicht entfernen). Nach dem erstmaligen Öffnen der Schutzhülle sind die Antigen-beschichteten Reagenzgefäße trocken bei +2 °C bis +8 °C gelagert 4 Monate lang haltbar. - Kalibratoren und Kontrollen: Gebrauchsfertig. Die Reagenzien sind vor Gebrauch gründlich zu durchmischen. - Enzymkonjugat: Gebrauchsfertig. Das Enzymkonjugat ist vor Gebrauch gründlich zu durchmischen. - Probenpuffer: Gebrauchsfertig. - Waschpuffer: Der Waschpuffer ist 10fach konzentriert. Sollten im konzentrierten Puffer Salzkristalle auftreten, den Puffer auf 37 °C erwärmen und vor dem Verdünnen gut durchmischen. Das benötigte Volumen ist der Flasche mit einer sauberen Pipettenspitze zu entnehmen und mit entionisiertem oder destilliertem Wasser zu verdünnen (1 Teil Reagenz plus 9 Teile Wasser). Beispiel: Für 1 Mikrotiterstreifen 5 ml Konzentrat plus 45 ml Wasser. Der gebrauchsfertig verdünnte Waschpuffer ist bei +2 °C bis +8 °C gelagert und bei sachgerechter Handhabung 1 Monat lang haltbar. - Chromogen/Substrat-Lösung: Gebrauchsfertig. Die Flasche sofort nach Gebrauch wieder verschließen, da die Lösung lichtempfindlich ist. Die Chromogen/Substrat-Lösung muss klar sein, wenn sie vor Benutzung bereits bläulich gefärbt ist, darf sie nicht mehr verwendet werden. - Stopplösung: Gebrauchsfertig. Warnung: In den Kontrollen und Kalibratoren ließen sich mit Enzymimmuntests und indirekter Immunfluoreszenz weder HBsAg, noch Antikörper gegen HCV, HIV-1 und HIV-2 nachweisen. Dennoch sollte man mit allen Testkomponenten ebenso vorsichtig umgehen wie mit infektiösem Material. Einige der Reagenzien enthalten außerdem das giftige Natriumazid, Hautkontakt ist zu vermeiden.
Vorbereitung und Haltbarkeit der Proben Probenmaterial: Humanes Serum sowie EDTA-, Heparin- oder Citrat-Plasma. Haltbarkeit: Die zu untersuchenden Patientenproben können in der Regel bei +2 °C bis +8 °C bis zu 14 Tage aufbewahrt werden. Verdünnte Proben müssen innerhalb eines Arbeitstages inkubiert werden. Probenverdünnung: Die zu untersuchenden Patientenproben werden im Verhältnis 1:201 mit Probenpuffer verdünnt. Beispiel: 5 µl Probe in 1,0 ml Probenpuffer aufnehmen und gut durchmischen (Vortex). Die Probenpipette ist zum Mischen ungeeignet. Hinweis: Die Kalibratoren und Kontrollen sind gebrauchsfertig, nicht verdünnen.
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Inkubation Außer der Positiv- und Negativkontrolle sowie den Patientenproben verwendet man für die Durchführung eines semiquantitativen Tests zusätzlich den Kalibrator 2, für die Durchführung eines quantitativen Tests zusätzlich die Kalibratoren 1-3. (Teil-) manuelle Testdurchführung Proben-Inkubation: (1. Schritt)
Entsprechend dem Pipettierschema je 100 µl Kalibrator, Positiv- und Negativkontrolle oder verdünnte Patientenproben in die einzelnen Reagenzgefäße pipettieren. 30 Minuten bei Raumtemperatur (+18 °C bis +25 °C) inkubieren.
Waschen:
Manuell: Reagenzgefäße entleeren und anschließend 3x mit jeweils 300 µl gebrauchsfertig verdünntem Waschpuffer waschen. Automatisch: Reagenzgefäße entleeren und anschließend 3x mit je 450 µl gebrauchsfertig verdünntem Waschpuffer waschen (Programm-Einstellung: z.B. TECAN Columbus Washer „Overflow Modus“). Den Waschpuffer in jedem Reagenzgefäß pro Waschzyklus 30-60 Sekunden einwirken lassen, anschließend absaugen oder ausschütten. Nach dem Waschvorgang sowohl bei manueller als auch automatischer Durchführung die Mikrotiterplatte mit den Öffnungen nach unten kräftig auf Vliespapier ausschlagen, um Waschpufferreste vollständig zu entfernen. Achtung: Flüssigkeitsreste (>10 µl), die nach dem Waschvorgang in den Reagenzgefäßen verbleiben, können einen Einfluss auf die Substratumsetzung haben und zu falsch erniedrigten Extinktionswerten führen. Unzureichendes Waschen (z.B. weniger als 3 Waschzyklen, zu geringe Waschpuffervolumina oder zu geringe Einwirkzeiten) kann zu falsch erhöhten Extinktionswerten führen.
Konjugat-Inkubation: (2. Schritt)
Jeweils 100 µl Enzymkonjugat (Peroxidase-markiertes Anti-Human-IgG) in die Reagenzgefäße pipettieren. 30 Minuten bei Raumtemperatur (+18 °C bis +25 °C) inkubieren.
Waschen:
Reagenzgefäße entleeren. Waschen wie oben.
Substrat-Inkubation: (3. Schritt)
Jeweils 100 µl Chromogen/Substrat-Lösung in die Reagenzgefäße pipettieren. 15 Minuten bei Raumtemperatur (+18 °C bis +25 °C) inkubieren (vor direkter Sonneneinstrahlung schützen).
Stoppen:
Jeweils 100 µl Stopplösung in die Reagenzgefäße pipettieren, in der gleichen Reihenfolge und mit der gleichen Geschwindigkeit, wie bei der Zugabe der Chromogen/Substrat-Lösung.
Messen:
Die photometrische Auswertung der Farbintensität sollte innerhalb von 30 Minuten nach dem Stoppen erfolgen, bei 450 nm Messwellenlänge und einer Referenzwellenlänge zwischen 620 nm und 650 nm. Vor dem Messen die Mikrotiterplatte vorsichtig schütteln, um eine homogene Verteilung der Farblösung zu gewährleisten.
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Testdurchführung mit vollautomatischen Analysegeräten Die Probenverdünnung und anschließende Testabarbeitung erfolgen vollautomatisch mit dem Analysegerät. Die in der jeweiligen von EUROIMMUN autorisierten Software hinterlegten Inkubationsbedingungen können geringfügig von den Angaben der ELISA-Testanleitung abweichen, sind jedoch in der Kombination EUROIMMUN Analyzer und dem vorliegenden EUROIMMUN-ELISA validiert worden. Eine Validierungsdokumentation ist auf Anfrage erhältlich. Eine Automatisierung auf weiteren offenen, vollautomatischen Analysegeräten ist möglich, die Kombination muss jedoch vom Anwender validiert sein. 3
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EUROIMMUN
Pipettierschema 1
2
3
4
A
K2
P 6
P 14
B
pos.
P 7
C
neg.
D
5
6
7
8
9
10
P 22
K1
P 4
P 12
P 20
P 15
P 23
K2
P 5
P 13
P 21
P 8
P 16
P 24
K3
P 6
P 14
P 22
P 1
P 9
P 17
pos.
P 7
P 15
P 23
E
P 2
P 10
P 18
neg.
P 8
P 16
P 24
F
P 3
P 11
P 19
P 1
P 9
P 17
G
P 4
P 12
P 20
P 2
P 10
P 18
H
P 5
P 13
P 21
P 3
P 11
P 19
11
12
Das für die Mikrotiterstreifen 1-4 angegebene Pipettierschema gilt beispielhaft für die semiquantitative Analyse von 24 Patientenproben (P 1 bis P 24). Das für die Mikrotiterstreifen 7-10 angegebene Pipettierschema gilt beispielhaft für die quantitative Analyse von 24 Patientenproben (P 1 bis P 24). Kalibratoren (K 1 bis K 3), positive (pos.) und negative (neg.) Kontrolle, sowie Patientenproben werden jeweils in Einzelbestimmung eingesetzt. Die Zuverlässigkeit der Bestimmung kann noch gesteigert werden, wenn man jede Probe doppelt einsetzt. Die Reagenzgefäße können von jedem Mikrotiterstreifen einzeln abgebrochen werden: Man kann die Zahl der eingesetzten Testsubstrate mit der Zahl der zu untersuchenden Proben in Einklang bringen, und es werden keine Reagenzien vergeudet. Die positive und die negative Kontrolle dienen als interne Prüfung für die Zuverlässigkeit des Testverlaufs. Sie sollten bei jedem Testdurchlauf verwendet werden.
Testauswertung Semiquantitativ: Die Berechnung einer Ratio, bei der die Extinktionswerte der Kontrollen bzw. Patientenproben in Bezug zum Extinktionswert des Kalibrators 2 gesetzt werden, erlaubt eine semiquantitative Abschätzung der Ergebnisse. Folgende Formel dient zur Berechnung der Ratio: Extinktion der Kontrolle bzw. Patientenprobe = Ratio Extinktion des Kalibrators 2 EUROIMMUN schlägt folgende Befundinterpretation vor: Ratio 200 RE/ml“ anzugeben. Es empfiehlt sich, diese Probe in einem neuen Testansatz mit einer Verdünnung von z.B. 1:800 wiederholt zu messen. Das aus der Standardkurve ermittelte Ergebnis in RE/ml muss entsprechend diesem Beispiel dann noch mit dem Verdünnungsfaktor 4 multipliziert werden. Der von EUROIMMUN empfohlene obere Grenzwert des Normalbereichs (Cut-off) beträgt 25 Relative Einheiten (RE)/ml. EUROIMMUN schlägt folgende Befundinterpretation vor: negativ positiv
0,95. Der Anti-Gliadin (GAF-3X)-ELISA (IgG) ist mindestens im untersuchten Konzentrationsbereich (10 RE/ml bis 183 RE/ml) linear. Nachweisempfindlichkeit: Die untere Nachweisgrenze ist definiert als der Mittelwert einer analytfreien Probe plus der dreifachen Standardabweichung und gibt den geringsten eindeutig erfassbaren Antikörpertiter an. Die untere Nachweisgrenze des Anti-Gliadin (GAF-3X)-ELISA (IgG) liegt bei 0,3 RE/ml. Kreuzreaktivität: Der vorliegende ELISA weist spezifisch die gegen Gliadin (GAF-3X) gerichteten Autoantikörper der Klasse IgG nach. Bei der Untersuchung von Patientenseren mit Antikörpern gegen Becherzellen, Pankreas und Saccharomyces-cerevisiae wurden keine Kreuzreaktionen festgestellt. Interferenzen: Hämolytische, lipämische und ikterische Proben ergaben bis zu einer Konzentration von 10 mg/ml für Hämoglobin, von 20 mg/ml für Triglyceride und von 0,4 mg/ml für Bilirubin keine Interferenzen im vorliegenden ELISA. Reproduzierbarkeit: Zur Kontrolle der Reproduzierbarkeit wurden die Intra- und Inter-Assay-Variationskoeffizienten mit 4 Seren in verschiedenen Bereichen der Standardkurve ermittelt. Den Intra-AssayVariationskoeffizienten liegen jeweils 20 Bestimmungen, den Inter-Assay-Variationskoeffizienten jeweils 4 Bestimmungen an 6 verschiedenen Testansätzen zugrunde. Intra-Assay-Variation, n = 20 Serum Mittelwert VK (RE/ml) (%) 1 41 6,4 2 60 4,5 3 104 5,9 4 176 4,4
Inter-Assay-Variation, n = 4 x 6 Serum Mittelwert VK (RE/ml) (%) 1 42 11,4 2 61 4,6 3 104 5,3 4 174 4,1
Klinische Sensitivität und Spezifität: Die klinische Sensitivität des Anti-Gliadin (GAF-3X)-ELISA (IgG) wurde anhand der Seren von Patienten mit Zöliakie und Dermatitis Herpetiformis Duhring ermittelt und belief sich auf 87,7 %, bei einer Spezifität von 97,9 % (Seren von Patienten mit Gastroenteropathien, chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen, Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises und Autoimmundermatosen). Kollektiv Zöliakie (0-18 Jahre, bioptisch gesichert) Zöliakie (1-54 Jahre, bioptisch gesichert) Dermatitis Herpetiformis Duhring Sensitivität Gastroenteropathien, bioptisch negativ für Zöliakie Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen, bioptisch negativ für Zöliakie Rheumatoide Arthritis Sjögren Syndrom Systemischer Lupus erythematodes Progressive Systemsklerose Bullöses Pemphigoid Lineare IgA-Dermatose Spezifität
n 183 58 36 277 243 55
Gliadin (GAF-3X)-positiv (IgG) 160 (87,4 %) 55 (94,8 %) 28 (77,8 %) 87,7 % 7 (2,9 %) 0 (0,0 %)
300 200 150 126 30 22 1126
3 (1,0 %) 4 (2,0 %) 7 (4,7 %) 3 (2,4 %) 0 (0,0 %) 0 (0,0 %) 97,9 %
Eine ROC-Analyse (AUC-Wert 0,987) der Ergebnisse der in der Tabelle genannten 183 ZöliakiePatienten sowie der 298 Kontrollproben (Patienten mit Gastroenteropathien und chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen) ergab folgende Kenndaten:
6
EUROIMMUN Cut-Off 15,1 RE/ml 33,3 RE/ml
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Spezifität 95 % 98 %
Sensitivität 96 % 84 %
Referenzbereich: Die Spiegel der Gliadin (GAF-3X)-Antikörper (IgG) wurden bei 400 gesunden Blutspendern im Alter von 18-68 Jahren (176 Frauen, 224 Männer) mit diesem Euroimmun-ELISA ermittelt. Die mittlere Konzentration der Antikörper gegen Gliadin (GAF-3X) betrug 3,4 RE/ml und umfasste einen Bereich von 0,2 RE/ml bis 94,4 RE/ml. Bei einem Cut-off von 25 RE/ml waren 98,0 % der Blutspender anti-Gliadin (GAF-3X)-negativ (IgG). Cut-Off 13,8 RE/ml 24,5 RE/ml
Perzentil 95. 98.
Klinische Bedeutung Die hochsensitiven Tests Anti-Gliadin (GAF-3X)-ELISA und EUROPLUS Anti-Gliadin (GAF-3X)-IIFT dienen der Bestimmung der Zöliakie-relevanten Fraktion der Gliadin-Antikörper (Z-AGA) in der serologischen Diagnostik der Gluten-sensitiven Enteropathie (Zöliakie, einheimische Sprue) und der Dermatitis herpetiformis Duhring (DHD) [1, 2, 3, 4]. Zöliakie ist eine Autoimmunerkrankung, die bei disponierten Personen als Reaktion auf eine Gluten-Überempfindlichkeit auftritt [5, 6]. Wie wir heute wissen, wird Gliadin nach der Resorption in der Lamina propria der Darmmukosa durch die GewebsTransglutaminase (tTG) deamidiert, wobei bestimmte Glutamin-Residuen durch GlutaminsäureResiduen ersetzt werden. Bruchstücke (Peptide) des derart modifizierten (umgebauten) Gliadins binden sich bei genetischer Veranlagung an z.B. HLA-DQ2/8-Moleküle der antigenpräsentierenden Zellen und werden so den Helfer-T-Zellen dargeboten [5]. Auf diese Weise kommt eine umfassende Immunreaktion in Gang und zieht pathologische Gewebsveränderungen nach sich, vor allem in Form von Dünndarmschädigungen. Bestandteile dieser Immunantwort sind Antikörper gegen Endomysium/tTG, und gegen das durch die tTG erzeugte deamidierte Gliadin [6, 7, 8, 9]. Antikörper gegen Endomysium sind anscheinend identisch mit den von Seah 1971 entdeckten Antikörpern gegen Retikulin [10, 11]. Sie erkennen tTG als Zielantigen [6]. Die Häufigkeit nachgewiesener Erkrankungen liegt bei ca. 1:300 in West-Irland, in Italien, in den USA, im Mittleren Osten, in Indien und in Kuba sowie bei ca. 1:1000 in Deutschland und Österreich und bei ca. 1:2000 bis 1:4500 in anderen europäischen Ländern [7, 9, 12]. Gluten ist ein Klebereiweiß, das in verschiedenen Getreidearten vorkommt (z. B. Weizen, Gerste, Roggen). Es besteht aus einem Gemisch von Proteinen, die in zwei Gruppen unterteilt werden können: die Prolamine und die Gluteline, wobei Gliadin das häufigste Prolamin darstellt [7, 8, 9, 13]. Verzehren Zöliakie-Patienten Gluten-haltige Nahrungsmittel, so kommt es in letzter Konsequenz zu einer Schädigung der Dünndarmschleimhaut mit flacher, mosaikartiger Oberfläche ohne Zottenstrukturen und mit einsehbaren Krypteneingängen [5, 6, 14]. Hieraus resultieren funktionelle Störungen [6, 7, 8, 9]. In der Marsh Klassifizierung wird der intestinale histopathologische Schweregrad der Erkrankung in 3 Stufen eingeteilt: Marsh-Typ I: Marsh-Typ II: Marsh-Typ III:
Vermehrung intraepithelialer Lymphozyten (> 40 IEL/100 Epithelzellen) bei normaler Schleimhautarchitektur zusätzliche Kryptenhyperplasie bei noch normalen Zotten IEL-Vermehrung, Kryptenhyperplasie, Degeneration von Epithelzellen und Zottenverplumpung. Typ III wird weiter unterteilt in Marsh IIIA (partielle Zottenatrophie), Marsh IIIB (subtotale Zottenatrophie) und Marsh IIIC (totale Zottenatrophie) [12].
Das klinische Erscheinungsbild umfasst Müdigkeit (78%), Borborygmus (72%), Leibschmerzen (64%), Diarrhoe (56%), Auswirkungen der Malabsorption (44%) mit Gewichtsverlust, Anämie und Wachstumsretardierung bei Kindern, Erbrechen (16%), Verstopfung (12%) und Knochenschmerzen (12%) [14, 15, 16]. 7
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Bei einigen Patienten mit Gluten-sensitiver Enteropathie besteht zusätzlich eine Dermatitis herpetiformis Duhring (10%), eine chronische, mit Blasenbildung einhergehende Hauterkrankung [9]. Bei prolongierter Erkrankung, vorwiegend bei Erwachsenen, besteht ein Malignomrisiko von ca. 10%, insbesondere für ein intestinales T-Zell-Lymphom [7, 8, 9, 17, 18, 19]. Wenn neben der Zöliakie weitere Autoimmunerkrankungen vorliegen, kann sich in ca. 60% der Fälle eine Milzunterfunktion entwickeln, unabhängig von der Dauer der Gluten-freien Diät. Bei schweren Verlaufsformen der Zöliakie erhöht sich die Prävalenz auf 80%. Für die Milzunterfunktion als Begleiterkrankung wird ein Mangel an IgM-Memory-B-Lymphozyten verantwortlich gemacht, welche vor Bakterien, insbesondere den bekapselten (z.B. Streptococcus pneumoniae), schützen [20]. Bei unkomplizierter Zöliakie und bei Zöliakie ohne weitere Autoimmunerkrankung liegt die Wahrscheinlichkeit, eine Milzunterfunktion zu entwickeln, bei ca. 20% [19, 20]. Bei Patienten mit Gluten-Ataxie (progressive cerebellare Gangstörung mit generalisierter muskulärer Dysbalance und Verlust der Tiefensensibilität) konnten Antikörper gegen Gliadin sowohl im Darm als auch im Gehirn nachgewiesen werden, was die Annahme stützt, dass die Gluten-Ataxie immungesteuert ist und zu derselben Gruppe von Erkrankungen wie Zöliakie und Dermatitis herpetiformis gehören könnte [12, 20, 21]. Bei Frauen mit mehrmaligem Fetusverlust während des jeweils ersten Schwangerschaftstrimesters hat sich gezeigt, dass in ca. 5% der Fälle ein ursächlicher Zusammenhang besteht mit einer subklinischen Form der Zöliakie. Da der Fetusverlust möglicherweise durch eine Gluten-freie Diät vermieden werden kann, ist für diese Klientel ein serologischer Suchtest besonders wichtig, zumal die Erkrankung bislang nur bei 10% der Betroffenen diagnostiziert wird [7, 8, 9, 15, 22, 23]. Die HLA-Antigene spielen bei Zöliakie und Dermatitis herpetiformis Duhring eine entscheidende Rolle, wobei regional unterschiedliche Häufigkeit und unterschiedliche Kombinationen der Gene zu verzeichnen sind. Die HLA-DQ2 und HLA-DQ8 kodierenden Gene machen ca. 40% des genetischen Einflusses aus [5, 7, 8, 21]. Einen wesentlichen Beitrag zur Diagnose der Gluten-sensitiven Enteropathie und der Dermatitis herpetiformis Duhring liefert die Untersuchung von Antikörpern (IgA und IgG), und zwar gegen Endomysium mittels IIFT, gegen Gliadin und tTG mittels ELISA sowie zusätzlich durch die Bestimmung der Zöliakie-relevanten Fraktion der Gliadin-Antikörper (Z-AGA) mittels neuer hochspezifischer Tests wie Anti-Gliadin (GAF-3X)-ELISA und EUROPLUS Anti-Gliadin (GAF-3X)-IIFT [10, 11, 14, 23, 24,25). Die Serum-Diagnostik mittels IIFT und/oder ELISA sichert die klinische Diagnose ab. Sie ist auch bei Verwandten von Zöliakie-Patienten angezeigt, um eine Disposition für die Erkrankung aufzudecken [7, 8, 9, 26, 27, 28, 29]. Die Bestimmung der Antikörper gegen Gliadin eignet sich darüber hinaus zur Verlaufskontrolle und zur Überwachung einer Gluten-freien Diät oder eines Gluten-Belastungstests [9]. Ein charakteristisches Absinken bzw. Ansteigen der Antikörpertiter gegen Gliadin kann dem Patienten eine zusätzliche Dünndarmspiegelung ersparen [3, 4, 22]. Die Prävalenz spezifischer Antikörper bei Zöliakie-Kindern unter Gluten-freier Diät hängt von der tatsächlichen Einhaltung der Diät ab und liegt laut Literaturangaben bei ungefähr 15 % - 30 % [23, 30]. Unter Gluten-Belastung kommt es im Falle eines Rezidivs innerhalb weniger Tage zu einem Anstieg der IgA- und IgG-Antikörper gegen Gliadin [9]. Während der akuten Krankheitsphase der Gluten-sensitiven Enteropathie sind fast immer Antikörper der Klasse IgA gegen Endomysium/tTG und/oder Gliadin nachweisbar [31, 32]. IgA-negative ZöliakiePatienten zeigen eine höhere Inzidenz von latenten Verlaufsformen (ca. 13%), von rezidivierenden Infektionen (ca. 30%) und von atopischen Erkrankungen (ca. 13%) als IgA-positive Patienten [16, 22, 33]. Des Weiteren ist auffällig, dass bei selektivem Mangel an IgA-Antikörpern gegen Gliadin in fast 100% der Fälle die Anti-Gliadin-IgG-Spiegel sehr hoch ausfallen [16]. IgM-Antikörper gegen Gliadin sind gelegentlich nachweisbar, in der Regel aber nur, wenn gleichzeitig auch Antikörper gegen Gliadin der Klassen IgA und IgG vorliegen [30]. Das Anti-Gliadin-IgM spielt somit diagnostisch kaum eine Rolle [17]. Die serologische Bestimmung von Z-AGA (IgG und IgA) ist eine hochsensible, preisgünstige und patientenfreundliche Methode zur Diagnose von Zöliakie und Dermatitis herpetiformis Duhring [34, 35]. 8
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Sie kann auch diagnostische Hinweise liefern auf immunologische Assoziationen zwischen bestimmten Autoimmunerkrankungen (Rheumatoide Arthritis, Sjögren-Syndrom, Systemischer Lupus erythematodes, Progressive Systemsklerose, Bullöses Pemphigoid) und Zöliakie [26, 27, 28, 29, 36, 37, 38, 39]. Einen diagnostischen Beitrag können diese Untersuchungen auch bei Zöliakie mit Milzunterfunktion, bei subklinischer Zöliakie bei Frauen mit mehrmaligem Fetus-Verlust im ersten Schwangerschaftstrimester und bei der Gluten-Ataxie liefern [1, 2, 3, 4, 12, 15, 18]. Des Weiteren sollten folgende Risikogruppen untersucht werden: Personen - mit atypischen Symptomen (z.B. Infertilität, Osteoporose) - mit Zöliakie-assoziierten HLA-assoziierten Erkrankungen (z.B. Diabetes mellitus Typ 1, Autoimmun-Hepatitis, Primär-biliäre Leberzirrhose) - mit Zöliakie-assoziierten genetischen Erkrankungen (z.B. IgA-Mangel, Down Syndrom) sowie Verwandte 1. Grades von Zöliakie-Patienten. Im Verlauf einer Therapie mit Gluten-freier Diät fallen die IgA-Antikörper gegen Gliadin schneller und gegen Endomysium langsamer innerhalb weniger Monate auf niedrige Werte ab [22]. Permanent hohe IgA-Gliadin-Antikörperspiegel sprechen dafür, dass eine Gluten-freie Diät nicht eingehalten wird [40, 41, 42]. Lassen sich bei scheinbar gesunden Säuglingen und Kleinkindern mit Gluten in der Nahrung IgAAntikörper gegen Gliadin nachweisen, sollte nach drei Monaten der IgA-Antikörper-Titer kontrolliert werden. Lassen sich bei Verdacht auf eine Gluten-sensitive Enteropathie keine IgA-Antikörper gegen Endomysium oder Gliadin im Serum nachweisen, sollte die Möglichkeit eines IgA-Mangels berücksichtigt und das Gesamt-IgA bestimmt werden [22, 40, 43]. In den meisten Studien werden IgA-spezifische Tests zur Bestimmung von Antikörpern gegen Endomysium/tTG als hochsensitiv und hochspezifisch mit jeweils über 95 % bei beiden Parametern beschrieben [4, 18, 34, 42, 44]. Sie zeigen unter den herkömmlichen Testmethoden die besten Ergebnisse, sowohl bei Erwachsenen als auch bei Kindern [5, 32]. Proben aus der italienischen und belgischen Bevölkerung zeigen, dass über 95 % der Patienten mit unbehandelter Zöliakie IgAspezifische Antikörper gegen Endomysium aufweisen [41, 43, 45]. Durch die Neuentwicklung eines modernen „Designer-Antigens“, aus dem die immunologisch reaktive Oberfläche geschaffen wird, konnte die Spezifität des Anti-Gliadin (GAF-3X)-ELISA und des EUROPLUS Anti-Gliadin (GAF-3X)-IIFT auf nahezu 100% gesteigert werden [35]. Es handelt sich hierbei um ein rekombinantes „Gliadin-analoges Fusionspeptid“, das nahezu ausschließlich bei Patienten mit Zöliakie und DHD eine positive Reaktion zeigt, nicht aber bei Gesunden oder Patienten mit anderen gastrointestinalen Erkrankungen [4, 46]. Das Fusionspeptid besteht aus zwei Komponenten: Einem deamidierten Epitop des Gliadins, bestehend aus neun Aminosäuren, und einem künstlichen, Gliadin-homologen Oktapeptid [3, 4, 35]. Für die Bestimmung der Antikörper gegen Gliadin wurde bisher das natürliche Voll-Längen-Gliadin als Zielantigen verwendet. Neue wissenschaftliche Erkenntnisse belegen aber, dass nur ein Zehntel des Gliadinmoleküls für die Zöliakie pathophysiologisch und diagnostisch relevant ist. Gegen diese Molekülabschnitte werden ausschließlich von Zöliakie-Patienten Antikörper gebildet, nicht aber von gesunden Menschen. Die restlichen 90% des Gliadins stellen für die Diagnostik nur immunologischen Ballast dar, der überwiegend ein Ziel unspezifischer Reaktionen abgibt. Auf diesen Anteil wird in modernen Testsystemen (Bestimmung von Z-AGA) verzichtet, woraus sich ein enormer Zuwachs an Spezifität ergibt [2, 19, 30, 46, 47]. Die Bestimmung der IgG-Antikörper gegen Voll-Gliadin mit herkömmlichen Tests ist für die Diagnose der Zöliakie nutzlos, da ein Viertel der Normalbevölkerung hier positiv reagiert. Beim IgA-AntikörperNachweis mit diesen Tests zeigte sich, dass IgA unspezifisch war und Patienten mit selektivem IgAMangel durch das Raster fielen - eine Disposition, die überdurchschnittlich häufig mit der Zöliakie assoziiert ist. Bei der Z-AGA-Bestimmung (mittels hoch spezifischem Anti-Gliadin (GAF-3X)-ELISA bzw. hoch spezifischem EUROPLUS Anti-Gliadin (GAF-3X)-IIFT) reicht es in der Regel aus, nur die Immunglobulinklasse IgG zu untersuchen, da man hiermit die Erkrankung auch bei Patienten mit IgAMangel erfasst. Für eine sichere, umfassende Diagnose, also auch zur Identifikation von IgA-MangelPatienten, wird empfohlen, beide Antikörperklassen, Z-AGA-IgG und -IgA, zu bestimmen [1, 2, 3, 4, 25, 35, 41, 48, 49, 50, 51]. 9
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In einem Zöliakie-Kollektiv von Prause et al. (10th Workshop on Autoantibodies and Autoimmunity, Guadalajara, Mexico, 2008) zeigte der Anti-Gliadin (GAF-3X)-ELISA eine Sensitivität von 83% (IgA) bzw. 95% (IgG) jeweils bei 95% Spezifität (herkömmlicher Anti-Gliadin-ELISA: 54% für IgA und 31% für IgG). In einer Gruppe von Patienten mit Dermatitis herpetiformis Duhring erzielte der Test eine Sensitivität von 83% (IgA) bzw. 78% (IgG) und war damit fast 30% empfindlicher als ein herkömmlicher Anti-GliadinELISA (Sensitivität IgA: 55%, IgG: 50%) [5, 19, 25, 35, 41]. Die serologische Bestimmung der Z-AGA sowie der Antikörper gegen Endomysium/tTG (IgG, IgA) ist eine preisgünstige und patientenfreundliche Methode zur Diagnose von Zöliakie und Dermatitis herpetiformis Duhring, von Zöliakie mit Milzunterfunktion und subklinischer Zöliakie bei Frauen mit mehrmaligem Fetus-Verlust im jeweils ersten Schwangerschaftstrimester sowie zur Abklärung einer Gluten-Ataxie [11, 19, 24, 45, 50, 51, 52, 53].
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